우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
1 차적인 성인 섬유아세포는 모든 바디 조직에 있는 섬유증, 섬유아세포 상호 작용 및 염증을 공부하는 중요한 공구가 되었습니다. 1 차적인 섬유아세포는 myofibroblast 분화 또는 노화 유도 때문에 무기한 으로 분할할 수 없기 때문에, 새로운 문화는 정규로 설치되어야 합니다. 그러나 신뢰할 수있는 절연 프로토콜 및 1 차 섬유 아세포 격리 자체를 개발하는 과정에서 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다 : 방법의 난이도 (특히 초보자) 및 박테리아 오염의 위험, 1 차적인 섬유아세포가 실험, 및 후속 세포 질 및 생존을 위해 사용될 수 있을 때까지 필요한 시간. 본 연구에서는, 효소 소화 및 초음파 동요를 결합하는 마우스 심장, 폐, 간 및 신장으로부터 원발성 성인 섬유아세포를 분리하고 배양하는 빠르고 안정적이며 배우기 쉬운 프로토콜이 제공된다.
서론
섬유아세포는 여러 개의 성화 과정과 광범위한 거친 파구체 망상1,2를가진 평평한 스핀들 모양의 세포이다. 평균 섬유아세포는 30-100 μm을 측정하고 수명은57±3일 1,3. 인간 섬유아세포의 평균 세포 주기 지속 기간은 배양 조건에 따라 16-48h범위이다 4. 배양된 1차 섬유아세포의 복제 능력과 기능적 질이 기증자 연령과 부정적으로 상관된다는 증거가 있으며, 가능한 경우5,6을 통해 젊은 기증자(동물 또는 환자)를 선호해야 한다는 것을 시사합니다. .
섬유아세포는 대부분의 포유류 신체 조직의 우세한 세포 유형을 구성합니다. 그들의 유비쿼터스 존재에도 불구하고, 섬유아세포의 분자식별은 여전히 도전 7입니다. 섬유아세포는 배아 발달 동안 다른 근원에서 조직및 기관 개발로 이동8 . 이러한 이유로, 섬유아세포에서 찾아질 수 있는 마커 단백질의 과다가 있는 반면, 모든 섬유아세포 집단에서 존재하고 섬유아세포에 대한 독점적인 유일한 마커 단백질은 아직도 누락됩니다. 따라서, 몇몇 인식된 마커의 발현 패턴은 일반적으로 섬유아세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 가장 인식되는 마커 중에는 비멘틴, 인간 섬유아세포 표면 단백질(hFSP), 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2) 및 알파 평활근 액틴(αSMA)이 있다.
섬유아세포는 주요 세포외 기질(ECM) 생산 세포 유형입니다. 이에 따라 섬유아세포는 질서 정연한 조직 구조를유지하고 인접한 세포에 대한 기계적 지지를 제공한다 1. ECM 합성과 분해 사이의 균형은 잘 조절 된 과정입니다. 합성으로 이동 하는 과도 한 ECM 증착의 시작을 표시 하는, 종료 하지 않을 경우, 섬유증에 이르게. 섬유증은 분자 및 현상형 변경을 겪고 있는 활성화된 섬유아세포에서 유래한 근섬유아세포에 의해 중재됩니다. 근섬유아세포의 한 가지 특징은 ECM 및 사이토카인의 분비 및 질서 정연하게 배열된αSMA 마이크로필라멘트의 발현이다 9.
