여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.
서론
DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다
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프로토콜
모든 동물 절차는 절강 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 신경 줄기 세포와 뉴런의 문화
- 성인의 전뇌로부터 성체 신경줄기세포를 분리(8-10주령) C57/BL6 수컷 마우스는 앞서31,32.
- 배양 성인 신경 줄기 세포DMEM/F-12 배지에서 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 보충제, 1% 항생제 항마이코제, 및 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2 mML-글루타민을 함유한다. 앞서 설명한바와같이 48시간 동안 1 μM 레티노산 및 5 μM 산림을 가진 성인 신경 줄기 세포의 분화를유도한다.
- 배아일17(E17)으로부터 뉴런을 0.25% L-글루타민, 0.125% 글루타맥 및 2% B27 보충제를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 함유하는 신경기질 배지로 마우스 및 배양물의해마를 33.
2....
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결과
성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 분포를 밝히기 위해, 우리는 신경 세포 (NeuN) 및 5-hmC에 대한 항체로 면역 형광을 수행했습니다. 해마에서, 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN(그림1A-H)과잘 국소화되어 뉴런에서 5-hmC의 농축을 시사한다.
신경 발달 도중 5-hmC의 역학을 결정하기 위하여는, 점 얼룩은 증식하고 분화한 성인 신경 줄기 세포 (NSC)에서 분리된 DNA 견본으로 처음으로 수행되었습니다. 도트-블롯 결과는 NSC의 분화 동안 5-hmC의 글로벌 수준이 유의히 증가하였다(도2A-B). 또한, 도트-블롯 결과는 뉴런에서 5-hmC의 수준이 신경 세포 발달 동안 동적 5-hmC 변형을 시사하는 NSC(도2C-D)보다유의한 것으로 나타났다.
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토론
후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실에 있는 일반적인 장비로 수행될 수 있던 세포 와 조직에서 5-hmC를 검출하는 2개의 편리한 방법을 설명했습니다.
면역형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 통해 5-hmC 검출의 주요 시약은 5-hmC 항체이다. 이 방법에 사용된 5-hmC 항체는 높은 감도를 가지며 매우 특이하다는 것이 입증되었다. 5-hmC 염색을 위해, 그것은 HCl를 가진 DNA 변성 필요. HCl을 가진 조직 그리고 세포의 적당한 처리는 완전한 DNA 변성을 위해 중요하고 결과에 영향.......
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공개 사항
경쟁적인 재정적 이해관계는 존재하지 않습니다.
감사의 글
XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4'-6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) | 시그마-알드리치 | D8417 | |
| 어도비 포토샵 소프트웨어 | 어도비 Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 염소 안티 마우스 IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| 안티-5-하이드록시메틸시토신 | 활성 모티프 | 39769 | |
| 안티 NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 보충제 | Gibco | 12587-010 | |
| B27 보충제 | Gibco | 12580-010 | |
| B27 보충제 | Gibco | 17504-044 | |
| 저온 유지 장치 마이크로톰 | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 매체 | OmegaScientific | DM25 | |
| 표피 성장 인자 | PeproTech | 100-15 | |
| 섬유아세포 성장 인자-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+) | Amersham Biosciences | ||
| 10월 | 라이카 | 14020108926 | |
| 펜 스트렙 | Gibco | 15140-122 | |
| 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 (25: 24:1 | 시그마-알드리치 | 516726 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마 | P0899-10 | |
| 단백질분해효소 K | VVR | 39450-01-6 | |
| 레티노산 | 시그마-알드리치 | R2625 | |
| 트리톤 X-100 | 솔라바이오 | T8210 |
참고문헌
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
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재인쇄 및 허가
