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방법 논문

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

10.4K 조회수

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DOI:

10.3791/60002

⸱

2019년 7월 22일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

이 논문에서

요약

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

초록

광학 클리어링 기술은 후속 3차원(3차원) 이미징을 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화하여 조직을 투명하게 만듭니다. 그(것)들은 거시적인 거리를 통해 확장하는 현미경 다세포 구조물을 분석하는 잠재력을 위한 모든 연구 지역에 있는 큰 관심을 받았습니다. 신장 tubules, 혈관, 신경 및 사구체가 많은 방향으로 확장한다는 것을 감안할 때, 지금까지 전통적인 2 차원 기술에 의해 부분적으로 포착된, 조직 정리는 또한 신장 연구의 많은 새로운 지역을 열었습니다. 광학 클리어링 방법의 목록은 빠르게 성장하고 있지만,이 분야의 초보자가 주어진 연구 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에 제공된 두꺼운 마우스 신장 슬라이스의 항체 라벨링을 결합하는 간단한 방법이 있다; 저렴하고 무독성이며 즉시 사용할 수있는 화학 물질 인 에틸 시나 메이트 (ethyl cinnamate)가있는 광학 클리어링; 및 공초점 이미징. 이 프로토콜은 신장을 침투시키고 항원 회수 단계를 사용하여 항체-결합을 증가시키는 방법을 전문 장비를 필요로 하지 않고 설명한다. 그것의 응용은 신장 내의 다른 다세포 구조물을 화상 진찰에서 제출되고, 조직에 나쁜 항체 침투를 해결하는 방법은 해결됩니다. 우리는 또한 내인성 형광을 화상 진찰의 잠재적인 어려움및 아주 큰 견본을 취득하고 그(것)들을 극복하는 방법 토론합니다. 이 간단한 프로토콜은 3차원으로 조직을 연구할 수 있는 설치가 간편하고 포괄적인 도구를 제공합니다.

서론

전체 기관 또는 큰 다세포 구조를 공부에 대한 관심이 증가함에 따라 투명 조직의 이미징을 3차원으로 포함하는 광학 클리어링 방법의 개발이 이해지고 있습니다. 최근까지, 전체 구조의 세포 수, 길이 또는 부피를 추정하는 가장 좋은 방법은 2 차원 1에서 후속 분석을위한 조직의 전신샘플링을 기반으로 하는 입체학 또는 철저한 직렬 단면입니다. 2개 , 3. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리며 높은 수준의 교육 및 전문 지식이 필요합니다4. 광학 클리어링 방법은3D 이미징5,6,7에대한 조직을 반투명하게 만들기 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화함으로써 이러한 문제를 극복한다.

용매 기반 및 수성 기반 방법의 두 가지 주요 범주로 속하는 몇 가지 광학 청산 방법이 개발되었습니다. 수성 기반 방법은 더 간단한 침수 8,9,과수10,11,및 하이드로겔 포함12,13으로나눌 수 있다. 용매 기반 방법은 조직을 탈수시키고, 지질을 제거하고, 굴절률을 약 1.55값으로 정상화한다. 대부분의 용매 기반 방법의 한계는 GFP, 용매 독성, 일부 이미징 챔버 또는 객관적렌즈에 사용되는 접착제를 용해하는 능력, 그리고 동안 조직의 수축과 같은 일반적으로 사용되는 리포터 단백질의 내인성 형광의 담금질입니다. 탈수14,15,16,17,18,19,20,21. 그러나, 용매 기반 방법은 간단하고 시간 효율적이며 다양한 조직 유형에서 작동할 수 있다.

수성 기반 방법은 1.38-1.528,11,12,22,23,24 범위의 굴절 지수가있는 수성 용액에 조직의 침지에 의존합니다. . 이러한 방법은 내인성 형광 리포터 단백질 방출을 보존하고 탈수 유발 수축을 방지하기 위해 개발되었지만, 대부분의 수성 계 청산 방법의 한계는 프로토콜의 더 긴 지속 기간, 조직 확장, 및 단백질 변형 (즉, ScaleA2와 같은 과수성 프로토콜에서 요소로 단백질의 부분 변성) 7,11,23,25. ScaleS는 요소-유도 조직 확장을 탈수시킴으로써 균형을 이룬 소르비톨과 우레아를 결합하여 조직 확장을 해결하고, 전자 현미경 검사법10에의해 평가된 바와 같이 조직 초구조를 보존하였다. 조직 수축 또는 확장은 구조물의 절대 크기, 물체 사이의 거리 또는 부피당 세포 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 조직의 정리 시 크기 변화의 측정은 얻어진결과 7,26을해석하는 데 도움이 될 수 있다.

