대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

요약

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

초록

새로운 멤브레인 수송기를 기능적으로 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 폴리 아민은 모든 유기체에서 유비쿼터스이지만 식물의 폴리 아민 교환기는 확인되지 않았습니다. 여기서, 우리는 대장균 세포의 용해로부터 생성된 막 소포를 이용하여 폴리아민 항균제를 이종적으로 발현하는 식물 항균제를 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다. 첫째, 우리는 이질적으로 폴리아민 및 아르기닌 교환 수송기결핍된 대장균 균주에서 AtBAT1을 표현하였다. 소포는 프랑스 프레스를 사용하여 제조되었고, 초원심분리에 의해 정제되고, 수송기의 기질 특이성을 입증하기 위해 표지된 기판의 멤브레인 여과 분석에서 활용하였다. 이 검역은 AtBAT1이 아르기닌, γ-아미노부티르산(GABA), 푸레신 및 스페르미딘의 양성자 매개 수송기임을 입증했습니다. AtBAT1의 분석을 위해 개발된 돌연변이 균주는 식물 및 동물 폴리아민 교환기의 다른 패밀리의 기능 분석에 유용할 수 있다. 우리는 또한 이 단백질이 세균성 세포막에서 표현될 수 있는 한, 이 접근이 antiporters의 많은 그밖 모형을 특성화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 가설합니다. 대장균은 토착 수송기를 돌연변이시키는 데 사용할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 새로운 운송업자의 특성화에 좋은 시스템입니다.

서론

대사 산물의 인신 매매에 관여하는 단백질은 생리적 조절의 필수적인 수준을 구성하지만, 식물 막 수송자의 대부분은 아직 기능적으로 특성화되지 않았습니다. 새로운 수송 단백질을 특성화하기 위해 몇 가지 전략이 구현되었습니다. 대장균 및 효모, 제노푸스 난소, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포와 같은 모델 유기체에서의 이종 발현은 모두 그들의 수송 활성을 결정하는 데 사용되어 왔다^1. 진핵 세포는 진핵 단백질의 발현을 위해 선호되는데, 왜냐하면 기본 세포 조성, 신호 변환 경로, 전사 및 번역 기계는 기본 조건과 호환되기 때문이다.

효모는 식물에서 새로운 수송 단백질의 특성화를 위한 중요한 모델 유기체였습니다. 효모(Saccharomyces pombe)에서성공적으로 발현된 최초의 식물 수송 단백질은 클로렐라^2에서헥소스 수송기 HUP1이었다. 그 이후, 많은 식물 수송 단백질은 효모 발현 시스템을 사용하여 기능적으로 특징지어졌다. 여기에는 식물 성 당 수송기 (SUC1 및 SUC2^3,VfSUT1 및 VfSTP1⁴⁾및 보조 수송기....

프로토콜

1. P1 전이로 돌연변이를 두 배로 노크하는 대장균의 생성

1. 대장균 단일 녹아웃 돌연변이 균주 인 대장균 유전 스톡 센터(http://cgsc.biology.yale.edu)로부터 ΔPotE 및 ΔCadB를 획득합니다.
   참고: ΔPotE 균주는 카나마이신 내성^26이고 ΔCadB 균주는 테트라사이클린 내성^27입니다.
2. P1 변환^{프로토콜(28)을}사용하여 PotE/CadB 이중 녹아웃(DKO) 변형을 구성합니다.
   1. 리세이트 준비
      1. 신선한 LB (1:100)에 ΔPotE의 하룻밤 배양을 10-25 mM MgCl_2,5 mM CaCl_2,및 0.1-0.2 % 포도당으로 보충하였다.
      2. 1-2 시간 동안 37 °C에서 자랍니다.
      3. 40 μL의 P1 파지 를 배양에 ....

