방법 논문

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

DOI:

10.3791/59873

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2019년 8월 14일

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1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

이 논문에서

요약

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순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

초록

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순환 종양 세포 (CTC) 원발성 종양에서 파생 된 혈 류 또는 림프 계로 창 고. 이 희소한 세포 (혈액의 mL 당 1-10 세포)는 나쁜 예후를 보증하고 몇몇 암에 있는 더 짧은 전반적인 생존과 상관됩니다 (예를 들면, 유방, 전립선 및 colorectal). 현재, 반대로 EpCAM 코팅된 자기 비드 기지를 둔 CTC 포획 시스템은 혈류량에 있는 CTC를 열거하기 위한 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 승인된 금 표준 시험입니다. 이 시험은 상피 암 세포를 특히 표적으로 하는 반대로 EpCAM 마커로 코팅된 자기 구슬의 사용에 근거를 두어. 많은 연구는 EpCAM이 CTC 검출을 위한 최적 마커가 아니라는 것을 설명했습니다. 실제로, CTC는 암세포의 이질적인 하위 집단이고 전이성 증식 및 침략과 관련되었던 상피-중간엽 전이 (EMT)를 겪을 수 있습니다. 이들 CTC는 비멘틴과 같은 중간엽 마커를 증가시키면서 세포 표면 상피 마커 EpCAM의 발현을 감소시킬 수 있다. 이러한 기술적 장애물을 해결하기 위해 CTC의 물리적 특성에 기반한 다른 격리 방법이 개발되었습니다. 미세 유체 기술은 전혈 샘플에서 CTC 농축에 대한 라벨없는 접근 방식을 가능하게합니다. 나선형 미세 유체 기술은 나선형 미세 유체 칩 내에서 생성된 곡선 채널에서 연속적인 흐름을 가진 관성 및 딘 드래그 힘을 사용합니다. 세포는 일반적인 혈액 세포와 종양 세포 사이 크기 그리고 가소성의 차이에 근거하여 분리됩니다. 이 프로토콜은 CC의 프로그래밍된 데스-리간드 1(PD-L1) 발현을 특성화하기 위한 상이한 단계를 상세히 설명하며, 나선형 미세유체 디바이스와 맞춤형 면역형광(IF) 마커 세트를 결합한다.

서론

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종양 항원 특이적 세포독성 T-림프구(CTL)는 암 "면역 감시"로 알려진 과정을 통해 암에 대한 반응에 중요한 역할을 한다. 그들의 항 종양 기능은 CTLA-4 억제제 및 PD-1/PD-L1 억제제와 같은 면역 체크포인트 봉쇄 항체에 의해 강화됩니다. 비 소세포 폐암에서 (NSCLC), 반대로 PD-1/PD-L1 치료는 PD-L1 음성 종양을 가진 환자에 있는 0%-17%에서 구역 수색하는 반응 비율 귀착되고 PD-L1를 발현하는 사람들에 있는 36%-100%. 흑색종과 NSCLC에서 관찰된 PD-1/PD-L1 봉쇄에 대한 강력한 반응은 전반적인 반응 속도(RR), 내구성 임상 적 이점 및 무진행 생존(PFS)의 증거로 나타났습니다. 현재, 반대로 PD1 처리는 PD-L1 발현에 관계없이 nivolumab를 가진 2 차 선 NSCLC 처리에 있는 배려의 표준 및 PD-L1 ≥1%를 발현하는 환자에 있는 펨브롤리주맙을 가진. 1 차 줄 치료에서, 치료의 표준은 PD-L1 ≥50%를 발현하는 NSCLC 환자에서 단독으로 펨브롤리주맙이며 화학요법 (독성 및 이글약물)으로 잠재적으로 강화될 수 있다1,2.

그러나, 이러한 환자 관리에 대한 접근법은 논란의 여지가3,면역히스토화학(IHC)에 의한 종양 세포에서의 PD-L1 발현이 아마도 가장 이상적인 동반자 바이오마커가 아닐 수 있기 때문에. 종양 돌연변이 부담4 (TMB), 마이크로 위성 불안정성 (MSI) 및 / 또는 microbiota와 같은 다른 사람들은 단독으로 또는 조합이 설정에서 아마도 흥미롭습니다. NSCLC는 이질적인 종양, 공간적으로 (종양 사이트에서 다른 종양 사이트로) 또는 일시적으로 (진단에서 재발까지)로 알려져 있습니다. NSCLC를 가진 환자는 일반적으로 깨지기 쉽고, 반복적인 침략적인 조직 생검이 문제가 될 수 있습니다. 실제로, 첫번째 진행에 있는 재생검 비율은 시리즈에 따라서 46%-84%에서 범위이고, 성공적인 재생검 (조직학 및 가득 차있는 분자 분석으로 의미) 범위는 33%-75%. 이것은 환자의 25%-67%가 첫번째 진행도중포괄적인 재생검 분석을 수신할 수 없다는 것을 의미합니다 5,6,7,8.