일반적으로 광학 클리어링을 위한 프로토콜은 전처리, 투과, 면역 라벨링(필요한 경우), 굴절률 매칭 및 고급 광 현미경(예: 2광자, 공초점 또는 광시트 형광 현미경 검사법). 대부분의 클리어링 접근법은 신경 조직을 시각화하기 위해 개발되었으며, 새로운 연구는 다른장기에서 의 응용 프로그램을 검증했습니다 5. 이 포괄적인 도구는 사구체27,28,면역 침투28, 혈관 구조28,및 수관 분절을 포함하여 신장 구조의 안정적이고 효율적인 분석을 허용하는 것으로 이전에 입증되었습니다. 29,그것은 건강과 질병에 사구 기능 및 tubule 리모델링의 이해를 더 나은 이상적인 접근이다.

여기서 요약하면 신장 관의 면역 염색을 결합하는 용매 기반 방법이다. 저렴하고 무독성이며 즉시 사용이 간 화학 물질인 에틸 시나메이트(ECi)가 있는 광학 클리어링; 완전한 수화 시각화 및 정량화를 허용하는 공초점 현미경 이미징. 이 방법은 간단하고, 신장 슬라이스의 항원 회수와 상업용 항체의 얼룩을 결합하며, 대부분의 실험실에서 접근 할 수있는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

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프로토콜

참고: 여기에 설명된 모든 실험 절차는 미국 오리건 주 포틀랜드 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 독일 아헨의 관련 지방 당국에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 신장의 역행 복부 대동맥 관류 및 고정

