방법 논문

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

DOI:

10.3791/59895

⸱

2019년 7월 5일

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 융합은 많은 다른 유형의 암의 종양 발생 표현형에 자주 기여합니다. 추가적으로, 암 환자에게서 견본에 있는 특정 융합의 존재는 수시로 진단, 예후 및/또는 치료 선택에 직접적인 영향을 미칩니다. 그 결과, 유전자 융합의 정확한 검출은 많은 질병 유형에 대한 임상 관리의 중요한 구성 요소가되었습니다. 최근까지, 임상 유전자 융합 검출은 주로 단일 유전자 검법의 사용을 통해 달성되었다. 그러나, 임상 중요성을 가진 유전자 융합의 계속 증가하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가하기위한 필요성을 만들었습니다. 차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 테스트는 핵산을 대규모 병렬 방식으로 서열화하는 능력을 통해 이러한 요구를 충족시켰습니다. 유전자 표적 농축을 위한 다른 전략을 채택하는 다중 NGS 기지를 둔 접근은 지금 그것의 자신의 강점 및 약점을 가진 임상 분자 진단에서 사용하기 위하여 유효합니다. 이 논문은 임상 고형 종양 표본에서 유전자 융합을 평가하기 위해 NGS에 이어 앵커된 멀티플렉스 PCR(AMP) 기반 표적 농축 및 라이브러리 제제의 사용을 설명합니다. AMP는 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 식별한다는 점에서 앰플리콘 기반 농축 접근법 중에서 독특합니다. 여기에 상세한 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출을 보장하는 습식 벤치 및 데이터 분석 단계 모두있습니다.

서론

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단일 전사 엔티티로 2개 이상의 유전자의 융합은 삭제, 복제, 삽입, 반전 및 전좌를 포함한 대규모 염색체 변이의 결과로 발생할 수 있다. 발현된 유전자 생성물의 변질된 전사 제어 및/또는 변경된 기능적 특성을 통해, 이러한 융합 유전자는 암세포에 종양발생 특성을 부여할 수 있다1. 많은 경우에, 융합 유전자는 세포 증식 및 생존 경로를 직접 활성화하여 1 차적인 종양 발생 드라이버로 작용하는 것으로 알려져 있습니다.

암 환자를 위한 유전자 융합의 임상 적 관련성은 먼저 만성 골수성 백혈병 (CML)에서 필라델피아 염색체 및 상응하는 BCR-ABL1 융합 유전자의 발견으로 명백해졌습니다 2. 소분자 억제제 imatinib mesylate는 이러한 융합 유전자를 구체적으로 표적으로 하기 위해 개발되었으며 BCR-ABL1-양성CML 환자3에서현저한 효능을 입증하였다. 종양발생 유전자 융합의 치료적 표적화는 또한 고형 종양에서 성공하였고, 비소세포 폐암에서 ALK 및 ROS1 융합 유전자의 억제가 1차 적인 예로 4,5를수행하고 있다. 최근, NTRK 억제제 라로트렉티닙은 질병 부위 6에 관계없이 NTRK1/2/3 융합양성 고형 종양에 대한 FDA 승인을 받았다. 치료 선택을 넘어, 유전자 융합 검출은 또한 질병 진단 및 예후에서 역할이 있습니다. 이것은 특정 융합의 존재에 의해 진단적으로 정의되는 각종 육종 및 혈액학 악성 아류형에서 특히 널리 퍼져 있고/또는 융합의존재가 예후7,8을 직접 알려줍니다 , 9개 , 10개 , 11.이들은 암 환자를 위한 유전자 융합 검출의 임상 적용의 예에 불과하다.

임상 의사 결정에 중요한 역할을 하기 때문에 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출이 매우 중요합니다. 세포유전학 기술, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 신계 혼성화(FISH) 형광 등 융합 또는 염색체 재배열 분석을 위한 임상 실험실에 수많은 기술이 적용되었습니다. 면역막이화학(IHC) 및 5'/3' 발현 불균형 분석(그 외)12,13,14,15. 현재, 암에 있는 실행 가능한 유전자 융합의 급속하게 팽창하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가할 필요 귀착되었습니다. 따라서, 한 번에 하나 또는 몇 개의 유전자만 쿼리할 수 있는 몇몇 전통적인 기술은 비효율적인 접근이 되고 있습니다, 특히 임상 종양 견본이 수시로 아주 유한하고 몇몇 분석실험 사이에서 분할되는 것을 허용되지 않다는 것을 고려할 때. 그러나 차세대 염기서열 분석(NGS)은 다중 유전자 검사에 적합한 분석 플랫폼이며 NGS 기반 분석실험은 임상 분자 진단 실험실에서 일반화되고 있습니다.

