이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.
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방법 논문
예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
근본적인 질병의 발달을 위한 세포 기계장치를 정의하는 것은 새로운 치료법의 발달을 위해 필수적입니다. 이 기계장치를 해명하기 위하여 빈번하게 이용되는 전략은 후보 유전자에 있는 돌연변이를 소개하고 조직과 세포 기관의 형태에 있는 변경을 질적으로 기술하기 위한 것입니다. 그러나, 질적 설명은 미묘한 표현형 차이를 포착하지 않을 수 있습니다, 인구에있는 개인에 걸쳐 표현형 변화를 잘못 표현 할 수 있습니다, 자주 주관적으로 평가된다. 여기서, 정량적 접근법은 시판되는 생체 이미지 처리 소프트웨어와 결합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 선충 제대인 예쁜꼬마선충에서 조직 및 소기관의 형태를 연구하기 위해 기술된다. 시냅스 무결성에 영향을 미치는 표현형의 정량적 분석(크기 및 통합 형광 수준), 근육 발달(근육 세포 크기 및 미오신 필라멘트 길이), 미토콘드리아 형태(원형 및 크기)를 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 세포 구조에 유전 돌연변이의 효력. 이러한 정량적 접근법은 선충뿐만 아니라 다른 모델 유기체에서 다른 조직 및 세포기관의 형태를 정량적으로 평가하는 데 쉽게 사용될 수 있기 때문에 여기에 기술된 응용 분야에 한정되지 않는다.
서론
선충 제 Caenorhabditis (C. 예쁜 꼬마)는 점점 인간 질병에 관련 된 생물학적 및 분자 과정을 밝히기 위해 모델 시스템으로 활용. 성인 선충은 몸 길이가 1mm에 불과하며 최대 300 개의 계란1의 큰 무리를 생성 할 수 있습니다. 부화 후, C. 예쁜 꼬마는 성인기에 도달하는 데 3-4 일이필요하며 2 주 에서 2 주 정도 살 수 있습니다. 배양의 용이성 으로 인해, C. elegans는 현재 인간 질병에 대한 치료법을 식별하기 위해 비용 효율적이고 신속한 약물 스크리닝을 수행하기위한 생체 내 동물 모델 중 가장 인기있는 모델 중 하나입니다. 또한, 그것의 유전 보존, 잘 정의 된 행동 패러다임, 형광 또는 가벼운 현미경 검사법에 대한 투명한 몸, 유전 조작의 용이성은 쉽게 유전자 돌연변이의 세포 및 분자 결과의 연구를 쉽게 달성 할 수 3. C. elegans 게놈은 인간 유전자와 약 60-80 %의 정형 외과를 공유하며, 그 유전자의 약 40 %는 질병과 관련된 것으로 알려져 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서 모델링되고 연구된 몇몇은 신경퇴행성 질환 (....
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프로토콜
1. C. 예쁜꼬마선충 균주의 성장 및 유지 보수
- 종자 전충 성장 배지 (NGM, 재료표참조) 층류 캐비닛에서 천천히 성장하는 대장균 균주 OP50의 300 μL을 가진 한천 플레이트.
- NGM 한천 플레이트를 라미나 흐름 캐비닛에 두고 건조시면 됩니다.
참고 : 층류 캐비닛이없는 경우, 플레이트는 벤치에 건조 남아있을 수 있지만 오염하는 경향이있다. - 적어도 20마리의 동물을 OP50 시드 NGM 한천 플레이트 2개에 각각 옮겨 작업 재고를 갖도록 한다. 동물을 옮기는 방법에는 두 가지가 있습니다.
- 따기: 열 멸균 픽을 사용하여 동물을 부드럽게 들어 올립니다. 이 방법은 한천 판에서 개별 또는 여러 동물을 선택하는 데 효과적입니다. 따기 때 팁에 박테리아의 작은 긁힌 자국을 갖는 것은 전송하는 데 도움이됩니다.
참고 : 선택은 유리 파이펫에 내장 된 약 4cm 길이의 백금 와이어의 작은 조각으로 만들어지며 와이어 팁은 '창처럼'평평해져 있습니다. 교차 오염을 방지하기 위해 피킹 사이의 선택을 열 멸균하십시오. - 청크: 멸균 된 주걱을 사용하여 한 접시에서 동물을 포함하는 한천의 작은 사각형을 자르고 거꾸로 새 접시로 옮김.
참고 :....
- 따기: 열 멸균 픽을 사용하여 동물을 부드럽게 들어 올립니다. 이 방법은 한천 판에서 개별 또는 여러 동물을 선택하는 데 효과적입니다. 따기 때 팁에 박테리아의 작은 긁힌 자국을 갖는 것은 전송하는 데 도움이됩니다.
