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방법 논문

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

26.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59999

⸱

2019년 7월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.

초록

리포폴리사카라이드(LPS)의 기도 투여는 작은 동물 모델에서 폐 염증 및 급성 폐 손상(ALI)을 연구하는 일반적인 방법이다. 에어로졸화된 LPS의 흡입뿐만 아니라 비강 또는 내외 주입과 같은 다양한 접근법이 기술되었다. 제시된 프로토콜은 직접적인 경질 LPS 주입에 의해 마우스에서 ALI를 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥세척기(BAL) 유체 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하는 상세한 단계별 절차를 기술한다. 복강 내 침전 후, 기관노출 및 LPS는 22 G 정맥 카테터를 통해 투여된다. 백혈구 침략을 가진 강력하고 재현 가능한 선동적인 반응, 전염증성 사이토카인의 upregulation, 및 alveolo-모세관 방벽의 중단은 사용된 LPS 복용량에 따라서, 일 에서 일 안에 유도됩니다. FACS 분석을 위한 처리뿐만 아니라 혈액 샘플, BAL 유체 및 폐 수확의 수집은 프로토콜에 상세히 기술되어 있다. 멸균 LPS의 사용은 전염병에 있는 약리학적 내정간섭을 공부하기 위하여 적당하지 않더라도, 기술된 접근은 기계론적 면역학 질문에 대답하기 위하여 최소한의 침략, 간단한 취급 및 좋은 재현성을 제안합니다. 더욱이, 용량 적정뿐만 아니라 대체 LPS 제제 또는 마우스 균주의 사용은 임상 적효과의 변조를 허용하며, 이는 다른 정도의 ALI 심각도 또는 질병 증상의 조기 발병을 나타낼 수 있다.

서론

실험동물 모델은 기본적인 면역 연구에서 없어서는 안 될 존재입니다. 전체 박테리아 또는 미생물 성분의 투여는 국소 또는 전신 염증을유도하기 위해 작은 동물 모델에서 자주 사용되어 왔다 1. 리포폴리사카라이드(LPS, 또는 세균 내독소)는 그람 음성 박테리아의 세포벽 성분 및 표면 항원(예를 들어, 장내세균, 슈도모나스 종, 또는 레지오넬라 종)이다. 열안정 및 대형 분자(분자량 1-4 x 106 kDa)는 지질 모에티(Lipid A), 코어 영역(올리고사카라이드) 및 O 다당류(또는 O 항원)로 구성된다. 지질 A는 소수성 지방산 사슬을 가진 분자를 세균 막에 고정시키고 LPS의 면역 학적 활성 과 독성을 (박테리아의 분해 시)합니다. LPS 결합 단백질 (LBP)에 결합 한 다음, LPS : LBP 복합체는 많은 세포 유형의 표면에위치한 CD14 / TLR4 / MD2 수용체 복합체를 리게이트하여 NF-θB 핵 전좌 및 후속 업 조절을 통해 강력한 전염증반응을 유도합니다. 사이토 카인 발현2.

급성 폐 손상(ALI)은 심부전이 없는 양측 폐 부종과 함께 급성저산소성 호흡부전으로 정의된다 3. LPS의 기도 투여는 폐 염증 및 ALI 4, 5,6,7을유도하는 일반적인 방법이다. 멸균 물질은 전염병에 있는 약리학적인 내정간섭을 공부하기 위하여 적당하지 않더라도, 기계론적 면역학 질문은 적당한 정밀도로 대답될 수 있습니다. 기관에 LPS를 주입하면 백혈구 침입, 전염증성 사이토카인의 업조절, LPS 투여량에 따라 몇 시간에서 며칠 내에 알베올로 모세혈관 장벽의 중단을 가진 강력한 염증 반응을 유도합니다3. 6,7.

제시된 프로토콜은 경내 LPS 주입에 의해 마우스에서 ALI를 유도하는 상세한 단계별 절차를 기술한다. 이 모델은 앞서 설명한바와같이 사이토카인 발현, 호중구 과립구 침입 및 폐포 내 알부민 누설을 평가함으로써 검증되었다.

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프로토콜

이 동물 프로토콜은 동물 관리 지역 위원회 (LANUV, Recklinghausen, 독일; 프로토콜 번호 84-02.04.2015)에 의해 승인되었으며, 살아있는 동물의 사용을위한 건강 의학회 지침에 따라 수행되었다 (NIH 간행물) No. 85-23, 개정 1996).