1차 섬유아세포는 섬유증, 조직염증 및 섬유아세포-암-세포 상호작용10,11에초점을 맞춘 최근 연구의 각광을 받고 있다. 그러나, 건강과 질병에 있는 섬유아세포 특성을 효과적으로 연구하기 위하여는, 실행 가능한 일차 성인 섬유아세포를 정기적으로 격리할 필요가 있습니다. 섬유아세포12,13,14를분리하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 섬유아세포 분리의 세 가지 주요 방법은 조직 덩어리12,효소 조직 소화15,중공 장기9,13,16의효소 관류에서 자라낸다. 자성장의 장점은 효소 세포 분해없이 부드러운 절연 공정이다. 다른 한편으로는, 파생 배양은 일반적으로 세포가 실험을 위해 이용될 수 있을 때까지 연장된 배양 기간을 요구합니다. 일반적인 효소 소화는 빠르지만 조직을 기계적으로 용해시키는 데 필요한 교반 과정에서 다른 세포 유형 (예 : 내피 세포) 또는 박테리아와 오염 될 위험이 있습니다. 또한, 이러한 방법은 종종 정교하고 배울 시간과 기술이 필요합니다.
연구에서 1 차적인 섬유아세포의 중요성에 관하여, 민첩성, 단순성 및 신뢰성의 관점에서 기존 세포 격리 접근을 낙관할 필요가 아직도 있습니다. 여기서, 고품질 세포를 제공하는 새로운 초음파 기반 효소 섬유아세포 분리 방법이 제공된다.
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프로토콜
다음 프로토콜은 독일 드레스덴 테크니쉬 Universität 드레스덴의 제도적 동물 관리 지침 (파일 번호 : T 2014/4)뿐만 아니라 국제적으로 인정 된 동물 관리 지침 (FELASA)17을따릅니다. 그림 1은 셀 격리 프로세스를 시각화합니다.
1. 설정, 재료 및 미디어 준비
- 세포 배양 배지, PBS 용액, 콜라게나아제 블렌드 스톡 용액(12 mL의 멸균 된 초퓨어 워터에서 50 mg의 콜리오제 콜라게나아제 블렌드를 재구성) 및 0.25% 트립신 용액을 준비합니다.
- 배지, PBS 및 트립신 용액을 37°C로 예열한다.
- 초음파 수조를 37 °C로 예열하십시오.
- 집게, 스테인레스 스틸 주걱, 메스 (장기 당 2 x 메스) 및 70 % 에탄올로 2 유리 비커를 소독하고 세포 배양 후드 아래에 이 물질을 놓습니다.
- 비커 한 개를 70% 에탄올로 채우고 다른 비커를 멸균수 또는 PBS 용액으로 채웁니다. 이 비커는 각 장기 행렬 후에 악기를 소독하고 세척하는 데 필요합니다.
- 젖은 얼음에 차가운 PBS가 들어있는 멸균 15 mL 플라스틱 튜브를 놓습니다. 관의 수는 섬유아세포에서 분리하려는 장기의 수에 따라 달라집니다.
2. 마우스 해부 및 장기 제거
- 두 쌍의 장갑을 다른 장갑 위에 착용하면 동물이 해부되는 즉시 첫 번째 쌍을 제거 할 수 있습니다.
참고: 이 절차는 동물의 털과 피부의 박테리아가 장기에 퍼지는 것을 방지합니다. - 마우스를 안락사시키고 (예를 들어, 자궁 경부 탈구) 폴리스티렌 패드에 모든 사지에 바늘로 시체를 고정합니다.
- 70% 에탄올 스프레이를 사용하여 마우스 시체를 소독합니다. 털이 에탄올에 스며들어 머리카락이 소용돌이치지 않도록 하십시오.
- 외과 집게와 외상성 가위를 사용하여 비뇨 생식기 지역 바로 위의 모피를 자른다. 목 (3 - 4cm)에 초기 절개 지점에서 중간 라인을 따라 피부를 잘라 사지에 릴리프 컷을 추가합니다.
주의: 세균 오염을 피하기 위해 이 단계에서 근육층을 천천하지 마십시오! - 복강을 덮는 근육에 최적 접근을 하기 위하여 폴리스티렌 거품 패드에 피부를 고정하십시오.