융합/재배열 검출을 위해 현재 사용되는 NGS 분석제는 사용된 입력 물자, 도서관 준비 및 표적 농축을 위해 채택된 화학, 및 분석분석내에서 질의된 유전자의 수에 관하여 변화합니다. NGS 검소는 샘플로부터 추출된 RNA 또는 DNA(또는 둘 다)에 기초할 수 있다. RNA 기지를 둔 분석은 높게 저하된 RNA를 포함하는 임상 견본의 경향에 의해 방해되더라도, DNA 기지를 둔 융합 시험의 표적이 고 수시로 반복적인 인트론을 순서를 정하는 필요를 우회합니다 그러나 NGS를 위해 어려운 것으로 입증되었습니다 데이터 분석16. RNA 기반 NGS 공소시에 대한 표적 농축 전략은 크게 하이브리드 포획 또는 앰플리콘 매개 접근법으로 나눌 수 있다. 두 전략이 융합 검출에 성공적으로 활용되었지만 각각 다른17,18에비해 장점이 있습니다. 하이브리드 포획 분석법은 일반적으로 더 복잡한 라이브러리를 초래하고 대립계 탈락을 감소시키는 반면, 앰플리코 기반 분석법은 일반적으로낮은 입력을 필요로 하고 오프 타겟 시퀀싱이 적은 19를 초래한다. 그러나, 아마도 전통적인 amplicon 기반 농축의 주요 제한은 모든 알려진 된 융합 파트너에 프라이머에 대 한 필요성. 이것은 많은 임상적으로 중요한 유전자가 다른 파트너의 수십와 융합하기 위하여 알려지고 있기 때문에 문제가 되고, 프라이머 디자인이 모든 알려진 파트너의 탐지를 위해 허용되더라도, 새로운 융합 사건은 검출되지 않는 남아 있을 것입니다. 최근에 설명한 기술은 앵커드 멀티플렉스 PCR(또는 짧게 AMP)을 지칭하여 이 제한20을해결한다. AMP에서, '반 기능' NGS 어댑터는 입력 RNA에서 파생되는 cDNA 단편에 결찰된다. 표적 농축은 유전자 특이프라이머와 어댑터에 대한 프라이머 사이의 증폭에 의해 달성된다. 그 결과, 관심 있는 유전자에 대한 모든 융합이 새로운 융합 파트너가 관여하더라도 검출되어야 한다(도 1참조). 이 문서에서는 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합의 검출을 위해 표적 농축 및 라이브러리 준비를 위해 AMP를 사용하는 NGS 기반 분석인 ArcherDx FusionPlex 고형 종양 키트의 사용에 대해 설명합니다(보충 표 1 전체 유전자 목록)을 참조하십시오. 습식 벤치 프로토콜 및 데이터 분석 단계는 임상 실험실 개선 수정안(CLIA) 인증 실험실에서 엄격하게 검증되었습니다.