"액체 생검"의 출현은 순환에서 파생된 순환 하는 자유로운 DNA (cfDNA)를 검토하 여 질병 진행 도중 분자 변경의 결정적인 재평가를 가능하게 하기 때문에 이렇게 이 특정 한 조정에 있는 상당한 열정을 생성했습니다 종양 세포 (CTC). 이 살아있는 세포는 혈류량으로 종양에서 풀어 놓입니다, 여기서 자유롭게 순환합니다. 일상적으로 사용되지는 않지만 CTC의 분석은 폐암에서 분자 및 표현형 특성, 예후 및 예측 유의성 (DNAseq, RNA, miRNA 및 단백질 분석을 통해)의 경우 매우 유망한 것으로 보입니다. 실제로, CTC는 초기 마커보다는 활성 질환의 현상형 특성을 항구할 가능성이 있습니다 (진단시 조직 생검에서 검출). 게다가, CTC는 작은 생검에 있는 결정적인 문제점일지도 모르다 종양 조직의 공간 이질성의 문제를 우회합니다. 따라서, CTC에 대한 PD-L1 발현은 종양 조직을 이용한 예측 바이오마커로서의 사용으로부터 유래된 불일치에 잠재적으로 빛을 비출 수 있다.

최근, PD-L1 발현은 NSCLC의 CTC에서 시험되었다. 9를 시험한 거의 모든 환자는 PD-L1 양성이었고, 결과와 임상 사용의 해석을 복잡하게 했다. 전반적으로, PD-L1 양성 CTC는 평균 4.5 세포/mL10에서샘플의 69.4%에서 검출되었습니다. 방사선 요법의 개시 후, PD-L1 양성 CTC의 비율이 크게 증가하여, 방사선11에대한 반응으로 PD-L1 발현의 상향 조절을 나타낸다. 그러므로, PD-L1 CTC 분석은 화학요법, 방사선 및 가능성 면역 요법 (IT) 처리에 반응을 반영할 수 있는 종양 및 면역 반응의 동적 변경을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.

현재까지 CTC 격리 및 PD-L1 특성화는 안티 EpCAM 코팅 자기 비드 기반 CTC 캡처, 농축 없는 기반 분석 및 크기 기반12,13 CTC 캡처 분석과 같은 다양한 방법에 의존합니다. 그러나, CTC는 전이성 NSCLC를 가진 환자의 45%-65%에서만 검출되었습니다, 따라서 전이성 NSCLC 환자의 반 이상을 위한 어떤 정보든지 를 제공하는 그들의 기능을 제한하. 또한, CTC 수는 크기 기반 접근법10을사용하여 이러한 연구의 대부분에서 낮았다. 더욱이, 이 방법은 건강한 기증자의 혈류량에 있는 "악성의 세포형태 패턴"을 가진 CD45(-)/DAPI(+) 세포의 검출과 같은 불일치로 이끌어 냈습니다. 이러한 관심사는 NSCLC에서 추가적인 암 바이오마커(즉, TTF1, Vimentin, EpCAM 및 CD44)를 사용하여 건강한 전혈에서 비정형 CD45(-) 세포의 면역 형피와 관련된 CTC 수집의 매우 민감한 방법에 대한 필요성을 강조합니다.

