이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.
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방법 논문
자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템
이 논문에서
요약
초록
다중 지역 신경 기록은 다중 두뇌 지구 사이 정밀한 기간 상호 작용을 이해하는 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 기존의 마이크로 드라이브 설계는 단일 또는 다중 영역에서 한 유형의 전극만 사용하여 단일 단위 또는 깊이 프로파일 레코딩의 수율을 제한합니다. 그것은 또한 수시로 표적 통로 및/또는 세포 모형 특정 활동을 표적으로 하는 광유전학 공구와 전극 기록을 결합하는 기능을 제한합니다. 여기에 제시된 하이브리드 마이크로드라이브 어레이는 자유롭게 마우스를 이동하여 수율을 최적화하고 마이크로드라이브 어레이의 제조 및 재사용에 대한 설명을 제시합니다. 현재 디자인은 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시에 두 개의 서로 다른 뇌 영역에 이식 된 9 개의 테트로데스와 하나의 광 실리콘 프로브를 사용합니다. 테트로데스 와 광실리콘 프로브는 뇌의 등쪽 축을 따라 독립적으로 조절할 수 있어 단위 및 진동 활동의 수율을 극대화합니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 장거리 신경 회로의 지역 또는 세포 유형 별 반응 및 기능을 조사하기 위해 광, 광유전학 적 조작을 중재하는 설정을 통합합니다. 또한, 광실리콘 프로브는 각 실험 후에 안전하게 회수및 재사용할 수 있다. 마이크로 드라이브 어레이는 3D 인쇄 부품으로 구성되어 있기 때문에 다양한 설정을 수용하기 위해 마이크로 드라이브의 디자인을 쉽게 수정할 수 있습니다. 먼저 설명된 마이크로드라이브 어레이의 설계및 광섬유를 광유전학 실험을 위한 실리콘 프로브에 부착하는 방법, 이어서 테트로드 번들의 제조 및 마우스 뇌에 어레이의 이식이 있다. 광유전학 적 자극과 결합 된 국소 필드 전위 및 단위 스파이크의 기록은 자유롭게 움직이는 마우스에서 마이크로 드라이브 어레이 시스템의 타당성을 보여줍니다.
서론
신경 활동이 학습 및 기억과 같은 인지 과정을 어떻게 지원하는지 이해하는 것이 중요합니다. 인지 작업의 근간이 되는 신경 활동의 역학을 해명하기 위해, 마이크로드라이브 어레이1,2,3의도움으로 동물에게 자유롭게 움직이는 대규모 세포외 전기생리학이 진행되고 있다. 4. 지난 2 년 동안, 마이크로 드라이브 배열의 여러 유형은 쥐에 대한여러 뇌 영역으로 전극을 이식하기 위해 개발되었다 5,6,7,8 및마우스9, 10개 , 11세 , 12. 그럼에도 불구하고, 현재의 마이크로 드라이브 설계는 일반적으로 여러 프로브....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 방법은 텍사스 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 마이크로 드라이브 어레이 부품 의 준비
- 치과 모델 수지(그림1A,B)를 사용하여 3D 프린터를 사용하여 마이크로드라이브 어레이 부품을 인쇄합니다. 개별 3D 인쇄 레이어의 두께가 50 μm 미만인지 확인하여 인쇄된 부품의 작은 구멍을 선명하고 실행 가능한 상태로 유지합니다.
참고 : 마이크로 드라이브 어레이는 5 부분으로 구성되어 있습니다 (그림1C): (1) 마이크로 드라이브 어레이의 본체, 테트로드를위한 9 개의 마이크로 드라이브 나사와 실리콘 프로브용 나사 1 개가 포함됩니다 (그림1Ca-d). 하단에 있는 광실리콘 프로브에 대한 테트로드 번들 및 구멍의 조정은 표적 뇌 영역의 좌표에 따라 달라집니다(도1Cd); (2) 실리콘 프로브 또는 옵트로드를 부착하는 셔틀 (도1Ce); (3) 실리콘 프로브 커넥터를 고정하는 프로브 전기 커넥터 마운트 (도
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결과
마이크로 드라이브 어레이는 5 일 이내에 구성되었습니다. 마이크로 드라이브 준비의 타임 라인은 표2에 설명되어 있습니다. 이 마이크로드라이브를 사용하여, 9개의 테트로데스 및 1개의 실리콘 프로브를 마우스의 해마 CA1 및 MEC[21주 령/29 g 체중 남성 pOxr1-Cre(C57BL/6 배경)]에 각각 이식하였다. 이 형질전환 마우스는 MEC 층 III 피라미드 뉴런에서 Cre를 발현한다. 마우스를 AAV5-DIO-ChR2-YFP(7.7 x 1012 gc/mL)의 200 nL로 전극 임플란트 10주 전에 MEC에 주입하였다. LFP는 로우 패스 필터(1-500 Hz)를 사용하여 기록하였고, 하이패스 필터(0.8-5 kHz)를 사용하여 스파이크 유닛을 검출하였다. 광 자극(λ = 450 nm)은 섬유 커넥터의 끝에서 측정된 10.6 mW 강도에서 1 ms 펄스 폭을 사용하여 수행하였다. 테트로드 기록을 위한 기준 전극은 전용 테트로드 와이어를 사용하여 백색 물질에 배치되었다........