결과

이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에그림으로 요약되어 있습니다. 간략하게, 대장균 세포는 모든 폴리아민 교환기에서 결핍되고 AtBAT1을 발현하여 배양되고, 원심분리되고, 완충액으로 세척하고, 프랑스 프레스를 사용하여 세포 용해를 행하였다. 용해는 주로 내부 아웃소포를 생성하고 세포 외부의 버퍼를 트랩하는 경향이있다. 세포 파편은 원심 분리에 의해 제거되고, 제 2 초원환 단계는 막 펠렛을 수집하는 데 사용된다. 멤브레인 펠릿은 트리스-말레아테 완충액 pH 5.2에서 재중단되고 -80°C에서 저장된다. 수송 성 애세포는 12°C에서 이루어지며, 이는 멤브레인 안정성을 유지하기에 최적인 것으로 밝혀졌다. 공산학은 방사성 표지기의 첨가 및 소포의 완충현탁액의 pH의 pH의 변화에 의해 pH 8.0으로 개시된다. 1 분 후, 표지되지 않은 기판을 가진 얼음 차가운 분석 버퍼는 소포로 방사성 .......

토론

본 연구에서, 우리는 먼저 대장균에서 단백질을 발현한 다음 막 소포를 생성하여 항균제의 특성화를 위한 방법을 개략적으로 설명하여 이종발 단백질을 무세포 시스템에서 분석할 수 있도록 한다. 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견되는 장비 이외에, 이 전략은 프랑스 언론, 초원심분리기 및 방사성 동위 원소 검소를 실시하는 시설에 대한 액세스를 필요로합니다.

이 기술의 기본적인 요구 사항은 이종 단백질이 대장균의혈장 막을 올바르게 표적으로 한다는 것입니다. 이러한 전략은 또한 대장균 운반체가 대장균 세포막에 성공적으로 국한되고 기능적으로 특징화된^35이기때문에 오르간선 기 수송기의 기능적 분석에 유용할 수 있다. 이러한 실험에 사용된 벡터(pBAD-DEST49)는 번역된 생성물의 용해도를 증가시키기 위해 N-말단 티오레독신 단백질을 함유한다. 작은 B. subtilus 단백질 신비의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250
3H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
3H-스페르미딘	PerkinElmer	NET522001MC
4-클로로-1-나프톨	시그마-알드리치	C8890
14C 아르기닌	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP 항체	ThermoFisher	R931-25	C 말단 폴리히스티딘 (6xHis) 태그 검출, 검출을 위해 무료 carboxyl 그룹 필요
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA 단백질 분석 키트	ThermoFisher	23227	Pierce BCA 단백질 분석 키트.
브로모페놀 블루	Bio-Rad	161-0404
카르복시펩티다아제 B	시그마-알드리치	C9584-1mg
원심분리기	Sorvall		SS-34 고정각 로터 및 GA-6 고정각 로터
Dounce 조직 분쇄기	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 파이렉스 균질화기(주둥이 포함).
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	섬광 칵테일
EDTA	시그마-알드리치
여과 매니폴드	Hoefer	FH225V
프렌치 압력 셀	글렌 밀스	FA-080A120
GABA	시그마-알드리치	A2129
글루타메이트	시그마-알드리치	G6904
글리세롤
GraphPad 프리즘 소프트웨어			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
과산화수소	KROGER
염화칼	J.T. Baker	3040-01
액체 섬광 카운터	Beckman	LS-6500
말레산	염 시그마-알드리치	M0375
나노드롭	ThermoFisher
니트로셀룰로오스 멤브레인 필터	Merck Millipore	hawp02500	0.45 &마이크로; M
PCR 클린업 키트	Genscript		QuickClean II
인산칼륨 이염기성	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
인산칼륨 일염기성	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
균주 :E. coli Δ potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10	이 원고는	요청 시 제공됩니다.	PotE 및 CadB 폴리아민 교환기에는 스트레인이 부족합니다.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
초원심분리기	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT 고정각 로터
초원심분리기 튜브	ThermoFisher	45237	S150-AT 로터용 원심분리기
튜브 벡터: pBAD-DEST49	<		em>E. coli

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