1. 알리 유도

  1. 약 10-12주의 나이에 성인 C57BL/6 마우스를 사용하십시오. 물과 표준 설치류 차우에 무료로 액세스 할 수있는 개별 환기 케이지에 동물을 수용 할 수 있습니다. 그러나, 더 젊은 동물및 그밖 마우스 긴장에 이 접근을 능력을 발휘할 수 있습니다.
  2. -20 °C에서 5 mg/mL의 농도로 알리쿼트에 LPS(대장균 O111:B4)를 저장합니다. 경막외 주입을 위해, 멸균 인산완충식염수(PBS)에서 LPS를 2,000 μg/mL의 최종 농도로 희석하십시오.
  3. 마우스의 무게를 측정합니다. 케타민 [120 mg/kg 마우스 체중 (BW)] 및 자일라진 (16 mg/kg BW) 복 강 내 (복 부, paramedian의 낮은) 주입 하 고 마 취의 발병까지 기다립니다.
  4. 촉각 자극을 유도하여 마취의 깊이를 확인합니다. 마취가 부족한 경우 케타민 (30 mg / kg BW)과 자일라진 (4 mg / kg BW)으로 주사를 반복하십시오.
  5. 37°C의 체온을 유지하기 위해 온도 제어 테이블에 마우스를 놓는다.
  6. 마취하에 각막의 건조를 방지하기 위해 멸균 안과 윤활제를 적용하십시오.
  7. 앞발이 테이블과 밀접한 접촉을 유지하면서 테이블 위에 약 5cm 위치에 있는 수평 막대에 머리와 후크 앞니를 들어 올립니다. 목을 테이블을 기준으로 90° 각도로 연장합니다(그림 1). 포셉으로 혀를 잡고 목을 곧게 펴서 쉽게 삽관 상태를 유지하십시오.
  8. 22 게이지 (G) 정맥 카테터를 20mm 길이로 자릅니다. 후두 위의 피부에 차가운 광원을 놓아 성대를 시각화하고 기관을 조준하십시오. 후두의 저항이 발생하면 카테터를 몇 밀리미터 후퇴시킨 후 다시 진행하십시오.
  9. 카테터를 기관에 약 10mm 삽입합니다. 삽입이 너무 깊지 않은지 확인하여 오른쪽 또는 왼쪽 주 기관지에 액체를 일방적으로 주입합니다.
  10. 피펫을 사용하여 PBS에서 희석된 LPS(5 μg/g BW)를 주입[주입된 부피는 마우스 체중에 따라 다릅니다(예를 들어, 20 g 의 체중 → LPS 용액 50 μL 사용)].
    참고 : 마우스는 일반적으로 기침이나 기관으로 유체의 적절한 점안으로 헐떡거리는 반응합니다.
  11. 주사기를 연결하고 50 mL 공기의 볼러스를 추가하여 완전한 액체 부피가 폐에 분포되도록합니다. 카테터를 천천히 제거합니다.
  12. 기관에서 액체의 누출을 피하기 위해 30 s에 대 한 똑바로 위치에 마우스의 상체를 유지 합니다.
  13. 가짜 로 작동하는 동물에서, LPS 대신 멸균 PBS 의 50 μL을 주입합니다.
  14. buprenorphine 염산염 0.08 mg/kg BW 피하 에게 ALI 유도 직후 목에 느슨한 피부에 주입 하 고 모든 12 시간 후, 동안 처음 48 시간.
  15. 온난화 패드에 마우스를 유지하여 완전한 인식이 회복 될 때까지 37 °C의 체온을 유지하십시오.
  16. 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 개별 환기 케이지에 마우스를 전송합니다. 마우스를 정기적으로 모니터링합니다. 체온과 호흡 우울증의 감소는 ALI의 적절한 유도를 나타냅니다.

2. 혈액 샘플링, 기관지 세척, 장기 수확

참고 : 안락사의 타이밍은 해결 과학적 문제에 따라 달라집니다. 보통, LPS 주입 3,4,9,10에따라 12-72 h를 수행한다. ALI의 중증도는 체온 및 호흡곤란 증상(11)의 정기적인 관찰에 의해 임상적으로 결정될 수 있다.

