Method Article

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 침투 및 공간 조직의 분석을 위한 손상되지 않은 조직의 미세 환경 평가는 질병 과정의 복잡성을 이해하는 데 필수적입니다. 과거에 사용된 원리 기술은 1과 4 마커 사이를 사용하여 시간에 스냅샷으로 세포의 가시화를 가능하게 하는 면역성 결합 (IHC) 및 면역 형광 (IF)를 포함합니다. 두 기술 모두 불량 항원 표적 염색 어려움 및 종 간 반응성과 관련된 한계를 포함한 단점이 있습니다. IHC는 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 화학의 특성과 가시광선 스펙트럼에 대한 의존도는 소수의 마커만 사용할 수 있게 해주며 공동 현지화를 어렵게 만듭니다. IF의 사용은 잠재적인 마커를 넓히지 만 일반적으로 포르말린 고정 다음 광범위한 조직 자가 형광으로 인해 냉동 조직에 의존합니다. 유세포분석법은 여러 에피토프의 동시 라벨링을 가능하게 하는 기술로, IF와 IHC의 많은 결핍을 폐지하지만, 단일 세포 현탁액으로 세포를 검사할 필요성은 중요한 생물학적 제제를 버리는 세포의 공간적 맥락을 상실한다. 관계. 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 이러한 기술을 통해 전체적인 미세환경 구조및 공간적 구조를 보존하면서 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에서 다중 에피토프 세포 자형질짝을 허용합니다. 그대로 중단되지 않은 조직 내의 세포의 관계. 조직 에피토프에 공유적으로 결합하는 높은 형광 강도 형광은 이차 항체에 의한 종 특정 교차 반응성에 대한 걱정없이 1 차 항체의 여러 응용 프로그램을 가능하게합니다. 이 기술은 질병 연구를 위해 신뢰할 수 있고 정확한 이미지를 생성하는 것으로 입증되었지만, 유용한 mfIHC 염색 전략을 만드는 과정은 광범위한 최적화 및 설계로 인해 시간과 정확할 수 있습니다. 현장에서 정확한 세포 상호 작용을 나타내는 견고한 이미지를 만들고 수동 분석을 위한 최적화 기간을 완화하기 위해 슬라이드 준비, 항체 최적화, 멀티플렉스 설계 및 오류를 위한 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 염색 과정에서 일반적으로 발생합니다.

Introduction

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손상되지 않은 종양 미세 환경 (TME)의 가시화는 고체 악성종양에서뿐만 아니라 세포 상호 작용에 세포 침투뿐만 아니라 세포 침투를 평가하는 데 필수적입니다. 멀티플렉스 형광 면역성화학(mfIHC)은 암 및 관련 질환의 연구에서 세포의 다항원 자형질에 효과적인 도구로부상하고 있다 1,2,3,4, 5,6,7. 이것은, 큰 데이터 세트를 분석하도록 설계된 새로운 소프트웨어 및 프로그램과 결합하여, 세포 사이의 복잡한 상호 작용의 관찰을 가능하게1,2,4. 데이터 수집의 속도 제한 요인은 종종 분석 전에 염색된 조직의 품질입니다.

TME에 있는 표현형 세포에 이용된 이전....

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Protocol

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모든 작업은 미시간 대학의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 1 차 항체 및 슬라이드 준비 최적화

  1. 기존의 IHC를 사용하여 멀티플렉스용 항체의 이상적인 농도를 결정합니다.
    1. 기존의 면역화학(IHC) (IHC)13을수동하여 멀티플렉스에 대한 항체를 시험한다.
    2. CD3 항체 시험을 위해 편도선 조직을 사용하는 것과 같이 시험된 각 항체를 위한 풍부한 세포 모형이 있는 특정 조직을 사용하십시오.
    3. 회사에서 권장하는 IHC에 대한 기준 농도를 사용한 다음 권장 농도 와 권장 농도 이하의 농도에서 항체 농도로 IHC를 완료하십시오.
  2. 슬라이드에 포르말린 고정 파라핀 내장 조직을 준비합니다.
    1. 마이크로토메를 사용하여 FFPE 조직의 블록을 4~6 μm 두께로 자르고 충전된 슬라이드에 적용합니다.
      참고: 증류수를 사용하면 멀티플렉스 전체에 적절한 조직 장착 및 준수가 보장됩니다.
    2. 슬라이드를 평평하게, 티슈 쪽을 위로 올려 놓고, 밤새 37°C에서 건조시키십시오.
    3. 멀티플렉스를 완료할 준비가 될 때까지 슬라이드 상자에 극단적인 온도에서 멀리 보관하십시오.

