여기서 우리는 표현형 및 기능 분석을 위해 등쪽 뿌리 신경절에서 대식세포를 신속하게 분리하는 기계적 해리 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
말초 신경 손상 후 등쪽 뿌리 중추에서 면역 세포와 감각 뉴런 간의 분자 및 세포 상호 작용을 연구하는 관심사가 증가하고 있습니다. 대식세포를 포함한 말초 단낭세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상에 반응하는 것으로 알려져 있다. 새로운 증거는 신경 손상의 맥락에서 신경 병성 통증 개발 및 축색 수리에 등계 뿌리 신경절 대식세포의 기여를 연루하고있다. 급속하게 phenotyping (또는 "급속한 격리") 신경 상해의 맥락에서 등대 근 신경절 대식세포의 반응은 알려지지 않은 신경면역 요인을 확인하기 위하여 요구된다. 여기에서 우리는 우리의 실험실이 효소가 없는 기계적인 해리 프로토콜을 사용하여 등쪽 뿌리 중추에서 대식세포를 신속하고 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 견본은 세포 스트레스를 제한하기 위하여 얼음에 보관됩니다. 이 프로토콜은 표준 효소 프로토콜에 비해 훨씬 적은 시간 소모이며 형광 활성화 세포 선별 분석에 일상적으로 사용되어 왔습니다.
서론
면역 세포가 말초 신경 손상 다음 신경 병증 통증에 기여한다는 상당한 증거가 지금있다1,2. 성숙한 대식세포를 포함하는 말초 단핵세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상 및 전신 감염에 반응하는 것으로 알려져 있다. 척추 등쪽 경적에서 신경 손상 유발 미세글리아 활성화와 병행하면, 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 대식세포도 신경 손상 후 크게 확장된다3,4. 특히, DRG5,6, 7에서감각 뉴런과 상호 작용하여 말초 신경 손상 후 대식세포가 신경 병증 성 통증 발달에 기여하는지 여부를 결정하는 관심이 증가하고 있습니다. 8개 , 9개 , 10개 , 11
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프로토콜
모든 동물 실험은 캘리포니아 샌프란시스코 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 수행되었습니다.
1. 실험 마우스에서 요추 DRG를 수집
- 실험을 시작하기 전에, 9개의 매질을 Ca++ ++ ++-free10x HBSS와 혼합하여 밀도 그라데이션 배지(예를 들어, Percoll)의 작동 용액을 준비한다. 얼음에 보관하십시오.
- 2.5 % 아버틴으로 마우스를 마취. 뒷발 꼬집기에 대한 반응이 없어 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
참고: 6-8 주 세 남성과 여성 마우스 를 모두 사용했다. - 미리 냉각된 1x PBS의 10 mL로 마우스를 경피적으로 주입합니다.
- 화학 연기 후드 내부에 테이프로 고정 네 발로 supine 위치에 마우스를 배치합니다. 집게에 의해 늑골 케이지 아래피부를 들어 올리고 수술용 가위로 작은 절개를 하여 간과 횡격막을 노출시십시오.
- 다이어프램과 흉곽을 잘라 가위를 계속 사용하여 흉막 구멍을 열어 박동하는 심장을 노출시다.
- 조리개 가위로 오른쪽 심방 부속기를 빠르게....
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결과
단리된 세포를 검증하기 위해, 우리는 먼저 대식세포 Fas-유도 세포자멸(MAFIA) 형질전환마우스(17)를선택했다. 이 라인은 약물 유도성 FK506 결합 단백질(FKBP)-Fas 자살 융합 유전자 및 녹색 형광 단백질(eGFP)을 CSF1 수용체(CSF1R)의 프로모터의 제어하에 표현하며, 이는 대식세포 및 마이크로글리아 모두에서 특이적 발현된다. FK 결합 단백질 이이머제의 전신 주사, AP20187 (AP), 이식유전자를 발현하는 세포의 세포사멸을 유도한다. EGFP의 발현은 또한 우리가 DRG에 있는 대식세포를 감시하는 것을 허용합니다. MAFIA 마우스의 대식세포 고갈을 위해, 우리는 AP (1 mg/kg)의 매일 복강 내 주사 3회로 연구를 시작했습니다. 마지막 주사 후, DRG는 GFP에 대한 면역 염색을 위해 단면화되었다. 우리는 VEH 처리 마우스에 비해 AP 처리 마우스의 DRG에서 GFP+ 세포의 상당한 손실을 기록했다
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토론
여기서는 마우스 DRG에서 분리된 대식세포를 효과적으로 풍부하게 하는 새로운 방법을 소개합니다. DRG 면역 세포를 분리하는 기존의 접근법은 효소 소화15,18을필요로하며, 이는 이제 원치 않는 세포 손상을 제한하고 수율을 높이기 위해 프로토콜에서 기계적 균질화로 대체됩니다. 따라서 새 프로토콜은 훨씬 적은 시간 소모입니다. 더 중요 한 것은, 효소 소화 대 식 세포를 자극 하 고 분자 서명을 변경할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 기계적 접근 방식은 세포 스트레스를 크게 제한합니다.
FACS 분석을 사용하여, 우리는 더 단리된 DRG 세포에서 대식세포를 특성화하고 훌륭한 세포 회복을 입증하였다. 이 프로토콜하에서 단리된 DRG 세포의 80% 이상이 실행 가능한 것으로나타났다(도 2D). 적어도 50,000 ~ 100,0.......
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공개 사항
저자는이 원고와 관련된 경쟁 적인 금전적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
연구에 의해 지원 되었다: 마 취 교육 및 연구에 대 한 재단 (XY); UCSF 마취 및 perioperative 배려의 부 (XY); 및 1R01NS100801-01(GZ). 이 연구는 NIH (P30CA082103)의 보조금을 통해 세포 분석 공유 자원 시설에 대한 HDFCCC 연구소에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC 항체 | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| FACS 튜브 (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
참고문헌
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
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재인쇄 및 허가