- 70 % 에탄올을 사용하여 복부 근육을 두 번 소독하십시오. 다음 단계로 계속하기 전에 에탄올을 건조시키십시오.
- 첫 번째 장갑을 제거합니다. 집게와 가위로 의 새로운 멸균 세트를 사용합니다.
- 수술용 가위로 근육층을 절개하여 복강과 흉강을 열어 선택한 장기를 부드럽게 제거합니다. 따라서 수술 용 집게로 장기를 부드럽게 잡고 (장기를 관통하지 말고 최소한의 압력을 사용하십시오) 가위로 기관의 진입점 근처의 혈관을 잘라냅니다.
- 감기 PBS를 포함하는 멸균 튜브에 장기를 넣습니다. 튜브를 단단히 닫습니다. 3.1단계로 계속 될 때까지 튜브를 젖은 얼음 위에 놓습니다.
3. 조직 다진, 소화 및 세포 추출
- 멸균 세포 배양 후드 아래에 튜브를 옮김을 옮김.
주의: 신선한 장갑을 착용하고 70% 에탄올로 튜브를 소독한 후 후드 밑으로 옮기세요! - 멸균 집게를 사용하여 15 mL 튜브에서 장기를 꺼냅니다. 장기를 멸균 된 6cm 페트리 접시의 절반에 놓고 과잉 혈액을 제거하기 위해 PBS로 간략하게 장기를 씻으하십시오. 페트리 접시의 후반부에 장기를 전송, 여분의 PBS를 제거합니다.
- 두 개의 멸균 메스를 사용하여 조직을 다듬습니다. 나머지 조직 단편은 1 - 2mm보다 커서는 안됩니다.
- 다진 조직을 멸균 주걱을 사용하여 새로운 멸균 15 mL 튜브로 옮기고 0.25% 트립신 용액 의 2 mL를 추가합니다. 튜브를 37°C에서 5분 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
- 튜브를 부드럽게 (1400 / 분 경) 10 초 동안 소용돌이.
- 4 mL FCS 함유 세포 배양 배지(덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM), 예를 들어)를 첨가하여 세포 배양 후드 하에서 트립신 반응을 중단한다.
- 심장 이나 폐 조직을 포함 하는 각 튜브에 콜라게 나 아제 혼합 솔루션의 250 μL추가 하 고 신장 또는 간 대 한 100 μL, 각각.
- 튜브를 초음파 수조 (37 °C)에 넣고 초음파 초음파 를 10 분 동안 활성화하십시오.
참고 :이 프로토콜에 사용되는 초음파 수조는 35 kHz의 작동 주파수와 320 W의 최대 전력을 가지고 있습니다. - 튜브를 부드럽게 (1400 / 분경) 10 초 동안 소용돌이.
- 튜브를 다시 초음파 수조에 넣고 10 분 동안 넣습니다.
- 소용돌이 부드럽게 (약 1400/분) 10 s.
- 튜브를 70 % 에탄올로 소독하고 멸균 세포 배양 후드 아래에 옮김하십시오.
- 40 μm 메쉬로 용액을 새로운 멸균 15mL 튜브로 필터링합니다.
- 튜브를 5분 동안 500 x g으로 원심분리합니다.
- 상급체를 제거하고 신선한 매체의 1 mL에 펠릿을 다시 일시 중단.
- 세포를 적합한 세포 배양 용기(예를 들어, 6-웰 플레이트)로 옮기고 용기를 37°C 및 5% CO2에서밤새 세포 배양 인큐베이터내로 놓는다.
- 다음날, 배지를 제거하고 PBS로 3 회 씻은 다음 신선한 배지를 추가하십시오 (추가 된 부피는 선택한 세포 배양 용기에 따라 다르며, 6 웰 플레이트의 웰 당 2 mL).
- 격일로 매체를 변경합니다.
참고 : 섬유 아세포는 90 %의 광학 합류에 도달 한 후 분할 될 수 있습니다 (일반적으로 5-7 일 후).