그 결과, 우리는 미세 유체 칩을 통해 크기와 가소성에 따라 세포를 분리하기 위해 관성 및 딘 드래그 힘을 사용하는 나선형 미세 유체 장치를 평가했습니다. 미세 유체 칩에 존재하는 딘 소용돌이 흐름의 형성은 칩의 외벽을 따라 내벽과 더 작은 면역 세포를 따라 위치한 더 큰 CTC를 초래합니다. 농축 과정은 농축 된 CTC 분획으로 수집 출구로 더 큰 세포를 사이펀하여 완료됩니다. 이 방법은 특히 민감하고 특이적(전혈의 약 1 CTC/mL의 검출)14이며 맞춤형 면역형광(IF) 분석과 연관될 수 있다. 이러한 도구는 임상 해석을위한 긍정적 인 임계 값을 설정할 수 있습니다. 따라서 생물학자가 높은 회복률과 특이성을 가진 CTC를 분리하고 면역 표현형 CTC를 분리할 수 있도록 하는 워크플로우가 설명됩니다. 이 프로토콜은 CC를 수집하는 나선형 미세 유체 장치의 최적 사용, 암 유형에 따라 사용자 정의 할 수있는 최적화 된 IF 분석, 세포 이미지를 측정하고 분석하기위한 무료 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 반자동 을 수행하는 방법을 설명합니다. 형광 염색에 따라 세포의 수치. 또한, 현미경 멀티플렉싱은 사용 가능한 형광 필터/마커의 수에 따라 수행될 수 있다.

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프로토콜

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견본은 환자 서면 동의에 따라 리옹 대학 병원에 근거를 둔 CIRCAN ("CIRculating CANcer") 코호트의 틀 안에서 예비적으로 집합되었습니다. 이 연구는 CIRCAN_ALL 코호트에 통합되었습니다. CIRCAN_ALL 연구는 참조 L15-188에 따라 2015년 04월 11일자 CPP 동동 IV에 의해 비개입으로 인식되었다. 개정된 버전은 참조 L16-160에 따라 2016/09/2016에서 비개입으로 인식되었습니다. CIRCAN_ALL 연구는 참조 15-131에 따라 2015년 01월 12일 호스피스 시민 드 리옹의 IT 및 자유 특파원에게 선언되었습니다. 혈액 수집은 의사가 종양 진행의 초기 표시를 관찰할 때 수행되었습니다.

참고: 사전 분석 시료 제제 및 면역형광 분석실험에 대한 각각의 보관 조건과 함께 재료 표에 설명된 모든 시약 및 재료를 사용하십시오. 시약을 대체하거나 저장 조건을 수정하면 최적이 아닌 분석 성능이 저하될 수 있습니다.

1. 나선형 미세 유체 장치의 오염 제거

참고: 나선형 미세유체 장치의 오염 제거는 박테리아 오염으로부터 생성된 모든 면역형광 배경을 제거하고 CTC의 세포 형태를 탐구하며 정상적인 면역 세포와 분화할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜은 혈액 샘플링 후6시간 이내에 K2 EDTA 튜브에서 수집된 혈액 샘플에 최적화되어 있으며 깨끗한 조건에서 나선형 미세유체 장치를 사용하여 농축됩니다. 다른 유형의 샘플(다른 생물학적 유체)에 이 분석을 사용하면 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 오염 제거 프로토콜은 일주일에 한 번 수행해야 합니다.