  1. 전날 또는 저녁에 솔루션을 준비하고 밤새 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 실온(RT)에 따뜻한 용액을 사용하십시오.
  2. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 신선한 배치를 확인합니다. 마우스당 약 50-100 mL PFA가 필요합니다.
    1. 3% PFA의 1 L을 만들려면: PFA 30g의 무게를 측정하고 연기 후드에 증류수 800 mL을 추가하십시오. 저어서 50-60°C로 가열합니다. 70 °C 이상으로 가열하지 마십시오.
      주의: PFA는 독성이 있습니다. 연기 후드에 PFA를 준비합니다.
    2. 천천히 2N NaOH의 여러 방울을 추가합니다. PFA가 용액에 들어갈 때까지 몇 분 정도 기다리거나 몇 방울을 더 추가하십시오. 일부 작은 덩어리는 용해되지 않습니다.
    3. 용액을 열에서 제거합니다. 20x PBS의 50mL를 추가합니다. RT에 얼음에 진정.
    4. HCl을 사용하여 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
    5. 0.22 μm 필터로 1x PBS 및 3% PFA를 필터링하여 용해되지 않은 입자를 제거합니다.
  3. 1x PBS의 1L에 헤파린 1,000유닛을 추가합니다. 헤파린을 함유한 1x PBS와 1x PBS에 3% PFA를 별도의 50 mL 플라스틱 주사기로 옮김.
    참고: 가능한 경우, 80-100 mmHg 또는 정수압 (드립 방법, 관류 용액의 높이 : 동물 위의 160-200cm)에서 설정 된 압력 제어 펌프는 신장 관류에 사용할 수 있습니다.
  4. PBS, PFA 및 무딘 21G 나비 바늘을 3방향 스톱콕에 연결합니다. 시스템에 기포가 없는지 확인합니다.
  5. 15 mL 원엽 튜브에 라벨을 부착하고 10 mL의 PFA를 분배합니다.
  6. 남성 또는 여성 C57BL/6 마우스 12-24주를 사용하여 120 mg/kg의 체중 케타민과 16 mg/kg 체중자일라진을 심층으로 마취시면 됩니다. 동물은 수술을 진행하기 전에 반사 신경을 꼬집어 반응성의 완전한 부재를 확인해야합니다 (예를 들어, 발가락 핀치 반사).
  7. 동물이 마취의 외과 비행기에 도달하면 해부 현미경 아래에 뒷면에 놓습니다. 수술 가위를 사용하여 중간 선 복부 절개를 사용하여 복부를 외과적으로 열고 복부 대장을 노출시다.
  8. 구부러진 지혈로 장골 동맥에 분기 바로 위의 복부 대동맥을 고정합니다. 그런 다음 신장 동맥 바로 아래에 복부 대동맥을 미세 한 세련 미로 고정합니다. 바나가가있는 두 클램프 사이의 복부 대장에 작은 절개 (1mm)를 만듭니다. 나비 바늘을 천천히 절개에 넣고 복부 대장이 열리지 않도록주의하십시오.
  9. 5-0 실크 봉합사로 오른쪽 신장 동맥을 리게이트하고 관류및 고정을 위해 하나의 신장이 필요한 경우 다른 분석을 위해 오른쪽 신장을 제거하십시오.
  10. 마이크로 세정제를 제거하고, 바나가위로 문맥을 변환하고, 헤파린을 함유한 PBS 50 mL로 즉시 정성한 다음, 3% PFA의 50 mL로 전환하고 퍼퓨징한다.
    참고: 복부 대류를 통해 높은 관류 압력은 조직을 통해 더 나은 항체 확산을 위해 신장 관을 열 것을 요구됩니다. 심장을 통한 관류는 신장 관을 열지 않을 수 있습니다.
  11. 주의 깊게 공수 된 신장을 수집하고 조직을 뚫거나 압박하지 마십시오.
  12. 캡슐을 제거하고 신장을 1mm 두께의 관상 슬라이스로 자른다. 슬라이서 매트릭스(재료표)를사용하여 슬라이스 두께를 표준화합니다.
    참고: 또는 진동을 사용하는 것이 좋습니다.
  13. 표시된 15 mL 원엽 튜브에 준비된 PFA로 신장 슬라이스를 담급전시.
  14. 10 mL의 PFA를 다른 라벨이 붙은 15 mL 원엽 튜브에 분배하십시오. 다음 마우스로 이동하기 전에 PBS로 3방향 스톱콕과 나비 바늘을 플러시합니다.
  15. 빛으로부터 보호된 RT에서 밤새 사후 고정을 수행하십시오.

2. 조직 준비 및 면역 염색

  1. 고착 후, RT에서 수평 로커에 1시간 동안 1 x 세척 버퍼 (재료 표)로 신장 슬라이스를 두 번 씻으하십시오.
  2. 항원 검색을 수행합니다. 92-98 °C에 500 mL 비커에서 1x 항원 미모 스킹 솔루션 (재료의 T수)의300 mL을 가열합니다. 92-98°C에서 1시간 동안 교반하여 가열된 완충액에 투과가능한 카세트를 임베딩한 카세트를 둘러싸는다. 비커를 열에서 제거하고 RT로 식힙니다.
    참고: 몇몇 공급 업체는 면역 조직 화학 응용을 위해 그들의 항체를 시험하고 데이터 시트에 제안된 항원 회수 방법을 포함할 것입니다. 따라서, 일부 에피토프는 보다 기본적인 버퍼(예를 들어, pH 9)를 요구할 수 있다.
  3. 슬라이스를 0.1% 트리톤 X-100으로 1x 세척 버퍼의 10 mL로 옮기고 RT에서 밤새 바위를 2x로 씻어 신선한 1x 세척 버퍼 10 mL로 다음날 1 시간 동안 씻어 내보소입니다.
  4. 정상 항체 희석제의 500 μL에서 1 차항체를 희석한다(물질표). 1:50-1:100의 농도로 시작합니다. 37°C에서 4d동안 희석된 1차 항체로 신장 슬라이스를 부드럽게 흔들었다.
    참고: 각 항체는 독특한 특성을 가지고 있기 때문에 항체의 항체 배양 및 희석 동안의 온도는 개별 프로브에 최적화되어야 합니다. 이차 항체 전용 대조군을 위해, 1 차적인 항체 없이 희석제로 신장 조직을 배양한다. 상업적 항체 희석제 대신에, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.01% 아지드 나트륨을 이용한 1x PBS를 사용할 수 있다.
  5. 8시간 후에 세척 완충액을 한 번 변경하여 RT에서 밤새 1x 세척 완충액의 10 mL로 신장 슬라이스를 세척합니다.
  6. 정상 항체 희석제의 500 μL에서 이차 항체(예를 들어, 알렉사 플루오르-컨쥬게이트 이차 항체에 대해 1:100)를 희석한다. 37°C에서 4일 동안 희석된 이차 항체에 신장 슬라이스를 배양한다. 이 단계부터 는 빛으로부터 신장 조각을 보호하십시오.
  7. 8시간 후에 세척 완충액을 한 번 변경하여 RT에서 밤새 10 mL의 1x 세척 버퍼로 신장 슬라이스를 씻습니다.