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결과
고체 뮤린 조직으로부터 성인 섬유아세포를 분리하는 이 프로토콜의 능력이 입증되었다. 생존 가능한 섬유아세포는 면역형광 염색 또는 증식 실험과 같은 후속 실험에 사용될 수 있는 것을 수득하였다(도2D-F, 도 5A).
성체 섬유아세포는 일반적으로 단층12,18에서성장하는 다중 세포 프로세스를 가진 편평한 스핀들 모양 세포입니다. 얻어진 결과는 이 형태학적 특징을 반영하고 다른 기관에서 섬유아세포 인구에 있는 명백한 형태학적 인 다름을 표시합니다(그림2). 신장 섬유아세포는 심장, 폐 또는 간 섬유아세포보다 더 작고 높은 밀도에서 자랐다(그림 2).
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토론
불멸의 섬유아세포주와 비교하여, 1차 섬유아세포는 몇 가지 장점을 제공한다. 그들은 높은 품질과 수량에서 비용 효율적으로 격리 될 수있다. 게다가, 1 차적인 배양은 다중 개별에게서 세포를 공부하는 가능성을 제안합니다, 얻어진 결과의 신뢰성을 증가시키고 단지 세포 배양 유물을 공부의 가능성을 감소시킵니다. 새로운 1 차 적인 배양물의 연속적인 생성은 일반적으로 통과하는 반복한 후에 생기는 유전 변경을 방지합니다21. 또한, 세포 노화율22,23 또는 증가된 근섬유아세포 분화는 높은 대구(20)에서 배양물에서 더 빈번히 발생한다. 낮은 대구(2-3)에서, 기저 근섬유아세포 수는 약 20-30%(데이터가 도시되지 않음)였고, 단지 2.89%의 세포만이 β-갈락토시다아제 발현에 기초하여 노화로 간주되었다(도5...
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공개 사항
선언할 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
로미 켐프 부부와 아넷 오피츠 부인에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 IT 지원에 대한 씨 Bjoern Binnewerg 감사합니다. 이 작품은 a) Förderkreis 드레스드너 헤르츠 - Treislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für 프라우엔", 의학 학부 칼 구스타프 카루스 드레스덴과 c) 엘스 크뢰너 - 포르스충스콜레그 (EKFK) 칼 의학부에서 보조금에 의해 지원되었다 카루스 드레스덴. 우리는 자금과 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, 미국 | T4049-100ML | |
| 항생제 | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL) |
| 세포 배양 후드 | Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬 | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬 | 50049176 | BBD 6220 |
| 세포 배양 플레이트 | Thermo Fisher Scientific, 월섬, 미국 Depends | on vessel | 6-, 12-, 24-well Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC 전문 흡입 |
| 셀 스트레이너 (메쉬) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µ m 나일론 |
| 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| 무선 피펫팅 컨트롤러 | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| 일회용 피펫 팁 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 용량에 따라 다름 | 피펫용 SafeSeal 팁(10 µ L, 20 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L) |
| 일회용 플라스틱 피펫 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 용량에 따라 다름 | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| 일회용 멸균 메스 | Myco Medical, Cary, USA | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 볼륨 | 50 &마이크로에 따라 다릅니다. L, 500 &마이크로; L, 1.500&마이크로; L, 2.000 &마이크로; L |
| 태아 송아지 혈청 (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| 콜라겐 분해 효소 블렌드 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| 노화 검출 키트 | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a.MS2 | Minishaker (후속 모델: Ident-Nr.: 0020016017) |
| 멸균 플라스틱 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tube (15 mL, 50 mL) |
| 초음파 수조 | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| 수술용 가위 (비외상성) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| 수술용 가위 | Aesculap AG, 투틀링겐, 독일 | eq 1060.09 | |
| 외과용 겸자 | Aesculap AG, 투틀링겐, 독일 | BD577 |
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