  1. 시약의 준비
    1. 희석제 완충제의 준비
      1. 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 희석제 첨가제 시약 20 mL을 살균하고 1 L의 1 X 인산완 충액 염수(PBS) 초순수 등급 (재료 표)에 직접 첨가하십시오.
    2. 시약 및 입력 빨대의 살균
      1. RBC 용해 버퍼 및 재서스펜션 버퍼를 멸균(RSB; 재료표) 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 각 용액에 대한 새로운 50 mL 폴리 프로필렌 원점 튜브에 스톡.
      2. 다목적 세정제(표)에서 1시간 동안 실온(RT)에서 배양하여 입력빨대를 살균한다. 빨대를 표백제 계 세정제(재료 표)로 옮기고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
      3. 입력 된 빨대를 각각 1 시간 동안 멸균 PBS로 두 번 헹구고 멸균된 입력 빨대를 외과 멸균 백 (재료 표)에 보관하십시오.
  2. 나선형 미세 유체 장치 오염 제거
    1. 다목적 세척제를 사용한 소독
      1. 갈색 나사를 풀어 나선형 미세 유체 장치의 희석제 포트에서 희석제 병 캡을 분리합니다. 미생물 안전 캐비닛에서 최대 250 mL의 다목적 세정제(재료 표)를 새 빈 병에 옮니다.
      2. 희석제 병 캡과 빨대를 250 mL의 병에 나사로 조여 미생물 안전 캐비닛에서 다목적 세정 시약. 이 병을 갈색 나사를 다시 나사로 조여 나선형 미세 유체 장치의 희석포트에 부착하십시오.
      3. 표백제의 100 mL까지 전송 (1% 최종 농도; 재료표) 실행 키트에 공급되는 폐기물 용기에(그림1A).
      4. 새로운 멸균 입력 빨대를 입력 포트의 나선형미세 유체 장치(재료 표)에 로드합니다. 입력 포트에 새로운 50mL 원심분리기 튜브를 적재합니다. 출력 포트에 새로운 50mL 원심분리기 튜브를 적재합니다.
      5. 나선형 미세 유체 장치(3분)에서 프라임을 클릭하여 나선형 미세유체 장치를 프라이밍합니다. 소수가 완료된 후 입력 튜브를 제거합니다.
      6. 다목적 세정 시약의 최대 15mL를 미생물학적 안전 캐비닛 아래에 세레학적 피펫이 있는 새로운 50 mL 원심분리기 튜브로 전송하고 나선형 미세유체 장치의 입력 포트에 튜브를 부착합니다.
      7. 실행을 시작하기 전에 솔루션에 과도한 거품이 없는지 확인합니다. 거품이 있는 경우 파이펫으로 느린 흡인으로 제거하십시오.
      8. 나선형 미세 유체 장치에 오염 제거 미세 유체 칩을 로드합니다. 나선형 미세 유체 장치에서 프로그램 3을 실행하고 프로그램 3(31분)을선택하여 실행합니다.
        참고 : 나선형 미세 유체 장치의 프로그램 3은 31 분 안에 CTC를 신속하게 풍부하게 할 수 있습니다.
      9. 입력 튜브의 다목적 세정 시약의 나머지 부피를 사용하여 나선형 미세 유체 장치의 세척 단계를 계속하십시오.
      10. 세척 단계가 완료된 후 입력 튜브를 버리고 입력 빨대를 남겨 둡수로 남겨 둡습니다.
    2. 표백제 기반 세척제를 사용한 오염 제거
      1. 갈색 나사를 풀어 나선형 미세 유체 장치의 희석포트에서 다목적 세척제 병 캡을 분리합니다. 미생물학적 안전 캐비닛에서, 표백제 계 세정제(재료표)를250 mL까지 새 빈 병에 옮김(그림1A)으로 옮니다.
      2. 다용도 세정제 병 뚜껑과 빨대를 미생물 안전 캐비닛 아래에 표백제 기반 세정제가 들어있는 병에 나사로 조입니다. 이 병을 갈색 나사를 다시 나사로 조여 나선형 미세 유체 장치의 희석포트에 부착하십시오.
      3. 최대 15 mL의 표백제 계 세척제를 미생물 학적 안전 캐비닛 에서 혈청학적 파이펫을 사용하여 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브 입력 튜브로 옮김. 50 mL 원심 분리기 튜브 입력 위치를 로드합니다. 빈 튜브를 출력 위치에 로드합니다.
      4. 실행을 처리하기 전에 샘플에 과도한 거품이 없는지 확인하고 있는 경우 파이펫으로 천천히 흡인하여 기포를 제거합니다.
      5. 실행을 클릭하고 프로그램 3(31분)을선택하여 프로그램 3을 실행합니다. 실행 후, 입력 튜브내의 표백제 계 세정제의 잔량량을 이용하여 세정 단계로 직접 진행한다.
      6. 입력 및 출력 튜브를 폐기합니다.
    3. 나선형 미세 유체 장치를 헹구고 있습니다.
      1. 갈색 나사를 풀어 나선형 미세 유체 장치의 희석포트에서 표백제 기반 세정제 병 캡을 분리합니다. 미생물학적 안전 캐비닛 에서, 표백제 계 세정제를 함유한 병에서 희석제 완충제를 포함하는 새로운 병으로 빨대를 옮니다. 나선형 미세 유체 장치에 병을 나사.
      2. 최대 15 mL의 멸균수(재료 표)를 미생물학적 안전 캐비닛 아래에 세로학적 파이펫을 사용하여 새로운 50 mL 원심분리기 튜브 입력 튜브로 옮김. 50 mL 원심 분리기 튜브 입력 위치를 로드합니다. 빈 튜브를 출력 위치에 로드합니다.
      3. 실행을 처리하기 전에 샘플에 과도한 거품이 없는지 확인하고 있는 경우 파이펫으로 천천히 흡인하여 기포를 제거합니다.
      4. 실행을 클릭하고 프로그램 3(31분)을선택하여 프로그램 3을 실행합니다. 실행 후, 입력 튜브내의 멸균된 물의 잔여 부피를 사용하여 세척 단계로 직접 진행한다.
      5. 입력 및 출력 튜브를 폐기합니다.