3. 조직 정리

  1. 신장 슬라이스를 5 mL의 고급 100%에탄올 (재료 표)으로 2 시간 동안 RT에서 부드러운 흔들림 (1 시간 후 신선한 에탄올로 한 번 변경). 이 단계는 조직 탈수용입니다.
    참고: 고급 에탄올은 다음 단계에서 높은 조직 투명도를 달성하기 위해 요구된다. 메탄올 또는 테트라하이드로푸란은 탈지질 전위가 높은 대체 탈수 시약이다.
  2. 하룻밤 동안 RT에서 부드럽게 흔들면서(2시간 후 신선한 ECi로 한 번 변경) ECi (재료 표)의 2 mL에 신장 슬라이스를 담급니다.
    참고: ECi의 동결/융점은 6-8°C입니다. 따라서 샘플을 냉장고에 보관하지 마십시오. 적절한 환기 연기 후드에 침지하고 옷과 피부와 직접 접촉을 피하십시오 (ECi는 식품 의약품 안전청이 승인한 비독성 화합물이지만 강한 냄새가 납니다). 일반 Eppendorf 튜브 또는 유리 용기 (폴리스티렌 용기 없음)를 사용하십시오.
  3. 조직 반투명은 ECi 침지 후에 그리고 신장 조각이 화상 진찰을 위해 준비될 때 달성될 수 있습니다.

4. 공초점 이미징 및 이미지 분석

참고: 이미징을 위해 굴절률 매칭 솔루션이 대물렌즈와 호환되는 한 다른 현미경 기술을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 반전된 공초점 현미경을 사용합니다.

  1. 600-1,000 μL의 ECi를 유리 바닥접시(재료 표)에 넣습니다.
    참고: ECi는 플라스틱 접시를 용해하는 유기 용매이기 때문에 일반 세포 배양 접시의 사용을 피하십시오. 마찬가지로, ECi는 대목적 렌즈의 플라스틱 부품/절연 링을 공격할 수 있습니다. 호환 가능한 이미징접시(30) 및 자수제작 3D 프린팅챔버(28)의개요에 대한 적절한 보고서를 참조하십시오.
  2. 반투명 신장 슬라이스를 접시에 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 유리 바닥쪽으로 가벼운 압력을 가하기 위해 신장 슬라이스에 둥근 덮개슬립을 놓습니다. ECi의 누출을 방지하기위해 파라핀 필름 (재료 표)으로 접시를 밀봉하십시오.
    참고: 전체 장기 또는 몇 밀리미터 두께의 조직 슬라이스는 샘플에 대한 ECi 풀을 만들기 위해 조직 주위에 테두리 (치과 시멘트 또는 실리콘 탄성 중합체; 재료 표참조)를 필요로 할 수 있습니다.
  3. 접시를 현미경 이미징 플랫폼에 놓습니다.
  4. 여러 z 스택을 가지고 바느질을 수행합니다. 5 μm의 z 단계 크기로 시작합니다.
    참고: 매우 두꺼운 조직 조각 이나 장기의 이미징에 대 한 긴 작업 거리 (>5 mm) 그리고 높은 숫자 조리개 (>0.9) 목표를 사용 하 여 고려. 이미징 후, 조직을 에탄올로 다시 옮기고 0.02% 나트륨 아지드로 세척 완충제 또는 PBS에 보관하십시오.
  5. 소프트웨어(재질 표)를 사용하여3D 렌더링을 사용하여 이미지를 분석합니다.