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프로토콜

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1. 도서관 준비 및 시퀀싱

  1. 일반 분석 고려 사항 및 사전 분석 단계
    1. 분석 실행은 전형적으로 7개의 임상 견본 및 1개의 양성 대조군으로 이루어져 있습니다 (라이브러리 준비 실행당 견본의 수는 필요에 따라 조정될 수 있더라도). 제조업체에 의해 확인되었거나 직교 방법론에 의해 확인된 적어도 여러 유전자 융합(즉, 분석 대상)을 포함하는 양성 대조군을 사용한다. 비 템플릿 제어 (NTC)는 모든 분석 실행에 추가 샘플로 포함되어야하지만, 단지 두 번째 가닥 cDNA 합성 및 사전 시퀀싱 품질 관리를 통해 수행된다 (사전 Seq QC; cDNA 합성을 보장하기 위해). NTC에 샘플 희석제(10 mM Tris HCl pH 8.0)를 사용하십시오.
    2. 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직의 총 핵산 (TNA) 추출을 수행합니다.
    3. 형광 분석법을 사용하여 TNA의 RNA 성분을 정량화한다.
      참고: 동결 해동 주기를 제한하고, 해동된 핵산을 저온(냉각 블록, 얼음 또는 대안)으로 유지하고, RNase 오염(장갑 착용, RNase 오염 물질 스프레이 사용)을 방지하여 시료의 RNA 분해를 방지합니다.
  2. 랜덤 프라이밍
    참고: 분석에 대한 원하는 입력은 200 ng RNA입니다(TNA의 형광량에 기초). 200ng를 달성할 수 없는 경우 낮은 입력을 사용할 수 있습니다. 시료가 시퀀싱 후 QC에 실패하면 입력이 더 높은 경우 반복하면 허용 가능한 QC 메트릭이 생성될 수 있습니다.
    1. 원하는 RNA 농도를 달성하기 위해 10 mM Tris HCl pH 8.0에서 TNA를 희석하십시오. 각 시료에 대해, 희석의 20 μL을 무작위 프라이밍 시약 스트립 튜브(미리 냉각된 알루미늄 블록에 배치)로 옮기고 6-8회 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다. 전체 볼륨을 간단히 회전하고 전체 볼륨을 96웰 PCR 플레이트로 전송하고 RT 필름으로 밀봉합니다.
    2. 열전자전거 블록에 플레이트를 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 65 °C에서 5 분 동안 배양하십시오 (가열 된 뚜껑).
    3. 열전자전거에서 접시를 제거하고 2분 동안 얼음 위에 놓습니다.
  3. 첫 번째 가닥 cDNA 합성
    1. 랜덤 프라이밍 생성물의 전체 부피를 첫 번째 가닥 시약 스트립 튜브로 전송합니다(미리 냉각된 알루미늄 블록에 놓음). 위아래로 6-8번 파이펫팅하여 섞으세요. 잠시 스핀 다운, 96 웰 PCR 플레이트에 전체 볼륨을 전송하고 RT 필름밀봉.
    2. 열전자전거 블록에 플레이트를 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 열전자전거 프로그램 실행: 25°C 10분, 42°C 30분, 80°C 20분, 4°C 홀드(가열된 뚜껑).
  4. 두 번째 가닥 cDNA 합성
    1. 새로운 PCR 스트립 튜브 세트에서, 9 μL 뉴클레아제 자유물에 첫 번째 가닥 생성물의 1 μL을 추가하여 첫 번째 가닥 생성물의 1:10 희석을 생성한다. 희석을 제쳐놓고 Pre-Seq QC 분석에 사용한다.
    2. 나머지 첫 번째 가닥 제품에 21 μL의 뉴클레아제 자유물을 추가합니다. 제 1 가닥 생성물의 40 μL을 제 2 가닥 시약 스트립 튜브로 옮겨 (미리 냉각 된 알루미늄 블록에 배치). 위아래로 6-8번 파이펫팅하여 섞으세요. 스핀다운, 전체 볼륨을 96 웰 PCR 플레이트로 옮기고 RT 필름으로 밀봉하십시오.
    3. 열전자전거 블록에 플레이트를 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 열전자전거 프로그램 실행: 16°C 60분, 75°C 20분, 4°C 홀드(가열된 뚜껑).
      참고: 이것은 허용 가능한 중지 지점입니다. 플레이트는 -20°C에서 보관할 수 있다.
  5. 세크 전 QC
    참고: 이 품질 관리 (QC) 분석은 NTC에서 아무 cDNA 합성의 검증을 위해 주로 사용됩니다. 그러나 분석 문제 해결에도 데이터가 유익할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플에 좋은 Pre-Seq QC 값이 있지만 분석 메트릭이 좋지 않은 경우(아래 참조) 분석 실행에서 문제가 발생했음을 나타내므로 반복이 필요할 수 있습니다.
    1. 각 샘플과 NTC를 중복으로 실행합니다. 또한 프리-세크 QC는 뉴클레아제 자유물(또한 중복으로 실행)인 반응 NTC를 실행한다. 광학 96 웰 플레이트의 각각의 적용 가능한 웰에 분석 마스터 믹스의 5 μL, 10x VCP 프라이머의 1 μL, 및 1.4.1 단계에서 생성된 제 1 가닥 생성물의 1:10 희석의 4 μL을 추가한다.