2. 나선형 미세 유체 장치 박테리아가없는 유지 보수

참고: 일상적인 유지 보수는 마지막 청소 단계 동안 하루의 끝에 수행해야합니다.

  1. 미생물학적 안전 캐비닛 에서 혈청 피펫을 사용하여 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브에 표백제 기반 세정제를 최대 7 mL까지 이송합니다. 나선형 미세 유체 장치의 입력 포트에서 표백제 기반 클리닝 튜브를 나사로 조입니다.
  2. 클린 런을 처리하기 전에 입력 샘플에 과도한 기포가 없는지 확인하고 있는 경우 파이펫으로 천천히 흡인하여 기포를 제거합니다.
  3. 나선형 미세 유체 장치에서 깨끗한 실행합니다.

3. 환자 혈액 샘플에서 CTC의 사전 분석 농축

  1. K2EDTA 튜브에 7.5 mL의 혈액을 모으고 세포 침전과 응고를 피하기 위해 부드러운 교반 하에 보관하십시오. 6 시간 이내에 처리하십시오.
    참고: 혈액이 방부제를 함유하는 무세포 DNA 혈액 수집 튜브에서 수집되는 경우, 처리 될 때까지 4 °C에서 저장하십시오. 농축 단계를 진행하기 전에 혈액 샘플, RBC 포염 버퍼 및 RBS 버퍼가 RT에 있는지 확인합니다.
  2. 미생물학적 안전 캐비닛 하에서 혈청학적 피펫을 사용하여 새로운 50 mL 원심분리기 튜브 입력 튜브에 전혈의 최대 7.5 mL을 전달합니다.
  3. RT에서 1,600 x g의 원심분리기를 10분 동안 피펫으로 모이면 버피 코트를 방해하지 않고 피펫으로 플라즈마 분획을 수집합니다. 최대 7.5mL의 PBS에 직접 동등한 부피를 추가하여 플라즈마 분율을 대체합니다.
  4. RBC 용해 완충제(재료 표)를 혈액 샘플에 30 mL(K2EDTA 튜브의 경우) 또는 37.5 mL(무세포 DNA 혈액 수집 튜브용)에 부드럽게 추가합니다. 혈액 수집 튜브를 10x 부드럽게 반전시키고 RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
    참고: 혈액 샘플은 RBC 라시스 동안 더 진한 빨간색으로 변합니다. 10분 후에도 변화가 관찰되지 않으면 튜브를 3x 로 부드럽게 반전시키고 최대 5분 동안 그대로 둡니다. 샘플 품질 및 분석 성능을 손상시킬 수 있으므로 샘플을 RBC 용해 버퍼에 15분 이상 두지 마십시오.
  5. RT에서 10 분 동안 500 x g에서 용해 된 혈액 샘플을 원심 분리기로 원심 분리기 (또는 가장 높은 감속 속도)를 작동시킵니다. 파저 피펫 또는 혈청학적 파이펫을 사용하여 부피가 4-5 mL 마크에 도달할 때까지 상류를 부드럽게 제거하십시오. 그런 다음 여과 된 마이크로 파이펫 팁을 사용하여 나머지 상류를 제거하십시오.
  6. 여과된 팁이 있는 P1000 마이크로파이펫을 사용하여 50mL 원심분리기 튜브 입력 튜브의 벽에 1.0 mL의 RSB를 추가합니다. 혼합물에 거품이 유입되는 것을 방지하려면 샘플이 균일할 때까지 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
  7. 50 mL 원심 분리튜브 입력 튜브의 벽에 RSB 3mL를 추가합니다(총 부피 4 mL). 믹스에 거품을 도입하지 마십시오. 셀 서스펜션을 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
    참고: 드문 경우지만 일반 파이펫팅이 셀 덩어리(피펫 팁을 가시거나 차단하여 정의됨)를 분해할 수 없는 경우 40 μm 셀 스트레이너를 통해 샘플을 필터링하여 덩어리를 제거합니다. 시료에 RSB 150 μL을 추가하여 필터링으로 인한 부피 손실을 만회합니다. 이 메서드는 큰 덩어리가 관찰되는 경우에만 아껴서 사용해야 합니다.
  8. 농축 단계를 진행하기 전에 샘플에 과도한 기포가 없는지 확인하고 거품이 있는 경우 거품을 제거하고 샘플을 버리지 않도록 주의하십시오. 작은 거품이 있는 경우 제거가 필요하지 않습니다.
  9. 나선형 미세 유체 장치에서 샘플을 처리합니다.

