박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

요약

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

초록

박테리아에 있는 세포 분열 그리고 세포 모양에 영향을 미치는 요인의 조사는 인구 수준에서 행해진 관측이 진정으로 단 하나 세포 수준에서 일어나는 무슨을 반영하지 않을 수 있기 때문에 고해상도 형광 현미경 검사법과 함께 일반적으로 수행됩니다. 살아있는 세포 시간 경과 현미경 검사법은 잠재적으로 중요한 생물학 질문에 대답하는 것을 돕기 위하여, 일어나는 단백질의 세포 외 현지화 및 유전자 발현의 타이밍에 관하여 귀중한 통찰력을 제공하는 세포 분열 또는 세포 형태학에 있는 변경을 감시하는 것을 허용합니다. 여기에서, 우리는 고해상도 데콘볼루션 현미경을 사용하여 바실러스 subtilis 및 황색포도상구균에 있는 표현형 변경을 감시하기 위하여 우리의 프로토콜을 기술합니다. 이 보고서의 목적은 박테리아뿐만 아니라 다른 유기체에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 형광 현미경 실험을 수행에 관심이다른 조사자에 의해 채택 될 수있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서론

세균성 세포 생물학의 필드는 현미경 기술^1,2에있는 최근 발전에 의해 현저하게 향상되었습니다. 다른 기기 들 중에서도 타임랩스 형광 현미경 실험을 수행할 수 있는 현미경은 여전히 귀중한 도구입니다. 연구원은 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 전사 및 번역 기자 융합, 형광 D 아미노산 (FDAA)^3,또는 세포벽, 막 및 DNA를 라벨링하기 위한 다른 얼룩을 사용하여 다양한 생리적 사건을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은 미생물 세포 생물학자 중 인기를 유지하는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 단순히 말기 표현형을 보여주는 것 이외에, 타임랩스 현미경을 사용하여 관찰된 표현형이 어떻게 발생하는지에 대한 정보를 제공하는 것은 연구 결과에 상당한 가치를 더할 수 있으며 잠재적으로 어떤 세포 과정이 잠재적 약물 후보에 의해 표적으로 되고 있는지에 대한 단서를 제공할 수 있다^4.

완전 전동, 반전, 광시야 형광 현미경을 사용하여 고해상도 이미징을 수행하는 프로토콜(재료 표참조)이 이 문서에서 제공됩니다. 이 프로토....

프로토콜

1. 일반적인 성장 조건

1. 항생제로 보충된 적절한 성장 배지의 2 mL을 접종(필요한 경우) 스트레인의 단일 콜로니와 함께 이미지화한다. 이러한 종자 배양물을 22°C에서 밤새 교양하여 인큐베이터에 배양하였다.
   참고: 이 문서에서 사용되는 특정 박테리아 성장 조건은 대표 결과 섹션에 제공됩니다.
2. 125 mL 플라스크에서 신선한 매체에 하룻밤 배양액을 희석하고 항생제 (필요한 경우)로 보충하십시오.
3. 37°C에서 37°C에서 배양물을 중장악기 상까지 성장시다(OD₆₀₀ = 0.5).
   참고: 유도제 또는 억제제는 적절한 성장 단계에서 성장 배양에 직접 첨가될 수 있다.
4. 다음 절에 기재된 바와 같이 현미경 시료 준비를 위한 원하는 배양 조건에서 세포를 수확한다.

2. 견본 준비

1. 분자 생물학 등급 0.25 g, 낮은 EEO, agarose와 25 mL의 성장 배지를 적절한 항생제 (필요한 경우)와 결합하여 1 %의 아가로스를 준비하십시오. 전자 레인지의 도움으로 약 30s의 도움으로 혼합물을 가열하고 멸균 100mm x 15mm 페트리 접시에 부어 고체하게하십시오.
2. 필요에 따라 세포 배양의 5-50 μL a....

결과

GpsB 표현형
이전에 우리는 Sa-GpsB가 세포 용해^9에서안티 센스 RNA 결과를 사용하여 GpsB의 고갈로 필수적인 단백질임을 보여주었습니다. 여기에서 우리는 이 문서에서 기술한 타임랩스 현미경 프로토콜을 사용하여 단백질 국소화에 있는 각종 세포 분열 표현형 그리고 변경의 출현이 어떻게 붙잡을 수 있었다는 것을 기술합니다. 이를 위해, S. 아우레우스 균주 RB143 [SH1000 +pEPSA5 (빈 벡터)] 및 GGS8 [SH1000 +pGG59_(Pxyl-gpsB^안티센스블라 고양이)]이전에 보고된^9,다음과 같이 성장하였다. 균주 RB143 및 GGS8은 15 mL 시험관에서 5 μg/mL 클로람페니콜(클로르)으로 보충된 트립틱 대두 국물(TSB)의 2 mL에서 접종하고.......

토론

현미경 검사법은 미생물 유기체에 관련된 연구 결과에 있는 주류를 남아 있습니다. 그들의 미크론 규모 세포 크기를 감안할 때, 단세포 수준 연구 결과는 전통적으로 전자 현미경 검사법 (EM)에 의존했습니다. EM은 최근 몇 년 동안 매우 강력한 기술이되었지만 제한된 사용자 액세스¹⁶외에도 고유의 고유한 제한 사항이 있습니다. 형광 현미경 기술의 개선과 FDAA^3와같은 다른 형광 프로브의 개발은 미생물 세포 생물학자에게 살아있는 세포에서 다양한 세포 과정을 연구할 수 있는 방대한 도구를 제공했습니다. 연구원은 또한 활발하게 살아있는 세포에 있는 다른 사람의 사이에서 c-di-GMP와 같은 신호 분자의 수준에서, 예를 들면 변경을 감시하기 위하여 형광^{공구를,17,18를}건설하고 있습니다. 또한 고해상도 타임랩스 형광 현미경 검사법은 조사자가 일어나.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	분자 생물학 등급 - 낮은 EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	현미경
FM4-64	Invitrogen	T3166	현미경
유리 바닥 접시	MatTek	P35G-1.5-14-C	현미경
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	다이옥산 프리
현미경	GE	DeltaVision Elite	맞춤형 Olympus IX-71 도립 현미경 스탠드; 맞춤형 조명 타워 및 투과광 조명 모듈. 대물렌즈: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15mm); 올리 100X 오일(N.A. 1.4, WD 0.12mm); 100X 대물렌즈를 위한 DIC 프리즘 Nomarski; CoolSnap HQ2 카메라; SSI 어셈블리 7 색; 환경 제어 챔버 - 불투명.
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