  1. 이소플루란으로 범람한 챔버에 마우스를 놓음으로써 마취를 유도한다. 1 L/min의 산소 흐름으로 3 vol% 이소플루란을 사용하십시오. 마취깊이가 부족한 경우, 이소플루란을 최대 5vol%까지 증가시.
  2. 아틀란토 후두 탈구에 의해 깊은 마취에 마우스를 희생.
  3. 수술대에 테이프로 마우스를 고정하고 곧 70 % 에탄올로 복부에 모피를 소독. 가위와 핀셋으로 중앙선에서 복강을 조심스럽게 엽니다. 척추 기둥과 복부 대동맥에 대한 정맥 카바 열등 (IVC)에 대한 액세스를 달성하기 위해 장의 일부를 제거하십시오.
  4. 신장 정맥을 찾아 정맥의 합류 바로 아래 IVC에 1 mL 주사기에 연결된 구부러진 23 G 카뉼라를 삽입합니다. 250 μL의 혈액을 흡입하고 0.5 M 의 0.5 m 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 용액으로 채워진 1.5 mL 튜브로 이송한다. EDTA 혼합을 용이하게하기 위해 부드럽게 흔들어 얼음에 튜브를 넣어.
  5. 기관지 세척제(BAL)의 경우 멸균 PBS 0.5mL와 공기 각각 0.1mL로 3개의 1mL 주사기를 준비합니다. 곧 70 % 에탄올로 목의 털을 소독하고 가위와 핀셋으로 기관을 조심스럽게 노출시킵니다. 기관을 동원하고 봉합사를 감싸는다.
  6. BAL 수행: 마이크로 가위를 사용하여 기관에 구멍을 뚫고 22G 정맥 카테터를 20mm 길이로 잘라 넣습니다. 60 s 후 유체를 흡인. 추가 2 개의 주사기로 절차를 반복하고 얼음에 15 mL 튜브에서 전체 흡인을 수집합니다.
  7. 조심스럽게 폐를 수확하기 위해 가위와 핀셋으로 흉부를 엽니 다. 늑골 여백을 따라 횡격막을 자르고 두 개의 측면 절개로 갈비뼈를 잘라냅니다. 조심스럽게 폐에 구멍을 뚫지 마십시오. 흉골을 두개골을 두개골을 들어 올리고 고정하거나 제거하십시오.
  8. 37°C 의 따뜻한 PBS(칼슘과 마그네슘 제외)로 10 mL 주사기 2개를 준비합니다. 좌심실로 작은 절개를하십시오. 우심실을 26 G 카ula로 뚫고 미리 따뜻해진 PBS로 폐 순환을 씻어 내보섭니다. 시술 중에 창백하게 변하는 폐에 유의하십시오.
  9. 폐의 오른쪽 엽을 제거하고 두 반으로 잘라. 액체 질소에서 스냅 동결시키고 추가 유전자 발현 및 단백질 분석을 위해 -80 °C에서 장기 보관하십시오.
  10. 왼쪽 폐 전체를 제거하고 가위와 핀으로 조직을 다진 48 웰 플레이트에서 균질화하십시오. 소화 완충제 2 mL에서 조직을 배양 [RPMI 1640 와 10% 태아 송아지 혈청 (FCS) 및 0.1% NaN3,콜라게나제 I (1 mg/mL), 및 DNase II (7 mg/mL)] 37 °C에서 60 분 동안 폐 및 정립 을 통해 추가 균질화를 수행하십시오. 아래로.