4. 나선형 미세 유체 장치로 환자 전혈에서 CTC의 농축

  1. 새로운 나선형 미세 유체 칩을 로드합니다. 입력 및 출력 포트에 빈 50mL 원심분리기 튜브 2개를 적재합니다.
  2. 나선형 미세 유체 장치에서 프라임을 클릭하여 소수를 실행합니다(3분). 입력 및 출력 튜브를 제거하고 입력 포트에서 처리될 샘플을 로드합니다.
  3. 출력 포트에 명확한 15mL 원엽 튜브를 로드하여 풍부한 CTC를 수집합니다.
  4. 출력 튜브와 원심분리기를 500 x g에서 10분 동안 언로드(가속: 9; 감속: 5). 5 mL 의 혈청학적 파이펫으로 원뿔형 15mL 튜브의 2mL 마크에서 상한 정지를 제거합니다. 마이크로파이펫을 사용하면 원엽 15 mL 튜브에서 100 μL 마크에서 상급 정지를 제거합니다. 면역 형광 염색을 위해 농축 된 샘플을 직접 처리하십시오.

5. 면역 형광 염색

  1. 혈세포계 형 격자로 챔버슬라이드에 열거하여 mL당 셀 수를 열거한다. 농축 된 샘플을 0.2 % 항 결합용액 (재료 표)으로 희석하여 시토 스핀 당 100,000 세포 / 100 μL에 도달하는 농도로 희석하십시오.
  2. 면 (재료 표)를 사용하여 샘플챔버의 윤곽을 0.2 % 항 결합 용액 50 μL로 적시다. 폴리리신 유리 슬라이드를 샘플 챔버에 놓고 닫습니다.
  3. 팁을 위아래로 3x 파이펫팅하여 0.2% 방지 결합 용액으로 코팅합니다. 농축 된 샘플을 다시 중단하고 세포 용액을 샘플 챔버로 옮김. 전용 원심분리기(재료 표)가400rpm에서 4분(가속 낮음).
  4. 증착 부위 주변에 실리콘 아솔레이터를 놓습니다. 유리 슬라이드를 미생물 안전 캐비닛 아래에서 2 분 동안 건조시키십시오.
  5. 멸균 PBS 3mL로 1mL의 파라포름알데히드(PFA)를 희석하여 고정 용액을 준비합니다. 샘플당 100 μL(4% PFA)을 추가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
    주의 사항: 흡입을 방지하기 위해 화학 안전 캐비닛 아래에 PFA를 사용하십시오.
  6. 5% 에서 태아 소 혈청 (FBS)을 희석하여 포화 용액을 준비하고, Fc 수용체 (FcR) 차단 시약 5%, 소 혈청 알부민 (BSA)을 멸균 PBS에서 1 %에서 멸균 PBS(재료의표)에서. 샘플당 100 μL의 포화 액을 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
  7. 샘플당 100 μL의 항체 용액을 추가하십시오 (CD45 항체 1/20; PanCK 항체 1/500; PD-L1 항체 1/200; Qsp 포화 액 100 μL)(재료 표). 폴리리신 유리 슬라이드를 100mm x 15mm 페트리 접시에 놓습니다. 흡수성 종이에 멸균수 2mL를 적시고 페트리 접시를 뚜껑으로 닫습니다. 밤새 4 °C에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
  8. 항체 혼합물을 제거하고 200 μL의 PBS로 3번의 세척을 수행하여 각 세척을 2분 동안 배양하였다. 샘플을 5 분 동안 건조시키고 빛으로부터 보호하십시오. 증착 부위에 장착 용액(재료 표)의 10 μL을 놓고 거품을 만들지 않고 현미경 커버슬립으로 덮습니다. 커버슬립을 매니큐어로 밀봉합니다.

