Presynapse 형성은 적절한 순서로 시 냅 스 단백질의 축적을 포함 하 여 동적 과정. 이 방법에서, presynapse 형성은 "뉴런 볼" 배양물의 축축한 시트에 presynapse 조직 단백질과 공액된 구슬에 의해 유발되므로 시냅스 단백질의 축적은 presynapse 형성 동안 분석되기 쉽습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
신경 발달 도중, 시냅스 대형은 신경 회로를 설치하는 중요한 단계입니다. 시 냅 스를 형성 하기 위해, 시 냅 스 단백질 은 미성숙 시 냅 스에서 세포 체 및/또는 로컬 번역에서 전송 하 여 적절 한 순서로 공급 해야 합니다. 그러나, 그것은 완전히 이해 되지 않습니다 어떻게 시 냅 스 단백질 적절 한 순서로 시 냅 스에 축적. 여기서, 우리는 뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 시냅스 전 형성을 분석하여 시냅스 전 형성을 유도하는 새로운 방법을 제시한다. 신경 세포 응집체인 뉴런 볼은 세포체와 모수석에서 멀리 떨어진 축축한 시트를 제공하므로 세포체의 압도적인 신호를 피함으로써 약한 형광 신호가 검출될 수 있습니다. 구슬은 presynapse 대형을 트리거하기 때문에, 우리는 류신이 풍부한 반복 막 간 신경 2 (LRRTM2), 흥분성 presynaptic 주최자와 결합된 구슬을 사용합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 소포성 소포 단백질인 소포성 단백질인 소포성 단백질인 소포체 1(vGlut1)이 활성 영역 단백질인 Munc18-1보다 더 빨리 시냅스로 축적된다는 것을 입증했습니다. Munc18-1 세포 체를 제거 한 후에도 presynapse에 의존적으로 축적 된 번역. 이 발견은 세포체에서 수송되지 않는 축색에 있는 현지 번역에 의하여 Munc18-1 축적을 나타냅니다. 결론적으로,이 방법은 시 냅 스 및 시 냅 스 단백질의 소스에 시 냅 스 단백질의 축적을 분석 하는 데 적합 하다. 뉴런 볼 배양이 간단하고 특수 장치를 사용할 필요가 않기 때문에이 방법은 다른 실험 플랫폼에 적용 될 수 있습니다.
서론
시냅스 형성은 신경 회로 1,2,3의발달 중에 중요한 단계 중 하나입니다. 시냅스 전후로 구성된 전문 구획의 형성은 축삭과 모수석의 적절한 인식, 활성 영역 및 후발성 밀도의 형성, 그리고 적절한 정렬을 포함하는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이온 채널 및 신경전달 물질 수용체 1,2. 각 과정에서, 시 냅 스 단백질의 많은 종류는 세포 체에서 시 냅 스 단백질을 수송 하 여 적절 한 타이밍에 이러한 전문 된 구획에 축적 및/또는 구획에 로컬 번역에 의해. 이러한 시 냅 스 단백질 기능 시 냅 스를 형성 하기 위해 조직 된 방식으로 배열 될 것으로 간주 됩니다. 시 냅 스 형성을 포함 하는 일부 시 냅스 단백질의 기능 장애 는 신경 질환 결과 4,5. 그러나, 그것은 불분명 한 방법 시 냅 스 단백질 적절 한 타이밍에 축적.
시 냅 스 단백질 조직 된 방식으로 축적 하는 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 원고에 기술된 실험은 요코하마시 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 매달려 드롭 문화로 뉴런 볼의 준비 (시험관 내 일 (DIV) 0-3)
참고: 뉴런 볼 배양의 제조를 위해 여기에 기술된 절차는 사사키 그룹이 이전에 보고한 방법에 기초하여일부수정9,10. 우리는 또한 해리 문화14에대한 Banker 방법에서 몇 가지 절차를 채택했다.
-
해부를 시작하기 전에 다음 확인
- 필요한 모든 솔루션을 준비하고 사전에 오토클레이브/여과하여 소독하십시오.
- 이 피질 뉴런 문화의 각 단계에서 사용되는 모든 악기와 재료를 준비하십시오.
- 70% 에탄올로 층류 공기 흐름 캐비닛, 해부 테이블, 스테레오 현미경, 가위 및 집게의 스테이지 플레이트를 스프레이하고 닦으하십시오.
- CO2를 적용한 후 마우스를 안락사시키고 복부를 해부하여 E16 배아를....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기서, 우리는 신경 볼 배양액의 축사 시트의 LRRTM2 유도 전시냅스에서 시냅스 전 단백질의 축적의 대표적인 결과를 보여준다. 시냅스 전 단백질로서, 우리는 흥분성 시냅스 소포 단백질 vGlut1 및 활성 영역 단백질 Munc18-1을 분석했다. 우리는 또한 presynapses에 있는 vGlut1와 Munc18-1의 축적의 시간 과정을 검토하고, 세포 바디및 단백질 합성 억제기를 제거하는 축세포를 사용하여 presynapses에 있는 Munc18-1의 근원을 나타내는 결과를 얻었습니다. 최근, 우리는 presynapses8에서 Munc18-1의 축적에 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 역할을 조사했다. FMRP는 깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS)의 원인이 되는 유전자 생성물이며, 번역17,18,19를억제.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 뉴런 볼 배양을 사용하여 LRRTM2-비드로 자극된 시냅스 형성을 검사하는 새로운 방법을 개발했습니다. 현재, 대부분의 시냅스 형성 분석은 폴리-D-리신(PDL) 코팅된 비드 및 해리된 배양/미세유체챔버(20,21,22)를포함한다. 이 방법의 장점 중 하나는 LRRTM2 비드입니다. LRRTM2는 neurexin과 상호 작용하여 특히11,12,13,PDL-비드는 흥분성 및 억제 presynapses 모두 비특이적으로20을유도합니다. 이 방법에서는, 그 구성원이 10 단백질3이상인 그밖 presynapse 주.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 부분적으로 JSPS 과학 연구를위한 원조에 의해 지원된다 (KAKENHI) (C) (번호 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. 사사키). 노기 테루카즈 박사와 네야자키 마키코(요코하마시 립대학)에게 생물학적 LRRTM2 단백질을 친절하게 공급해 주신 것에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 해주신 우에치 호나미와 이시이 리에 대해서도 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항체 희석제 | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum 무료 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| 소 혈청 Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| 세포 배양 처리 된 멀티 디쉬 (4 웰 디쉬) | Nunc | 176740 | |
| 완전한 EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| 냉각 CCD 카메라 | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | 크기 : 15mm, 두께 : 0.13-0.17 mm |
| 시토신 &베타; -D-아라비노푸라노시드 (AraC) | 시그마-알드리치 | C1768 | |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| 데옥시리보뉴클레아제 1 (DNase I) | Wako 순수 화학 물질 | 047-26771 | |
| Expi293 발현 시스템 | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| 말 혈청 | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| 이미지 수집 소프트웨어 | Nikon | NIS-element AR | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | ||
| Neurobasal 매체 | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3558 | |
| 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| 폴리(비닐 알코올) | Sigma | P8136 | |
| 사전 포장된 일회용 PD-10 컬럼 | GE 헬스케어 | 17085101 | |
| 토끼 항소포성 글루타메이트 수송체 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N(중성 비인 세제) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | 직경: 4-5 &마이크로; m |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
참고문헌
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5),....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