3. FACS 분석을 위한 조직 준비

  1. 신선한 FACS 완충제 준비 (표1):항상 양이온 의존성 세포 간 접착력을 줄이고 응집을 방지하기 위해 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS를 사용하십시오. FCS 보충제 (1%) 세포 사멸로부터 세포를 보호하고, 비특이적 염색을 방지하고, 세포가 FACS 튜브에 달라붙는 것을 방지합니다. EDTA (0.5 mM)를 포함하여 대식세포와 같은 끈적끈적하고 부착된 세포로 작업할 때 양이온 기반 세포 간 접착을 방지합니다. 아지드 나트륨 (0.1 %)을 첨가하면 박테리아 오염 및 불소의 광 표백을 방지하고 항체 흘리기 차단.
  2. 혈액 샘플 (단계 2.4)을 5 mL FACS 튜브로 옮기고 적혈구 포해 완충액 2 mL로 혈액을 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 올려 놓고 2 mL의 얼음 차가운 PBS를 추가하여 2 분 후에 반응을 종료합니다. 400 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리하고 상한체를 버립니다. 앞에서 설명한 프로토콜12에따라 후속 FACS 염색을 위한 FACS 버퍼 및 공정의 60 μL로 세포 펠릿을 다시 중단한다.
    참고 : 마우스의 안락사 타이밍은 전신 염증의 일환으로 백혈구 수에 영향을 미칩니다. 따라서 유세포 분석 분석을 위한 최상의 염색 결과를 얻으려면 이 단계에서 셀 수를 1 x 106 셀/60 μL로 조정하는 것이 좋습니다.
  3. 원심 분리기 BAL 유체 (단계 2.6) 400 xg에서 5 분. 상월체를 흡인하고 액체 질소에 동결시키고, 추가 단백질 분석을 위해 -80°C에서 장기 보관하였다. 차가운 FACS 버퍼 2 mL로 BAL 세포 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 100 μm 메쉬 필터를 사용하여 현탁액을 5 mL FACS 튜브로 옮겨 머리카락을 억제합니다.
  4. 다시, 400 xg에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리. 앞에서 설명한 프로토콜12에따라 후속 FACS 염색을 위한 FACS 버퍼 및 공정의 60 μL로 펠릿을 다시 중단한다.
    참고 : 마우스의 안락사 타이밍은 염증의 일환으로 BAL의 백혈구 수에 영향을 미칩니다. 따라서 유세포 분석 분석을 위한 최상의 염색 결과를 얻으려면 이 단계에서 셀 수를 1 x 106 셀/60 μL로 조정하는 것이 좋습니다.
  5. 소화된 좌폐 조직(단계 2.10)을 100 μL 메쉬 필터를 사용하여 5 mL FACS 튜브로 옮겨 덩어리를 추출하고 2 mL의 얼음 차가운 FACS 버퍼를 추가하여 소화 과정을 종료합니다. 400 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 앞에서 설명한 프로토콜12에따라 후속 FACS 염색을 위한 FACS 버퍼 및 공정의 60 μL로 펠릿을 다시 중단한다.
    참고 : 마우스의 안락사 타이밍은 염증의 일환으로 폐 조직의 백혈구 수에 영향을 미칩니다. 따라서 유세포 분석 분석을 위한 최상의 염색 결과를 얻으려면 세포 수를 1 x 106 셀/60 μL로 조정하는 것이 좋습니다.
  6. FACS 분석을 위해, FC 수용체에 면역글로불린의 비특이적 결합을 차단하기 위해 4°C에서 CD16/CD32 항체를 배양한다. 5 mL 튜브에서 60 μL에서 1 x 106 셀에 차단 용액 20 μL을 추가하십시오.
  7. 한편, 표2에 기재된 바와 같이 FACS 완충제 및 항체로 마스터 믹스를 준비한다.
  8. 차단 후 세포를 씻지 마십시오. 샘플당 20 μL의 항체 마스터 믹스를 추가하여 최종 부피를 100 μL. 4°C에서 어둠 속에서 20분 동안 인큐베이션합니다.
  9. FACS 버퍼 와 원심 분리기의 1 mL로 각 샘플을 400 xg에서 5 분 동안 씻으하십시오. 상급체를 버리고 FACS 측정을 위한 적절한 세포 농도로 FACS 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단한다.
    참고: 이 프로토콜을 사용하여 FACS 분석에서 최고의 면역 자형질 분석 결과를 달성하기 위해 1 x 106 세포/500 μL의 세포 번호가 제안됩니다. 그러나 항체는 개별적으로 적정되어야하는 것이 좋습니다.
  10. 필요한 경우, 시판되는 특정 키트 8을 사용하여 표면 염색 전에살아있는/죽은 염색을 추가합니다.
  11. 마지막으로, 시판되는 플루오로크롬 결합 교정 비드의 고정 번호를 각 샘플에 추가하여 절대 세포 번호12를결정합니다. 혈액, BAL 및 조직 세포에 대한 게이팅 전략은 그림2에 나와 있습니다.

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결과

마우스에서 ALI를 유도하는 기재된 접근법은 LPS 주입 후 사이토카인 발현, 호중구 과립구 침투, 및 알베올로-모세관 장벽 중단 24시간 및 72시간 동안 평가함으로써 검증되었다. PBS-주입 동물은 대조군으로 작용했다. 경내 LPS 투여는 강력한 폐 전염증반응을 유도했다. 폐 조직에서 TNF-α의 발현은 대조군 동물에 비해 50배 이상 지속적이고 50배 이상 증가에 도달하였다[RQ(TNF-α/18s); 24 h: 53.7 (SD=11.6); 72시간: 55.0(SD=20.6); p< 0.05). 조직 및 폐포 공간으로의 백혈구 침입은 ALI13의개발을 위한 특징및 특징이다. FACS 분석은 24 시간 후 대조군과 비교하여 거의 9 배 증가한 절대 세포 수와 함께 폐 간질로 호중구 과립구 (NG)의 상당한 침투를 밝혀 [SD = 15,855) 대 7,358 (SD = 4,794), p < 0...