6. 직선 형광 현미경 및 관련 소프트웨어로 면역 형광 이미지 획득

  1. X/Y 전동 플랫폼으로 직선 형광 현미경을 사용하십시오. DNA 염료(4', 6-디아미디노-2-페닐린들[DAPI]), PanCK 염료(플루오레세인 이소티오시오케네이트 [FITC]), PD-L1 염료(CY3) 및 CD45 염료(CY5)에 해당하는 4개의 채널에서 8비트 RGB 티프 이미지를 20배 씩 사용합니다. 사용 15분 전에 수은 램프를 켜고 현미경 및 관련 소프트웨어를 반자동 촬영에 적용합니다.
  2. 유리 슬라이드를 플랫폼에 놓습니다.
  3. 수집 메뉴에서, 네 개의 채널을 정의하고 노출 시간을 설정 (DAPI : 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1,000 ms). 스캔할 타일을 정의합니다. 타일을클릭합니다. 고급실험에서는 스캔할 영역을 정의합니다.
  4. 화면의 초점을 조정합니다. 실험 시작을클릭합니다.
  5. 각 채널의 TIF 파일을 내보내고 이 정보로 이미지 파일의 이름을 구체적으로 지정합니다. 이름 염료: DAPI 채널은 c1, FITC 채널은 c2, CY3 채널은 c3, CY5 채널은 c4이다.

7. 이미지 분석 소프트웨어로 면역형광 이미지 분석

  1. 다운로드 및 브로드 연구소 웹 사이트에서 무료 이미지 분석 소프트웨어를 설치합니다. 설치 하는 동안 모든 기본을 허용 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 열고 파일을 클릭 | 파일에서 파이프라인 | 분석_4channels_CTC.cppipe.
    참고: 파이프라인은 RGB 색상 이미지를 그레이스케일로 변환하고, 중앙값 필터로 이미지를 스무딩하여 아티팩트를 제거하고, 핵및 세포질 식별, 각 채널의 형광 강도를 정량화하고, 엑셀 파일로 내보전합니다.
  2. 파일 목록에파일을 놓습니다. 메타데이터를 업데이트하여 파일을 타일별로 그룹화합니다.
    참고: 이미지 그룹에 대한 모든 지침은 소프트웨어에 지정되어 있습니다. NameAndTypes 모듈에 나타난 이름 파일과 파일은 샘플당 타일 및 채널 수에 따라 그룹화됩니다.
  3. 출력 설정 보기를 클릭하고 올바른 기본 출력을 지정합니다. 이미지 분석을클릭합니다. 측정_강도 매개 변수에 해당하는 스프레드시트 파일을 엽니다.

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결과

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첫 번째 전제 조건은 조직 배양을 위한 CTC의 오염되지 않은(감염성 에이전트 가 없는) 수집을 얻고 IF 배경생성을 피하는 것이었습니다. 오염 제거 프로토콜을 통해 모든 파이프와 펌프를 세척할 수 있었고, 세균 오염 없이 회수율이 좋은 CTC를 수집했습니다. 농축된 시료는 나선형 미세유체 장치의 오염 제거 프로토콜 워크플로우 없이 비교하였다. 제염 프로토콜을 검증하기 위해 A549 세포주전피가 없는 상태에서 사용되었고 나선형 미세유체 장치를 사용하여 직접 농축되었습니다. 최적화된 제염 프로토콜없이, 진핵 세포의 사망 및 세포형성 변화를 일으킨 24 시간 후에 농축 된 A549 세포주 조직 배양에서 높은 박테리아 오염이 관찰되었습니다 (그림1B).

대조적으로, 세정 프로토콜 후, 살아있는 A549 세포는 조직 배양 및 배지 제거의 10시간 후 및 3D 조건(도...

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토론

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본 연구에서 두 가지 주요 포인트가 제기되었으며, 첫 번째는 임상 응용으로의 이송을 위한 워크플로우의 성능에 관한 것이고, 두 번째는 얻어진 형광 이미지의 분석을 위한 주관성의 감소에 관한 것이다.

CTC 열거를 위한 수행및 최적화된 워크플로우는 CTC 라벨없는 미세 유체 시스템(나선형 미세 유체 장치)을 통해 세포 농축 후 사용자 정의 IF 분석을 사용하여 처음에 결정되었습니다. 이 워크플로우를 사용하여, 파일럿 연구는 전이성 NSCLC 환자로부터의 모든 샘플이 모두 CD45(-)인 비정형 세포를 포함하고 있음을 확인하였다. 그(것)들은 PanCK 및/또는 PD-L1 바이오마커로 대체로 표지될 수 있습니다; 그러나, 이들은 또한 S19 샘플에서 관찰된 바와 같이 모든 시험된 바이오마커[CD45(-), PanCK(-), 및PD-L1(-)에 대해 완전히 음성일 수 있다(표 2)]. 이것은 강하게 PHENOTyping CTC 하위 인구를 위한 추가 bi...