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결과

신장은 43개의 다른 세포 모형31로이루어져 있는 복잡한 기관입니다. 이 세포의 대부분은 사구체및 tubules와 같은 큰 다세포 구조물을 형성하고, 그들의 기능은 서로 상호 작용에 높게 의존합니다. 고전적 2-D 조직학 기법은 부분적으로 이러한 큰 구조물을 포착하고 그대로구조(31)내에서 초점 변화를 놓칠 수 있다. 따라서 광학 클리어링 기술을 사용한 3D 분석은 건강과 질병에서 어떻게 기능하는지 이해하는 데 도움이 됩니다.

대부분의 용매 계 광학 클리어링 기술은 적어도 부분적으로 내인성 형광 리포터 단백질 신호를 담금질할 것이다. YFP 태그파브알부민의 담금질은 ECi로 탈수 및 광학클리어링 시 관찰되었다(그림 1). 그러나, 다른 강한 형광 단백질은 신호 담금질에 저항할 수 있고, pH를 기본 수준(pH 8-11)으로 조절하면 내인성 형...

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토론

광학 클리어링 기술은 다양한 장기에서 미세 해부학의 3차원 시각화 및 정량화에 대해 폭넓은 관심을 받고 있습니다. 여기서, 용매계 클리어링 방법(ECi)을 신장 슬라이스에서 전체 튜블의 3차원 이미징을 위한 면역 라벨링과 결합하였다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 빠를 수 있습니다. 그러나 다른 연구 질문은 다른 클리어링 프로토콜5로 가장 잘 대답 할 수 있습니다. 또한 용매 기반 방법은 주로 탈수 단계14,18로인해 가변 각도에서 조직 수축을 일으킨다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 대부분의 용매계 방법(예를들어, ECi14)은또한 적어도 부분적으로 GFP 또는 tdTomato와 같은 기자들의 내인성 형광을 담금질; 따라서, FDISCO32,CLARITY

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

T. S.는 DFG 독일 연구 재단 (332853055), 엘스 크뢰너 - 프레세니우스 - 스티퉁 (2015_A197), RWTH 아헨의 의료 학부 (RWTH 반환 자 프로그램)의 보조금에 의해 지원됩니다. V. G. P. 도이치 Gesellschaft 모피 Nephrologie, 알렉산더 폰 훔볼트 재단, 그리고 호주의 국립 건강 및 의료 연구 위원회에서 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. D. H. E는 레덕크 폰디에 의해 지원됩니다. R. K.는 DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), 노스리뉴스트팔리아 주(MIWF-NRW) 및 RWTH 아헨 대학교의 임상 연구를 위한 학제간 센터(O3-11)의 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 필터Fisher Scientific09-761-112
15mL 원뿔형 튜브Fisher Scientific339650
21G 버터플라이 바늘브라운베노픽
3방향 스톱콕Fisher ScientificK420163-4503
3D 분석 소프트웨어Bitplane AGIMARIS
3D 분석 소프트웨어Cellprofiler무료 오픈 소스 소프트웨어
5-0 실크 봉합Fine Science Tools18020-50
50 mL 플라스틱 주사기Fisher Scientific14-817-57
Anti-BrdU 단클론 항체Roche11296736001
항체 희석제DakoS0809
CD31-647BioLegend102516
구연산염 기반 항원 검색 솔루션Vector LaboratoriesH-3300
곡선형 지혈Fisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
해부 현미경MoticDSK-500
임베딩 카세트Carl RothE478.1
EthanolMerck
에틸 신나메이트시그마-알드리치112372
플렉시블 필름/파라필름 M시그마-알드리치P7793
염소 안티-AQP2산타크루즈 생명공학sc-9882
기니피그 안티-NKCC2N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
헤파린Sagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
수평 로커LabnetS2035-E
이미징 접시Ibidi81218
KetamineMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
작동 가위Merit97-272
파라포름알데히드Thermo Fischer ScientificO4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
실리콘 엘라스토머World Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
아지드화나트륨시그마 - 알드리치S2002
조직 슬라이서Zivic 악기HSRA001-1
트리톤 X-100에이크로스 유기물AC215682500
Vannas 가위파인 사이언스 도구15000-00
VibratomeLancer시리즈 1000
XylazineMWI 동물 건강AnaSed Inj SA (자일라진)
스 사 제 100983

참고문헌

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