    2. RT 필름으로 플레이트를 밀봉하고 스핀다운한 후 정량적 PCR(qPCR) 계측기로 로드합니다. 프로그램 실행 : 사전 앰프 : 1 주기 95 ° C 20s, 앰프 : 35 사이클 95 ° C 3 s (4.4 ° C / s 램프 속도) - 60 ° C 30s (2.2 ° C / s 램프 속도).
    3. 분석 NTC 및 반응 NTC 둘 다에 대한 사이클 임계값(Ct) 값의 부족을 확인합니다.
      참고: 분석 NTC에서 관찰된 Ct가 없다면 더 이상 분석에서 전달되지 않을 것이다. NTC 반응에서 Ct 값의 관찰은 Pre-Seq QC 분석법의 반복을 필요로 한다. 분석 기 NTC에서 Ct의 관찰은 분석의 앞에 어떤 시점에서 견본 오염을 건의합니다, 따라서 전체 분석 (모든 견본)를 다시 시작하기 를 요구합니다. 적절한 품질 샘플에 대한 Pre-Seq QC Ct 값은 30 미만이어야 합니다(낮은 Ct 값은 더 많은 제품과 상관 관계가 있으므로 고품질 RNA와 상관관계가 있습니다). 30을 초과하는 값은 실패의 절대 지표가 아니며 이러한 샘플은 분석에서 계속되어야 합니다. 그러나 이러한 샘플에서 파생된 모든 데이터는 특히 융합이 호출되지 않는 경우 신중하게 검토해야 합니다.
  6. 최종 수리 및 비드 정화
    1. 두 번째 가닥 생성물의 40 μL을 최종 수리 시약 스트립 튜브로 이송합니다(미리 냉각된 알루미늄 블록에 놓습니다). 6-8회 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고, 스핀다운하여 열자전거 블록(가열된 뚜껑을 열어 두기)에 넣고 열사이클러 프로그램을 실행합니다: 25°C 30분, 4°C 홀드.
    2. 4 °C에서 정제 비드를 제거하고 실온에 평형을 허용합니다. 전체 라이브러리 준비 기간 동안 지속되는 데 충분한 70% 에탄올을 구성하십시오. 소용돌이 구슬은 사용하기 전에 잘 U-바닥 플레이트의 웰의 적절한 수의 피펫 100 μL.
      참고: 실행되는 8개의 샘플마다 70% 에탄올의 20mL가 필요합니다.
    3. 최종 수리 제품의 전체 볼륨을 구슬에 추가합니다. 상하 6-8회 파이펫을 사용하여 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양한 다음 자석에 5분 간 배양을 합니다.
    4. 상급체를 제거하고 폐기하고 200 μL 70% 에탄올 세안2개를 30-s 배양으로 수행한다. 최종 세척 후 70 % 에탄올을 모두 제거하고 5 분 동안 공기건조시.
    5. 자석에서 제거하고 10 mM Tris HCl pH 8.0의 22 μL에서 구슬을 다시 일시 중단하십시오. 자석을 3분 간 인큐베이션한 다음 자석에 2분 간 배양합니다. 결찰 단계 1로 즉시 진행한다.
  7. 결찰 단계 1 및 비드 정제
    1. 최종 수리 비드 정제 플레이트로부터 20 μL을 이송 (비드 펠릿을 방해하지 않도록주의) 결찰 단계 1 스트립 튜브 (미리 냉각 된 알루미늄 블록에 배치). 위아래로 6-8 회 파이펫팅하여 혼합, 아래로 회전하고 96 웰 PCR 플레이트에 전체 볼륨을 전송합니다.
    2. 열전자전거 블록에 플레이트를 삽입하고 압축 패드로 덮고 뚜껑을 닫습니다. 열전자전거 프로그램 실행: 37°C 15분, 4°C 홀드(가열된 뚜껑).
    3. 4 °C에서 정제 비드를 제거하고 실온에 평형을 허용합니다. 소용돌이 구슬은 사용하기 전에 잘 U-바닥 플레이트의 웰의 적절한 수의 피펫 50 μL.
    4. 합리화 단계 1 제품의 전체 볼륨을 구슬에 추가합니다. 상하 6-8회 파이펫을 사용하여 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양한 다음 자석에 5분 간 배양을 합니다.
    5. 상급체를 제거하고 폐기하고 200 μL 70% 에탄올 세안2개를 30-s 배양으로 수행한다. 최종 세척 후 70 % 에탄올을 모두 제거하고 5 분 동안 공기건조시.
    6. 자석에서 제거하고 10 mM Tris HCl pH 8.0의 42 μL에서 구슬을 다시 일시 중단하십시오. 자석을 3분 간 인큐베이션한 다음 자석에 2분 간 배양합니다. 결찰 단계 2로 즉시 진행한다.
  8. 결찰 단계 2 및 비드 정제
    1. 4 °C 스토리지에서 분자 바코드 (MBC) 어댑터 스트립 튜브 시약을 제거합니다. 이 시점에서 샘플별 인덱스가 추가되기 때문에 MBC 어댑터 스트립의 적절한 번호 매기기는 매우 중요합니다. 힌지를 뒤로 경첩으로 수평으로 배치하고 영구 마커를 사용하여 튜브 1, 2, 3을 라벨링합니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 이동합니다. 또한 시퀀싱을 위해 샘플 별 인덱스를 기록하는 것이 중요합니다(시퀀서 워크시트에 입력해야 합니다).