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공개 사항

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장 필립 오렐과 캐스린 웨이치 리는 이 기사에서 사용되는 악기를 생산하는 바이오리딕스 회사의 직원입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 아스트라제네카(런던, 영국), 바이오리딕스(싱가포르), 리그 콘트르 르 암(사오네 에 루아르, 프랑스)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 저자는 그들의 재정 지원을 위해 아스트라 제네카와 바이오 리딕스 회사에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4', 6-디아미디노-2-phé nylindole (DAPI)OzymeBLE 422801저장 조건: +4 > C
BD Facs Clean – 5 LBD Biosciences340345표백제 기반 세척제. 보관 조건: 실온
표백제 1% 세척액 100mLBiolidicsCBB-F016012표백제. 보관 조건: 실온
소 혈청 알부민(BSA) 7.5%SigmaA8412보관 조건: +4 ° C
CD45 단클론 항체 (클론 HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020저장 조건: +4 > C
CellProfiler SoftwareBroad Institute이미지 분석 소프트웨어
원심분리기 장치Hettich4706보관 조건: 실온
원심분리기 튜브 50 mLCorning430-829보관 조건: 실온
원심분리기 튜브 15 mLBiolidicsCBB-F001004-25보관 조건: 실온
ClearCell FX-1 시스템BiolidicsCBB-F011002나선형 미세유체 장치. 보관 조건: 실온
Coulter Clenz 세척제 – 5 LBeckman Coulter8448222다목적 세척 시약. 보관 조건: 실온
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002미세유체 칩. 보관 조건: 실온
Cytospin 4ThermoFisherA78300003보관 조건: 실온
희석제 첨가제 시약 – 20 mLBiolidicsCBB-F016009보관 조건: +4 & C
EZ CytofunnelsThermoFisher A78710003면이 함유된 시료 챔버. 보관 조건: 실온
FcR 차단제Miltenyi Biotec130-059-901보관 조건: +4 ° C
태아 송아지 세럼 (FCS)Gibco10270-106보관 조건: +4 ° C
플루오로마운트시그마F4680마운팅 솔루션. 보관 조건: 실온
Fungizone - 50mgBristol-Myers-Squibb90129TB29항진균 시약. 저장 조건: +4 >
C FX1 입력 빨대(잠금 캡 포함BiolidicsCBB-F013005빨대. 보관 조건: 실온
KovaSlideDutscher50126챔버 슬라이드. 저장 조건: 실온
PanCK 단클론 항체 (클론 AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80저장 조건: +4 ° C
파라포름알데히드 16%ThermoFisher11490570고정 용액. 저장 조건: +4 > C
PD-L1 단클론 항체 (클론 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegendBLE329706저장 조건: +4 > C
Petri DishDutscher632180저장 조건: 실온
인산염 완충 식염수 (PBS)OzymeBE17-512F저장 조건: +4 ° C
인산염 완충 식염수 울트라 퓨어 등급 1x – 1 L1st Base LaboratoryBUF-2040-1X1L보관 조건: 실온
Pluronic F-68 10%Gibco24040-032안티-바인딩 솔루션. 저장 조건: 실온
폴리리신 슬라이드ThermoFisherJ2800AMNZ저장 조건: 실온
폴리프로필렌 원추형 튜브 50 mLFalcon352098저장 조건: 실온
RBC Lysis Buffer – 100 mLG Biosciences786-649저장 조건: +4 ° C
RBC 용해 완충액 – 250 mLG Biosciences786-650보관 조건: +4 ° C
Resuspension Buffer (RSB)BiolidicsCBB-F016003저장 조건 : +4 > C
Shandon Cytopsin4 원심분리기ThermoFisherA78300003전용 원심분리기. 보관 조건: 실온
실리콘 아이솔레이터Grace bio-Labs664270보관 조건: 실온
멸균 탈이온수 – 100 mL1st Base LaboratoryCUS-4100-100ml보관 조건: 실온
직선 형광 현미경 Axio Imager D1Zeiss보관 조건: 실온
외과적 멸균 BagSPS Laboratoires98ULT01240보관 조건: 실온
주사기 BD Discardit II 20mL 멸균BD Biosciences300296보관 조건: 실온
주사기 필터 0.22 &마이크로; m 33mm 멸균ClearLine51732보관 조건: 실온
Zen lite 2.3 Lite 소프트웨어Zeiss현미경 관련 소프트웨어
)

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726(2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

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