여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
췌도는 독특한 호르몬 발현 패턴을 가진 내분비 세포로 구성됩니다. 내분비 세포는 정상 및 병리학 적 조건에 대한 응답에서 기능적 차이를 보여줍니다. 이 프로토콜의 목표는 액적 기반 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 각 내분비 세포 유형의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 것입니다. 이러한 데이터는 정상 또는 특정 조건에서 각 내분비 세포 유형의 유전자 발현 프로필을 구축하는 데 활용될 수 있다. 이 공정에는 신중한 취급, 정확한 측정 및 엄격한 품질 관리가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 인간 췌도 해리, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 자세한 단계를 설명합니다. 약 20,000개의 인간 단일 아일렛 세포의 대표적인 결과는 프로토콜의 성공적인 적용을 입증한다.
서론
췌 장 섬 혈액 포도 당 수준을 조절 하는 내 분 비 호르몬을 해제. 기능적으로 그리고 형태학적으로 다른 5개의 내분비 세포 모형은, 이 필수적인 역할에 관여합니다: α 세포는 글루카곤, β 세포 인슐린, δ 세포 소마토스타틴, PP세포 췌장 폴리펩티드 및 θ 세포 그렐린 1을 생성합니다. 유전자 발현 프로파일링은 정상 또는 특정 조건에서 내분비 세포를 특성화하는 유용한 접근법이다. 역사적으로, 전체 아일렛 유전자 발현 프로파일링은 마이크로어레이 및 차세대RNA 시퀀싱 2, 3,4,5,6,7을 사용하여 생성되었다. , 8.전체 아일렛 전사체는 장기 특이적 전사체 및 질병 후보 유전자를 식별하는 데 유익하지만, 각 아일렛 세포 유형의 분자 이질성을 밝히지 못한다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 기술은 섬9....
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프로토콜
1. 인간 섬 해리
- 특정 인구 통계학을 가진 기증자의 작은 섬이 연구 목적을 위해 요구되지 않는 한, 15-80 년 사이, 어느 성의 시체 기관 기증자로부터 고립 된 인간의 섬을 얻을, 기존의 질병없이.
- 격리 후, 분리된 섬을 공급업체에서 2-3일 동안 조직 배양 시설에 보관한다. 종종 아일렛 손상이 보이려면 1 일 이상 걸립니다.
- 작은 섬을 병에 담고 섬 매체에 완전히 담그십시오. 하룻밤 선적에 의해 실험실에 그것을 얻을.
- 섬 공급 업체에서 선적 된 작은 섬의 섬 등가 물량 (IEQ)을 가져옵니다.
- 섬 도착 당일 발송물에서 섬을 회수하십시오. 후드를 사용하여 이 단계를 수행하여 오염 가능성을 최소화합니다.
- 냉장고에서 전체 아일렛 매더(CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x 펜 스트렙, 2mM 글루타민)을 식힙니다.
- 병에서 50 mL 원엽 튜브로 섬을 옮김을 옮김.
- 비어 있는 병에 10 mL 미리 냉각된 완전한 섬 매체를 추가하여 나머지 섬을 씻어내십시오. 미디어를 원유관으로 옮김을 전달합니다.
- 200 x g에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리하여 섬을 복구합니다. 상급체를 흡기하여....
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결과
단세포 RNA 염기서열 분석 워크플로우는 3단계로 구성됩니다: 손상되지 않은 인간 섬을 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 액적 기반 기술을사용하여 단일 세포를 포착하고, RNA-seq 데이터를 분석합니다(그림 1). 첫째, 획득 된 인간 섬은 하룻밤 동안 배양되었다. 온전한 섬을 현미경으로 검사하였다(도2A). 해리된 아일렛 세포의 무결성은 RNA 형광을 사용하여 인지혼화(RNA-FISH)로 검증되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 해리α-β-세포는 각각 GCG 및 INS mRNA 프로브를 사용하여 가시화시켰다.
세포 수 와 생존력은 단일 셀 포획 단계 전에 결정될 필요가.......
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토론
최근 개발된 단세포 기술은 인간 췌도에서 세포 유형을 특성화하고 분자 이질성을 연구하는 새로운 플랫폼을 제공합니다. 우리는 인간 섬을 연구하기 위해 액적 기반 미세 유체 단일 세포 격리 및 데이터 분석 프로토콜을 채택했습니다. 우리의 프로토콜은 서열 품질 및 배치 효과에 상대적으로 작은 변화를 가진 20,000 개 이상의 단일 인간 아일렛 세포에서 RNA 시퀀싱 데이터를 성공적으로 생산했습니다.
특히 고품질 결과를 위해 이 프로토콜에서는 두 단계가 중요합니다. 인간의 섬을 해리 할 때주의가 필요합니다. 섬을 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다. 단일 셀 분할은 성공적인 단일 셀 실험을 위한 또 다른 핵심 단계입니다. 그림3에서 양호하고 품질이 낮은 에멀젼의 예를 보여 주었으며. 명확한 에멀젼은 일반적으로 분할 단계에서 수집되는 셀의 부적당한 수를 나타냅니다.
단리된 1차 인.......
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공개 사항
모든 저자는 Regeneron 제약, Inc.의 직원과 주주입니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 30 &마이크로; m 사전 분리 필터 | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 세포 여과기 |
| 8-챔버 슬라이드 | Chemometec | 102673-680 | Dell 계수 분석 슬라이드 |
| Bioanalyzer 고감도 DNA 키트 | Agilent | 5067-4626 | QC |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A9647 | 단일 세포 매체 |
| 크롬 단일 세포 3' 라이브러리 & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | 용리 버퍼 |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | 에멀젼 플레이트 |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs HIR | Isolated human islets | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library 준비 시약 |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay 시약 |
| SPRISelect 시약 | Fisher Scientific | B23318 | 정제 구슬 |
| 조직 배양 접시 (10cm) | VWR | 10861-594 | 섬 배양 |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | 세포 해리 용액 |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 반응 | VWR | 77001-152 | 라이브러리 클린업 컬럼 |
참고문헌
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes ....
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재인쇄 및 허가