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토론

최소한의 침습성, 간단한 취급 및 좋은 재현성은 작은 설치류 모델에서 ALI를 유도하는 제시된 접근법의 주요 특징이다. 동물 모델에서 전체 박테리아 대신 LPS를 사용하는 것은 장점이 있습니다. 그것은 안정적이 고 순수한 화합물 이며 사용 될 때까지 동약 형태로 저장할 수 있습니다. 그것은 TLR4 통로를 통해 타고난 면역 반응을 위한 강력한 자극제이고, 그것의 생물학 활동은 좋은 재현성으로 질병 엄격의 적정을 촉진하, 쉽게 정량화될 수 있습니다. 더욱이, LPS의 사용은 인간의 건강한 지원자에 있는 심각한 기관지염을 유도하는 안전한 모형으로 봉사하기 위하여 보였고 따라서 벤치에서 침대 옆16에번역을 허용합니다. Rittirsch 외. intratracheal LPS 점안의 뮤린 모델에서 특징적인 알베올로 모세관 누설의 용량 및시간 의존적 발전을 입증하였다 6. 이것은 특정 원하는 효과 달성 하기 위해 복용량 적정수 수 있습니다., ALI 심각...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 얀 클라이너와 수잔 슐츠가 기술 지원을 제공한 것에 대해 감사를 표하고자 합니다. 저자는 본 대학의 의학 학부에서 유동 세포 측정 핵심 시설의 우수한 지원을 인정. 저자는 외부 조직으로부터 자금을 받지 못했습니다.  그림 3에 설명된 결과 섹션에 제공된 데이터의 일부는 이미 이전 발행물8에나와 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 ml 주사기BD, Franklin Lakes, NJ, USA300013
10 ml 주사기BD, Franklin Lakes, NJ, USA309110
Anti-CD115 (c-fms) APCThermo Fisher, Waltham, MA, USA17-1152-80
Anti-CD11B (M1/70) - FITCThermo Fisher, Waltham, MA, USA11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) - eF450Thermo Fisher, Waltham, MA, USA48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7Thermo Fisher, Waltham, MA, USA25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5Thermo Fisher, Waltham, MA, USA45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7Bio Legend, San Diego, CA127623
부프레노르핀 염산염Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 마우스, 암컷, 10 - 12주 된Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µ m)BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA340487
Canula 23 게이지 1''BD, Franklin Lakes, NJ, USA300800
Canula 26 게이지 1/2''BD, Franklin Lakes, NJ, USA303800
Cell strainer 70 µ mBD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA352350
콜라겐분해효소 유형 I시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국1148089
Deoxyribonuclease IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAD8764 
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS), 멸균Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAD8662
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(PBS), 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 멸균Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAD8537
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAE7889
FACS 튜브, 5mlSarstedt, Nü mbrecht, Germany551579
태아 송아지 혈청 (FCS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF2442
ForcepsFine Science Tools, Heidelberg, Germany11049-10
IsofluraneBaxter, Unterschleiß heim, Germany
Ketamine hydrochlorideSerumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Escherichia coli O111:B4Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAL2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green KitThermo Fisher, Waltham, MA, USAL23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), 클론 2.4G2BD, Franklin Lakes, NJ, USA553141
적혈구 용해 완충액Thermo Fisher, Waltham, MA, USA00-4333-57
RPMI-1640, L-글루타민 및 중탄산나트륨포함 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAR8758
ScissorsFine Science Tools, Heidelberg, Germany14060-09
아지드화나트륨(NaN3)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAS2002
봄 가위Fine Science Tools, Heidelberg, Germany15018-10
조직집게Fine Science Tools, Heidelberg, Germany11021-12
TubesEppendorf, Hamburg, Germany30125150
정맥 카테터, 22 게이지B.Braun, Melsungen, Germany4268091B
자일라진 hydrochlorideSerumwerk Bernburg, 베른부르크, 독일

참고문헌

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