    2. 결찰 단계 1 비드 정제 판으로부터 40 μL을 MBC 어댑터 스트립 튜브(미리 냉각된 알루미늄 블록에 배치)로 이송한다. 위아래로 6-8번 파이펫팅하여 섞으세요.
    3. 전체 부피를 아래로 회전시키고 결찰 단계 2 시약 스트립 튜브로 전달합니다 (또한 미리 냉각 된 알루미늄 블록에 배치). 6-8회 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고, 스핀다운하여 열전자전거 블록에 놓습니다. 가열 된 뚜껑을 끄면 열사이클러 프로그램을 실행하십시오 : 22 ° C 5 분, 4 ° C 홀드.
      참고 : 이것은 안전한 정지 지점이며 샘플은 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
    4. 4 °C 저장에서 결찰 정화 비드를 제거하고 실온에 평형화 할 수 있습니다. 신선한 5 mM NaOH 의 1 mL을 준비하십시오.
    5. 결찰 정화 구슬을 소용돌이시키고 새로운 PCR 스트립 튜브 세트에 50 μL을 추가합니다. 자석에 1 분 동안 배양하십시오. 1-min 인큐베이션 후 제거하고 상급을 폐기한다. 자석에서 스트립 튜브를 제거하고 6-8 회 위아래로 파이프팅하여 결찰 정화 버퍼의 50 μL에서 다시 일시 중단하십시오.
    6. 결찰 단계 2 생성물의 전체 부피를 결찰 정화 비드 스트립 튜브로 전달한다. 소용돌이에 의해 샘플을 혼합하고 5 분 동안 실온에서 배양. 다시, 소용돌이에 의해 샘플을 혼합하고 또 다른 5 분 동안 실온에서 배양. 두 번째 5 분 배양 후, 소용돌이에 의해 샘플을 혼합, 짧게 회전하고 1 분 동안 자석에 배양.
    7. 장식품을 제거하고 폐기하십시오. 200 μL의 결찰 정화 버퍼와 소용돌이를 추가하여 다시 일시 중단합니다. 빠른 스핀을 수행하고 1 분 동안 자석에 놓습니다. 결찰 정화 버퍼를 사용하여 두 번째 세척을 다시 수행하십시오.
    8. 결찰 정화 버퍼로 2개의 세척 후 초순수를 사용하여 동일한 세척을 수행한다. 초순수 세척에 이어 5 mM NaOH의 20 μL에서 구슬을 다시 중단하고 96 웰 PCR 플레이트로 옮긴다. 압축 패드와 써모 사이클러 블록에 플레이트를 배치하고 열 사이클러 프로그램을 실행 : 75 ° C 10 분, 4 ° C 홀드 (가열 뚜껑).
    9. 시료가 4°C로 냉각되면 PCR 플레이트를 스핀다운합니다. 플레이트를 자석에 3분 이상 놓고 즉시 첫 번째 PCR로 진행합니다.
  9. 최초의 PCR 및 비드 정제
    1. 첫 번째 PCR 시약 스트립 튜브를 4°C 저장소에서 제거하고 냉각된 알루미늄 블록에 놓습니다. 또한 GSP1 프라이머를 -20°C에서 제거하고 실온에 평형화할 수 있습니다.
    2. GSP1 프라이머 의 2 μL을 첫 번째 PCR 시약 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다. 결찰 2 클린업 생성물의 18 μL을 첫 번째 PCR 시약 스트립 튜브로 옮기고 6−8회 위아래로 파이펫팅하여 혼합한다.
    3. 스핀 다운 및 96 웰 PCR 플레이트로 전송합니다. 압축 패드와 써모 사이클러 블록에 플레이트를 배치하고 열 사이클러 프로그램을 실행 : 95 ° C 3 분, 15 사이클 95 ° C 30 s - 65 ° C 5 분 (100 % 램프 속도), 72 ° C 3 분, 4 ° C 홀드 (가열 뚜껑).
      참고: 이것은 안전한 정지 지점이며 시료는 하룻밤 동안 4 °C 또는 -20 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
    4. 4 °C에서 정제 비드를 제거하고 실온에 평형을 허용합니다. 소용돌이 구슬은 사용하기 전에 잘 U-바닥 플레이트의 웰의 적절한 수의 피펫 24 μL.
    5. 첫 번째 PCR 제품의 20 μL을 24 μL의 구슬로 옮김. 상하 6-8회 파이펫을 사용하여 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양한 다음 자석에 2분 간 배양을 합니다.
    6. 상급체를 제거하고 폐기하고 200 μL 70% 에탄올 세안2개를 30-s 배양으로 수행한다. 최종 세척 후 70 % 에탄올을 모두 제거하고 2 분 동안 공기건조시다.
    7. 자석에서 제거하고 10 mM Tris HCl pH 8.0의 24 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다. 자석을 3분 간 인큐베이션한 다음 자석에 2분 간 배양합니다. 즉시 두 번째 PCR로 진행합니다.
  10. 두 번째 PCR 및 비드 정제
    1. 두 번째 PCR 시약 스트립 튜브를 4°C에서 제거하고 미리 냉각된 알루미늄 블록에 놓습니다. 이 시점에서 샘플 별 인덱스가 추가되기 때문에 두 번째 PCR 스트립 튜브의 적절한 번호 매기기는 매우 중요합니다. 힌지를 뒤로 경첩으로 수평으로 배치하고 영구 마커를 사용하여 튜브 1, 2, 3을 라벨링합니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 이동합니다. 또한 GSP2 프라이머를 -20°C에서 제거하고 실온에 평형화합니다.
