우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
1 차적인 성인 섬유아세포는 모든 바디 조직에 있는 섬유증, 섬유아세포 상호 작용 및 염증을 공부하는 중요한 공구가 되었습니다. 1 차적인 섬유아세포는 myofibroblast 분화 또는 노화 유도 때문에 무기한 으로 분할할 수 없기 때문에, 새로운 문화는 정규로 설치되어야 합니다. 그러나 신뢰할 수있는 절연 프로토콜 및 1 차 섬유 아세포 격리 자체를 개발하는 과정에서 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다 : 방법의 난이도 (특히 초보자) 및 박테리아 오염의 위험, 1 차적인 섬유아세포가 실험, 및 후속 세포 질 및 생존을 위해 사용될 수 있을 때까지 필요한 시간. 본 연구에서는, 효소 소화 및 초음파 동요를 결합하는 마우스 심장, 폐, 간 및 신장으로부터 원발성 성인 섬유아세포를 분리하고 배양하는 빠르고 안정적이며 배우기 쉬운 프로토콜이 제공된다.
서론
섬유아세포는 여러 개의 성화 과정과 광범위한 거친 파구체 망상1,2를가진 평평한 스핀들 모양의 세포이다. 평균 섬유아세포는 30-100 μm을 측정하고 수명은57±3일 1,3. 인간 섬유아세포의 평균 세포 주기 지속 기간은 배양 조건에 따라 16-48h범위이다 4. 배양된 1차 섬유아세포의 복제 능력과 기능적 질이 기증자 연령과 부정적으로 상관된다는 증거가 있으며, 가능한 경우5,6을 통해 젊은 기증자(동물 또는 환자)를 선호해야 한다는 것을 시사합니다. .
섬유아세포는 대부분의 포유류 신체 조직의 우세한 세포 유형을 구성합니다. 그들의 유비쿼터스 존재에도 불구하고, 섬유아세포의 분자식별은 여전히 도전 7입니다. 섬유아세포는 배아 발달 동안 다른 근원에서 조직및 기관 개발로 이동8 . 이러한 이유로, 섬유....
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프로토콜
다음 프로토콜은 독일 드레스덴 테크니쉬 Universität 드레스덴의 제도적 동물 관리 지침 (파일 번호 : T 2014/4)뿐만 아니라 국제적으로 인정 된 동물 관리 지침 (FELASA)17을따릅니다. 그림 1은 셀 격리 프로세스를 시각화합니다.
1. 설정, 재료 및 미디어 준비
- 세포 배양 배지, PBS 용액, 콜라게나아제 블렌드 스톡 용액(12 mL의 멸균 된 초퓨어 워터에서 50 mg의 콜리오제 콜라게나아제 블렌드를 재구성) 및 0.25% 트립신 용액을 준비합니다.
- 배지, PBS 및 트립신 용액을 37°C로 예열한다.
- 초음파 수조를 37 °C로 예열하십시오.
- 집게, 스테인레스 스틸 주걱, 메스 (장기 당 2 x 메스) 및 70 % 에탄올로 2 유리 비커를 소독하고 세포 배양 후드 아래에 이 물질을 놓습니다.
- 비커 한 개를 70% 에탄올로 채우고 다른 비커를 멸균수 또는 PBS 용액으로 채웁니다. 이 비커는 각 장기 행렬 후에 악기를 소독하고 세척하는 데 필요합니다.
- 젖은 얼음에 차가운 PBS가 들어있는 멸균 15 mL 플라스틱 튜브를 ....
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결과
고체 뮤린 조직으로부터 성인 섬유아세포를 분리하는 이 프로토콜의 능력이 입증되었다. 생존 가능한 섬유아세포는 면역형광 염색 또는 증식 실험과 같은 후속 실험에 사용될 수 있는 것을 수득하였다(도2D-F, 도 5A).
성체 섬유아세포는 일반적으로 단층12,18에서성장하는 다중 세포 프로세스를 가진 편평한 스핀들 모양 세포입니다. 얻어진 결과는 이 형태학적 특징을 반영하고 다른 기관에서 섬유아세포 인구에 있는 명백한 형태학적 인 다름을 표시합니다(그림2). 신장 섬유아세포는 심장, 폐 또는 간 섬유아세포보다 더 작고 높은 밀도에서 자랐다(그림 2).
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토론
불멸의 섬유아세포주와 비교하여, 1차 섬유아세포는 몇 가지 장점을 제공한다. 그들은 높은 품질과 수량에서 비용 효율적으로 격리 될 수있다. 게다가, 1 차적인 배양은 다중 개별에게서 세포를 공부하는 가능성을 제안합니다, 얻어진 결과의 신뢰성을 증가시키고 단지 세포 배양 유물을 공부의 가능성을 감소시킵니다. 새로운 1 차 적인 배양물의 연속적인 생성은 일반적으로 통과하는 반복한 후에 생기는 유전 변경을 방지합니다21. 또한, 세포 노화율22,23 또는 증가된 근섬유아세포 분화는 높은 대구(20)에서 배양물에서 더 빈번히 발생한다. 낮은 대구(2-3)에서, 기저 근섬유아세포 수는 약 20-30%(데이터가 도시되지 않음)였고, 단지 2.89%의 세포만이 β-갈락토시다아제 발현에 기초하여 노화로 간주되었다(도5.......
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공개 사항
선언할 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
로미 켐프 부부와 아넷 오피츠 부인에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 IT 지원에 대한 씨 Bjoern Binnewerg 감사합니다. 이 작품은 a) Förderkreis 드레스드너 헤르츠 - Treislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für 프라우엔", 의학 학부 칼 구스타프 카루스 드레스덴과 c) 엘스 크뢰너 - 포르스충스콜레그 (EKFK) 칼 의학부에서 보조금에 의해 지원되었다 카루스 드레스덴. 우리는 자금과 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, 미국 | T4049-100ML | |
| 항생제 | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL) |
| 세포 배양 후드 | Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬 | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬 | 50049176 | BBD 6220 |
| 세포 배양 플레이트 | Thermo Fisher Scientific, 월섬, 미국 Depends | on vessel | 6-, 12-, 24-well Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC 전문 흡입 |
| 셀 스트레이너 (메쉬) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µ m 나일론 |
| 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| 무선 피펫팅 컨트롤러 | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| 일회용 피펫 팁 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 용량에 따라 다름 | 피펫용 SafeSeal 팁(10 µ L, 20 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L) |
| 일회용 플라스틱 피펫 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 용량에 따라 다름 | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| 일회용 멸균 메스 | Myco Medical, Cary, USA | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 볼륨 | 50 &마이크로에 따라 다릅니다. L, 500 &마이크로; L, 1.500&마이크로; L, 2.000 &마이크로; L |
| 태아 송아지 혈청 (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| 콜라겐 분해 효소 블렌드 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| 노화 검출 키트 | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a.MS2 | Minishaker (후속 모델: Ident-Nr.: 0020016017) |
| 멸균 플라스틱 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tube (15 mL, 50 mL) |
| 초음파 수조 | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| 수술용 가위 (비외상성) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| 수술용 가위 | Aesculap AG, 투틀링겐, 독일 | eq 1060.09 | |
| 외과용 겸자 | Aesculap AG, 투틀링겐, 독일 | BD577 |
참고문헌
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology.
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재인쇄 및 허가