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Results

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7색 멀티플렉스 분석법획득의 전체적인 과정은 반복적인 패턴을 따른다. 그림 1은 다이어그램 형식으로 프로세스를 설명합니다. 일단 슬라이드가 절단되고 건조되거나 실험실에서 수신되고 60°C에서 혼성화 오븐에서 1시간 동안 구운 후, 탈파피화 및 재수화를 진행한 다음, 다시 포르말린에서 슬라이드를 고치고 항원 회수에 이어 다시 고쳐낸다. 다중화의 각 라운드는 항원 회수에서 시작하고 항체제거에서 끝납니다 (그림 1).

프로세스의 각 단계를 최적화하는 것은 명확하고 사용 가능한 이미지를 달성하는 데 가장 중요합니다. 항체는 특정 항체와 가장 잘 작동하는 항원 회수 완충액을 가시화하기 위하여 각 항체를 위한 pH 6 및 pH 9를 가진 항원 회수 완충장치를 사용하여 IHC에 의해 첫째로 시험되어야 합니다. 일반적으로 핵 표적은 완충제 pH 9로 항원 검색에 반응한다. 예를 들어, F.......

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Discussion

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고형 종양 생검 및 외과 절제술에서 온전한 조직 견본은 환자 예후 뿐만 아니라 질병 분석을 위한 중요한 진단 그리고 예측 공구 남아 있습니다. 멀티플렉스 형광 면역히스토화학(mfIHC)은 면역성화학(IHC), 면역형광(IF) 및 유세포분석의 이점을 결합한 새로운 기술이다. 이전에는 세포가 있는 장소에서 세포를 프로브하는 방법들은 조직 환경에서 세포 간배열의 평가를 허용하였다 8, 그러나, 조사될 수 있는 에피토프의 수가 적어 복잡한 분석이 제한된다. 유세포분석은 시편에서 많은 세포 유형을 분석하는데 유용하지만, 단일 세포 현탁액으로 샘플을준비하는 덕택에 공간적 맥락을 잃는다 9,10. mfIHC는 이러한 기술을 세포 미세 환경의 공간 적 맥락을 유지하고 표지된 에피토프(11)당 신호를 증폭시키면서라벨링할 수 있는 에피토프의 수를 증가시킴으로.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 원래 멀티 플렉스 얼룩의 설정 및 최적화에 대한 그의 도움, 퍼킨 엘머에서 이전에 에드 스택에 감사드립니다. 저자는 또한 분석 소프트웨어를 사용하여 팁 아코야 바이오 사이언스에서 크리스틴 슈미트에게 감사하고 싶습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 암 학회에 의해 지원되었습니다, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA1515807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 추가 지원은 제프리 A. 콜비 결장암과 톰 리우 기념 연구 기금에 의해 제공되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% 에탄올FisherHC8001GAL
70% 에탄올FisherHC10001GL
95% 에탄올FisherHC11001GL
분석 소프트웨어Akoya BiosciencesCLS135783inForm 버전 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong Diamond
Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
소 혈청 알부민(BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
커버 슬립Fisher12-548-5E
섬세한 작업 와이프Kimberly-Clark34120
형광 희석제Akoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA 희석제
Fluorophore 520Akoya 생명과학FP1487001KT1:100
형광단 540아코야 생명과학FP1494001KT1:100
형광단 570아코야 생명과학FP1488001KT1:100
형광단 620아코야 생명과학FP1495001KT1:100
형광단 650아코야 생명과학FP1496001KT1:100
형광단 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
형광단 DAPIAkoya BiosciencesFP1490TBST 또는 PBS
내열 상자에Tissue-Tek25608-904플라스틱 슬라이드 박스-녹색
가습 챔버Ibi ScientificAT-12
혼성화 오븐FisherBiotech
소수성 배리어 펜VectorH-4000ImmEdge
현미경Perkin ElmerCLS140089Mantra 정량 병리학 워크스테이션
마이크로파PanasonicNN-A661S인버터 기술
Fisher ScientificSF100-410% 중성 완충 포르말린
pH 6 항원 검색 완충액Akoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 항원 회수 버퍼Akoya BiosciencesAR900AR9
인산염 완충 식염수FisherBP3994PBS
플라스틱 슬라이드 박스Tissue-Tek25608-906
플라스틱 랩FisherNC9070936
폴리소르베이트 20FisherBP337-800트윈 20
기본 항체 CD163LeciaNCL-LCD1631:400
1차 항체 CD3DakoA04521:400 1차
항체 CD8Spring BioM53901:400 1차
항체 FOXP3DakoM35151:400
1차 항체 판시토케라틴세포 신호 126531:500
1차 항체 PD-L1세포 신호136841:200
2 차 항체Akoya BiosciencesARH1001EA오팔 폴리머
슬라이드 염색 세트전자 현미경 과학6254001
Tris 완충 식염수Corning46-012-CMTBS
수직 슬라이드 랙전자 현미경 과학50-294-72
XyleneFisher
3방울 X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

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