      참고: 시퀀싱을 위해 샘플 별 인덱스를 기록하는 것도 중요합니다(시퀀서 워크시트에 입력해야 합니다).
    2. 제2 PCR 시약 스트립 튜브의 각 웰에 GSP2 프라이머 2 μL을 첨가합니다. 첫 번째 PCR 클린업 제품의 18 μL을 두 번째 PCR 시약 스트립 튜브로 옮기고 6−8회 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.
    3. 스핀 다운 및 96 웰 PCR 플레이트로 전송합니다. 압축 패드와 써모 사이클러 블록에 플레이트를 배치하고 열 사이클러 프로그램을 실행 : 95 ° C 3 분, 18 사이클 95 ° C 30 s - 65 ° C 5 분 (100 % 램프 속도), 72 ° C 3 분, 4 ° C 홀드 (가열 뚜껑).
      참고: 이것은 안전한 정지 지점이며 시료는 하룻밤 동안 4 °C 또는 -20 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
    4. 4 °C에서 정제 비드를 제거하고 실온에 평형을 허용합니다. 소용돌이 구슬은 사용하기 전에 잘 U-바닥 플레이트의 웰의 적절한 수의 피펫 24 μL.
    5. 두 번째 PCR 제품의 20 μL을 구슬에 전달합니다. 상하 6-8회 파이펫을 사용하여 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양한 다음 자석에 2분 간 배양을 합니다.
    6. 상급체를 제거하고 폐기하고 200 μL 70% 에탄올 세안2개를 30-s 배양으로 수행한다. 최종 세척 후 70 % 에탄올을 모두 제거하고 2 분 동안 공기건조시다.
    7. 자석에서 제거하고 10 mM Tris HCl pH 8.0의 24 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다. 자석을 3분 간 인큐베이션한 다음 자석에 2분 간 배양합니다. 두 번째 PCR 클린업 제품의 20 μL을 새로운 96 웰 PCR 플레이트로 전송합니다.
      참고 : 이것은 안전한 정지 지점이며 라이브러리는 장기 저장을 위해 -20 °C에 저장하거나 라이브러리 정량화로 즉시 진행할 수 있습니다.
  11. 라이브러리 정량
    1. -20°C 저장에서 라이브러리 정량 마스터 믹스 및 표준을 제거하고 실온에 평형화할 수 있도록 한다.
    2. 10mMM Tris HCl pH 8.0을 사용하여 모든 라이브러리(두 번째 PCR 제품)를 1:5 희석한 다음 10mMM Tris HCl pH 8.0 000%를 사용하여 1:199, 1:199 및 20:80의 직렬 희석을 수행합니다. 마지막 두 개의 희석은 각각 1:200,000과 1,100,000에서 세 배로 실행됩니다.
    3. 광학 96 웰 플레이트의 각 웰에 6 μL의 마스터 믹스를 넣고 4 μL의 적절한 희석 또는 표준을 추가합니다. 플레이트를 스핀다운하여 qPCR 기기에 로드합니다. 다음 사이클링 조건을 사용: 1 주기 95 °C 5 분, 35 사이클 95 °C 30 s (4.4 °C/s 램프 속도) - 60 °C 45 s (2.2 °C/s 램프 속도).
    4. 라이브러리 정량화가 완료되고 라이브러리 농도가 결정된 후(두 테스트 된 희석을 모두 평균화하여) 10 mM Tris HCl pH 8.0을 사용하여 모든 라이브러리를 2 nM으로 정규화합니다. 각 정규화된 라이브러리의 10 μL을 하나의 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 결합하여 라이브러리 풀을 만듭니다.
  12. 라이브러리 시퀀싱
    1. 시퀀서 시약 카트리지를 -20°C 저장에서 제거하고 적어도 1 시간 동안 충진 선까지 탈이온화 (DI) 물에 놓습니다. 또한 시퀀서 시약 키트를 4 °C에서 제거하고 적어도 1 시간 동안 실온에 평형화 할 수 있습니다. 이 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱할 수 있는 최대 라이브러리 수는 8개입니다(그 중 하나는 양수 컨트롤이어야 합니다).
    2. 라이브러리 풀의 10 μL과 0.2 N NaOH의 10 μL을 결합하여 변성 앰플리톤 라이브러리 (DAL) 풀을 만들고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 5분 배양 후 200 mM Tris HCl pH 7.0의 10 μL을 추가하고, HT1 혼성화 버퍼의 970 μL이 뒤따랐다.
    3. 300 μL의 HT1, 20 pM PhiX의 25 μL 및 DAL 풀의 675 μL을 결합하여 최종 부하 튜브를 만듭니다. 소용돌이와 부하 튜브를 아래로 회전. 시퀀서 시약 카트리지의 샘플 웰에 로드 튜브의 전체 볼륨을 추가하고 2 x 151 bp읽기2 x 8 인덱스 읽기를 실행하는 시퀀서에 카트리지를 로드합니다.