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결과
C. 예쁜꼬마선충은 단순성, 알려진 세포 계수, 투명성 및 사용 가능한 도구로 인해 다양한 조직 및 세포기관의 형태를 연구하기위한 이상적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 살아있는 형광 이미징 및 무료 생체 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 시냅스와 근육을 포함한 세포기관(예: 미토콘드리아) 및 조직을 연구하기 위한 정량적 접근법을 제공합니다.
MEC-17 발현의 엄격한 규제는 정상적인 시냅스 개발을 위해 필요합니다.
신경계에서 알파-튜툴린 아세틸-트랜스퍼라제 MEC-1714,15,16의 기능을 더 이해하기 위해, 우리는 단백질17을과발현하는 C. elegans의 <.......
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토론
형태학적 변화는 눈에 띄는 차이의 수동 계산을 통해 자주 평가되거나 야생 형 표현형에 비해 결함을 결정하기 위해 임의의 임계값을 사용하여 평가되었습니다. 그러나 최근에는 형태학의 비교 연구를 통해 세포 및 세포 내 하위 수준변화를 편견 없는 방식으로 정확하게 측정하고 설명하는 정량적 방법이 사용되고 있습니다. 표현형 간의 미묘하면서도 생물학적으로 관련된 차이를 식별하는 능력은 환경 적 요인이나 유전 질환으로 인한 형태학의 변화를 제어하는 기본 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 수단입니다. C. elegans 유전학의 성장용이성과 다기능성과 결합된 계산 능력 및 현미경 이미징 해상도의 지속적인 증가는 정교하면서도 자유로운 이미징 소프트웨어의 조합을 위한 완벽한 플랫폼을 제공했습니다. 섬세한 공초점 이미지로. 여기에서, 우리는 시냅스 크기 및 단백질 국소화, 신체 벽 근육 지역 및 섬유 길이 및 다양한 유전 적 배경에서 미토콘드리아 형태를 평가하고 정량화하는 방법을 입증했습니다.
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
노이만 연구소의 회원들에게 귀중한 토론과 의견을 주신 것에 감사드립니다. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 저자는 C. 예쁜 꼬마에대한 풍부한 정보에 대한 WormBase 감사, 모나시 마이크로 이미징인정, 모나시 대학, 계측의 제공에 대한, 교육 및 기술 지원. 이 작품은 CMTAA 연구 보조금 (2015 및 2018)에 의해 지원되었으며, NHMRC 프로젝트 보조금 1101974 및 1099690 B.N에 수여.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천 | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 컨포칼 현미경 | Leica | TCS SP8 | 도립 플랫폼 |
| 형광 현미경 | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass 커버슬립 #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| 유리 슬라이드 | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| 스테레오 현미경 | Olympus | SZ51 | |
| 트립톤(카제인의 펩톤) | Merck | 107213 | 용해성 육수(LB) 배지 |
| 효모 추출물 성분 | Merck | 103753 | Lysogeny Broth(LB) 매체 |
| 염화나트륨 | Merck | 106404 | 원료 Lysogeny Broth(LB) 매체 |
| 펩톤(육류의 펩톤) | Merck | 107214 | 선충 성장 배지(NGM) 한 |
| 천 Sigma | A1296 | 성분 선충 성장 배지(NGM) 한천 | |
| 나트륨 | 성분Merck | 106404 | 선충 성장 배지(NGM) 성분 |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8667-25G | 선충 성장 배지(NGM) 성분 한천 |
| 염화칼슘 | Merck | 102382 | 선충 성장 배지(NGM) 성분 한천 |
| 황산마그네슘 | Merck | 105886 | 선충 성장 배지(NGM) 원료 한천 |
| 인산이칼륨 | Merck | 105101 | 선충 성장 배지 (NGM) 성분 한천 |
| 이수소 인산염 머 | 크 | 104873 | 선충 성장 배지 (NGM) 원료 한천 |
| 인산이 나트륨 | 머크 | 106586 | M9 완충 |
| 액 성분 염화나트륨 | 머크 | 106404 | M9 완충 |
| 산 | 이수소 칼륨Merck | 104873 | M9 완충 |
| 산 마그네슘 | Merck | 105886 | M9 완충 |
| 원료 파스퇴르 피펫 | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| 페트리 접시 | Corning | CLS430589-500EA | |
| 플래티넘 와이어 | Sigma | 267201-2G | |
| 주걱 | Met-app | 2616 | |
| 테트라미솔 염산염 | 시그마 | L9756-5G |
참고문헌
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M.
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재인쇄 및 허가