2. 데이터 분석

  1. 데이터 처리 및 분석 시퀀싱
    1. NGS 계측기에서 시퀀싱 메트릭을 다운로드합니다.
    2. 시퀀싱 데이터가 아래 범위에 속하는지 확인합니다(이 예제에서 사용되는 키트에 따라 다릅니다). 클러스터 밀도(밀도 [K/mm2]): 945-1600 K; 읽기 통과 필터의 %(클러스터 PF [%]): >90%; 품질 점수 (% ≥Q30): >85%; PhiX 정렬(정렬%): 1.5-6.0%; PhiX 오류율(오류율 [%]): <1.0%; 통과 필터를 읽습니다(PF [M]을 읽습니다): >2,200만 개.
      참고: 이러한 메트릭을 충족하지 않는 시퀀싱 실행은 반복될 수 있습니다.
    3. 각 샘플(예: 각 샘플별 인덱스)에 기인하는 읽기의 %를 검토합니다. PhiX 스파이크인이 ~5% 및 8개의 샘플이 시퀀싱된 일반적인 실행의 경우 각 샘플은 판독의 약 11.9%를 이상적으로 고려해야 합니다. 각 샘플에 대한 허용 범위는 5-25%입니다. 샘플이 이 범위에 맞지 않으면 라이브러리 정량화 및 시퀀싱을 반복합니다.
  2. 원시 시퀀스 데이터를 분석 알고리즘에 제출
    참고: ArcherDx 분석의 버전 4.1.1.7은 여기에 설명되어 있습니다. 이 예제에서는 분석 소프트웨어가 내부 서버에서 실행되는 '가상 머신'으로 배포됩니다. 각 샘플을 동시에 분석하려면 중앙 처리 장치(CPU) 및 12GB의 임의 액세스 메모리(RAM)가 필요합니다(일반적으로 8개의 샘플은 8개의 CPU와 96GB RAM이 동시에 처리됩니다). 처리는 일반적으로 3-8 시간이 걸립니다.
    1. MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS(10에서 20으로 변경) 및 READ_DEPTH_NORMALIZATION(다운샘플링을 방지하기 위해 0으로 설정)를 제외하고 분석 시스템 내에서 기본 분석 설정을 사용합니다.
    2. 분석 작업을 시작하려면 사용자 인터페이스에서 분석 수행을 클릭하고 작업에 대한 이름을 제출한 다음 필요한 FASTQ 파일을 선택합니다(각 샘플에 대해 [R1 및 R2]를 모두 읽음).
    3. RNA 분석 유형에 대한 RNA 융합, 플랫폼용 일루미나(페어링) 및 대상 영역에 대한 FusionPlex 고형 종양 패널을 선택합니다. 그런 다음 분석제출을 클릭합니다.
  3. 분석 데이터 해석
    1. 분석 시스템의 사용자 인터페이스를 열고 원하는 작업을 선택합니다. 양수 제어 샘플을 선택합니다. 예상되는 모든 융합 및 내형성 이소폼이 검출되어 강력한 증거 탭에 나열되어 있는지 확인합니다.
      참고 : 양성 대조군에서 추적 된 융합 중 어느 것이 분석의 주어진 실행에 대해 검출되지 않으면 반복이 필요한 해당 실행에서 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다 (분석의 시작부터).
    2. 통계 읽기 탭을 클릭하여 실행의 각 임상 샘플에 대한 읽기 통계를 검사합니다. 각 샘플은 적어도 1백만 개의 총 조각으로 표현되어야 합니다. 1백만 개 미만인 경우 초기 정량이 지나치게 높지 않았는지 확인하기 위해 재정량화를 고려하여 라이브러리를 다시 순서를 지정합니다.
      참고 : 좋은 품질의 샘플은 일반적으로 대상 % >85 %에 표시되며 RNA 분자 저장소는 >20,000이어야하며 읽기의 >30 %를 구성해야합니다. 그러나 이러한 메트릭을 충족하지 못하면 샘플 오류가 자동으로 트리거되지는 않습니다.
    3. GSP2 제어 값당 평균 고유 시작 사이트를 검사합니다.
      참고: 이 값은 프라이머에서 4개의 하우스키핑 유전자에 이르기까지 복잡성을 시퀀싱하는 척도입니다. 이 메트릭은 샘플에서 RNA 품질의 중요한 결정요인입니다(시료에서 발현될 것으로 예상되는 유전자의 시퀀싱이 불량한 경우, 발현된 유전자 융합을 검출하는 능력에 대한 신뢰도가 낮습니다). 이 메트릭의 컷오프는 20입니다. 샘플에 값이 20 미만인 경우 높은 신뢰도 융합이 발견되지 않으면 샘플에 대한 결과를 유익하지 않은 것으로 보고해야 합니다. 이 메트릭의 상태는 실행의 요약 페이지에서도 결정될 수 있습니다(상태는 Fusion QC: Pass 또는 Fusion QC: 고유 RNA GSP2 제어 시작 사이트 수가 값이 20보다 크거나 20미만인지에 따라 낮음). 이 QC 메트릭을 통과하지 않은 샘플에서 높은 신뢰도 융합은 실제것으로 판단되는 경우에도 보고될 수 있습니다(아래 참조). 일반적으로 이 메트릭을 사용하는 높은 QC 점수는 예상대로 PreSeqCt 점수가 낮음과 상관 관계가 있습니다(그림 2).
  4. 퓨전 호출 해석
    1. 신중하게 강력한 증거 탭에서 모든 퓨전이라는 것을 면밀히 조사 (시스템에 의해 호출 된 강력한 증거 융합의 대부분은 artifactual입니다). 또한 약한 증거 융합 빈을 스캔, 이 빈에 비 관절 융합의 존재는 매우 드문 이벤트이지만. 융합의 유효성을 평가하려면 먼저 읽기(#/%) 및 사이트 시작 메트릭을 기록합니다.
      참고: 일반적으로 융합이라는 신뢰도는 이러한 메트릭이 높을수록 증가합니다. 5개 미만의 시작 사이트에서 지원되고 지원 프라이머에서 읽는 읽기의 10% 미만으로 지원되는 융합은 매우 의심스러운 것으로 간주되어야 합니다.
    2. 필터 열에 표시되는 아이콘을 기록합니다.
      참고: 이러한 아이콘 중 일부는 사용자에게 Artifactual 호출의 잠재적인 소스를 경고합니다. 이러한 중 빈번한 (그리고 주로 불린 융합의 약한 증거 빈에서 발견) 파트너가 알려진 paralogs 또는 순서대로 서로 유사성을 표시하는 경우입니다 (가능성이 잘못된 프라이밍 또는 잘못된 정렬을 나타내는). 또 다른 일반적인 아티프리얼 융합 호출의 소스는 융합을 지원하는 판독이 기준 게놈에 대한 잘못된 매핑을 나타내는 높은 오류율을 포함할 때 발생하며, 이것은 별개의 아이콘과 연관된다. 전사 읽기 이벤트는 다른 아이콘을 통해 식별됩니다. 이는 일반적이며 일반적으로 무시됩니다. 다른 여러 아이콘도 사용자 인터페이스에서 사용되지만 모든 아이콘에 대한 전체 설명은 이 문서의 범위를 벗어납니다. 일반적으로 추가 조사 없이 무시될 수 있는 일반적인 아티팩트는 다음과 같습니다: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAM-AT8 및 FCGR2C-MAST.
    3. 사용자 인터페이스에서 시각화 링크를 클릭하여 각 잠재적 융합에 대한 지원 읽기를 시각화하여 사용자가 개별 융합 지원 읽기의 더미를 웹 기반 JBrowse 보기로 이동합니다. 읽기가 일반적으로 불일치가 없는지 확인(일부 잡음이 예상되더라도), 판독값의 상당한 비율(이상적으로 >30 염기)이 융합 파트너에 정렬되고, 유전자 사이의 중단점에 바로 인접한 서열이 있는지 확인합니다. 및 프라이머 바인딩 사이트는 삽입 또는 삭제가 없습니다. 정렬된 서열이 융합 판독을 지원하는 프라이머에 대한 프라이머 결합 서열의 3' 부분을 포함한다는 것을 확인합니다(3' 부분이 포함되지 않은 경우, 잘못된 프라이밍의 표시일 수 있음).
    4. 두 유전자의 코딩 서열이 융합에 관여하는 경우, 3' 파트너가 프레임 내에 남아 있는지 확인하십시오. 인터페이스에서 번역 링크를 클릭하고(각 참조 시퀀스 조합에 대해 참 또는 거짓 상태를 지정함) 게놈 브라우저. 라는 중단점은 융합 회로도의 빨간색 점 위에 마우스를 마우스를 가져가서 결정할 수 있습니다.
      참고 : 합법적 인 융합에 대한 대부분의 게놈 중단점은 인트로닌 지역에서 발생하고 전체 엑소의 결합을 초래하기 때문에, 엑톤 경계가 두 파트너의 중단점을 구성하는 융합은 일반적으로 더 높은 정도로 볼 수 있습니다 자신감을 가질 수 있습니다. 그러나, 융합에 있는 중간 exonic 중단점의 많은 간행된 보기가 있기 때문에, 이것은 융합의 해석에 있는 절대 적인 기준으로 이용되어서는 안됩니다.
    5. 각 융합에 대해 중단점에 인접한 시퀀스가 각 파트너의 다음 예상 연속 베이스에 상동되지 않도록 수동으로 확인합니다. 게놈 브라우저에서 가능한 모든 연속 적인 엑온을 검사합니다.
      참고 : artifactual 융합의 일반적인 소스는 두 유전자 파트너 사이의 상동성으로 인해 정렬 불량 또는 잘못된 프라이밍이며, 이것은 항상 위에서 설명한 아이콘을 통해 시스템에 의해 호출되지 않습니다.

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결과

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도 3, 도 4 및 도 5에 도시된 것은 폐 선암 샘플로부터의 결과를 보여주는 분석 사용자 인터페이스로부터의 스크린샷이다. 도3에서 샘플 요약은 강력한 증거 융합이라고 불리는 강력한 증거 융합과 QC 상태(빨간색 원으로 동그라미)를 나열하는 표시(위)입니다. ADCK4-NUMBL 융합(3개의 등소폼이 나열됨)은 영구 전사 판독 이벤트이기 때문에 즉시 무시됩니다(목록 옆에 있는 깨진 원 아이콘으로 표시됨). 그림 3의 하단은 통계 읽기 페이지의 스크린샷입니다. 특히 유익한 지표는 녹색으로 동그라미로 표시됩니다. 샘플의 통과/실패 특성을 결정하는 중요한 QC 메트릭은 빨간색으로 강조 표시됩니다(위의 요약에서 합격/실패 상태를 지시하는 메트릭). 이 값이...

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토론

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고정된 멀티플렉스 PCR 기반 표적 농축 및 라이브러리 준비와 차세대 염기서열 분석이 임상 종양 샘플에서 다중유전자 융합 평가에 적합합니다. 게놈 DNA보다는 RNA 입력에 집중함으로써, 크고 반복적인 인트론을 서열화할 필요가 회피됩니다. 추가적으로, 이 접근은 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 증폭하기 때문에, 새로운 융합은 검출됩니다. 이는 임상 영역에서 중요한 이점이며, 문헌21,22,23,24에보고된 AMP를 통해 확인된 실행 가능한 새로운 유전자 융합의 많은 예가있었다. 25.

분석이 RNA 기반이기 때문에 처리 중에 샘플에서 RNA 품질을 보존하는 것이 중요합니다. ...

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공개 사항

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D.L.A.는 바이엘 종양학, 제넨테크, 애브비, 브리스톨 마이어스 스퀴브로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. K.D.D.는 ArcherDx로부터 후원 여행을 받았습니다.

감사의 글

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이 작품은 콜로라도 대학의 분자 병리학 공유 자원에 의해 지원되었다 (국립 암 연구소 암 센터 지원 보조금 번호. P30-CA046934) 및 개인 의학콜로라도 센터에 의해.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 mM Tris HCl pH 8.0IDT11-05-01-13TNA 희석에 사용
1M Tris pH 7.0Thermo FisherAM9850G라이브러리 풀링에 사용
분배기가 있는 25mL 시약 저장소USA Scientific9173-2000다중 채널 피펫 및 대용량 시약과 함께 사용
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-naturalUSA Scientific1402-9700thermocycler 단계에 사용되는 플레이트
Agencourt AMPure XP 비즈Beckman CoulterA63881여러 분석 단계 후 정제에 사용
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343TNA 추출에 사용
Archer FusionPlex Solid Tumor kitArcherDXAB0005이 키트에는 Illumina 염기서열분석을 위한 라이브러리 전처리를 수행하는 데 필요한 대부분의 시약이 포함되어 있습니다(Ion Torrent 염기서열분석용 키트도 사용 가능)Cold
block, 96-wellLight LabsA7079다양한 단계에서 샘플을 냉각시키는 데 사용
EthanolDecon LabsDSP-MD.43비드 세척에 사용
Illumina 내부 통제 표준Kapa BiosystemsKK4906라이브러리 정량화에 사용됨
라이브러리 정량화 프라이머 및 ROX Low qPCR 믹스Kapa BiosystemsKK4973라이브러리 정량화에 사용
라이브러리 정량 표준Kapa BiosystemsKK4903라이브러리 정량화에 사용
자석 플레이트, 96웰(N38 등급)AlpaquaA32782비드 정제 단계에 사용
MBC 어댑터 세트 BArcherDXAK0016-48멀티플렉스 염기서열분석을 가능하게 하는 시료별 인덱스를 포함하는 어댑터
Micro CentrifugeUSA Scientific2641-0016PCR 튜브를 스핀다운하는 데 사용
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 웰 플레이트Thermo-Fisher4483485Pre-Seq QClibrary 정량화에 사용
Microamp 광학 필름 압축 패드Applied Biosystems4312639라이브러리 정량화에 사용
Mini Plate SpinnerLabnet MPS-1000플레이트 웰 바닥에서 액체를 콜렉싱하는 데 사용
MiSeq 시약 키트 v3 (600 사이클)IlluminaMS-102-3003MiSeq 염기서열분석 실행에 필요한 구성 요소 포함
MiSeqDx 시스템IlluminaNGS 염기서열
분석 기기 모델 9700 ThermocyclerApplied Biosystems여러 단계에 사용됩니다. 분석
뉴클레아제 자유 물Ambion9938일반 희석제로 사용
광학 ABI 96-well PCR 플레이트는Thermo-Fisher4311971사전 seq QClibrary 정량 분석에 사용
PCR 워크스테이션 모델 600공기 청정 시스템BZ10119636이 '데드 에어 박스'에서 수행되는 습식 벤치 분석 단계
Proteinase KQiagen1019499사용 TNA 추출에서
PreSeq 및 라이브러리 정량화에 사용되는 QuantStudio5Applied BiosystemsLSA28139
Qubit RNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32855TNA 샘플의 RNA 농도 측정에 사용
RNase AwayFisher12-402-178작업 영역의 일반 RNase 오염 제거에 사용
Seraseq FFPE 종양 융합 RNA 참조 물질 v2SeraCare0710-0129분석 양성 대조군으로 사용
수산화나트륨FisherBP359-212세척 단계 및 염기서열분석 설정에 사용
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120PreSeq QC 분석
TempAssure PCR 8-튜브 스트립USA Scientific1402-2700시약 및 샘플 혼합 등에 사용됩니다.
템플릿 RT PCR 필름USA Scientific2921-780096웰 플레이트
U-하단 96웰 마이크로플레이트LSPMP8117-R비드 정제 시 사용
에 대한 라이브러리 정량화 qPCR 기기

참고문헌

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