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토론
이 프로토콜은 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 자유롭게 행동하는 마우스에서 실리콘 프로브를 사용하여 두 뇌 영역에서 신경 활동을 기록할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여줍니다. 또한 실험 후 광유전학 적 실험 및 실리콘 프로브의 회수를 보여줍니다. 조정 가능한 실리콘 프로브33 또는 광실리콘 프로브36 이식은 이전에 마우스에서 입증되었지만, 이 프로토콜은 동시 테트로드 어레이 및 광실리콘 프로브 이식에 분명한 이점을 제공하여 유연성을 제공합니다. 이식된 프로브 유형의 선택. 이식된 프로브의 종류는 다중 생크 프로브27,44 또는 초밀도 Neuropixels 21,45와같은 실험의 목표에 따라 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 일본과학해외연구동호회(HO), 부여된 장학생프로그램(TK), 인간개척과학프로그램(TK), 뇌연구재단(TK), 교수과학기술취득, 보존 프로그램 (TK), 뇌 및 행동 연구 재단 (TK), 스미토모 재단 연구 보조금 (JY), 나르사드 젊은 조사자 연구 보조금 (JY). 원고를 준비하는 동안 귀중한 의견과 제안에 대해 W. Marks에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #00-90 나사 | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB 나사 |
| #0-80 너트 | 섬유 | 페룰 홀더를 고정하기 위한 황동 너트 | B00DGB7CT2 |
| #0-80 나사 | 프로브 | 커넥터 마운트, 파이버 페룰 홀더 및 차폐 콘용 황동 기계 나사 | B000FMZ57G |
| 22 Ga 폴리에테르에테르케톤 튜브 | 소형 부품 | SLPT-22-24 | 셔틀에 부착하기 위한 것, 0.025인치 내경 |
| 23 Ga 스테인리스 튜빙 | 사극용 | 소형 부품 | HTX-23R |
| 23 Ga 스테인리스 와이어 | 소형 부품 | HTX-23R-24-10 | L자형/지지 와이어 |
| 26 Ga 스테인리스 와이어 | 포스트용 | 소형 부품 | GWX-0200 |
| 30 Ga 스테인리스 와이어 | 사 | 극 | |
| 용 소형 부품 HTX-30R3-D CAD 소프트웨어 패키지 | Dassault Systè mes | SolidWorks 2003 | |
| 3D 프린터 | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil 폴리이미드 절연 튜브 | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| 알루미늄 호일 테이프 | Tyco | Tyco 접착제 617022 대체 | 차폐 콘 |
| 전도성 페이스트 | YSHIELD | HSF54 | |
| 용 알루미늄 호일 테이프실리콘 프로브 마이크로드라이브 | AMT | UNM1.25-HalfMoon | 반달 스테인리스 나사, 직경 1.5mm, 300 &마이크로용 맞춤형 나사; m 스레드 피치 |
| 테트로이드 마이크로드라이브 | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | 슬롯 스테인리스 나사, 0.5 mm 직경, 160 &마이크로용 맞춤형 나사; m 스레드 피치, 우리의 디자인 |
| 치과 아크릴 | Stoelting | 51459 | |
| 치과 모델 수지 | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel 로터리 도구 | Dremel | 모델 800 | 그라인더 |
| 드릴 비트 | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| 전기 인터페이스 보드 | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| 에폭시 | Devcon | GLU-735.90 | 5분 에폭시 |
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| 광섬유 연마 시트 | Thorlabs | LFG5P | 광섬유 |
| 미세 핀셋 | Protech International | 15-368 | 실리콘 프로브 금 로딩/회수 |
| 핀 | Neuralynx | EIB 핀 소형 | |
| 접지선 | AM 시스템 | 781500 | 0.010 인치 베어 실버 와이어 |
| 헤드 스테이지 프리 앰프 | Neuralynx | HS-36 | |
| 임피던스 미터 | BAK 전자 모델 | IMP-2 | 1kHz 테스트 주파수 |
| 미네랄 오일 | ZONA | 36-105 | 윤활 나사 및 |
| 와이어 광섬유 | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| 기록 시스템 | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| 루비 섬유 스크라이브 | Thorlabs | S90R | 광섬유 |
| 실리콘 그리스 | 절단 Fine Science Tool | 29051-45 | |
| 실리콘 프로브 | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | 그림 3, 4A, 4B, 5 |
| 실리콘 프로브 | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| 실리콘 프로브 세척 용액 | Alcon | AL10078844 | 콘택트 렌즈 클리너 |
| 실리콘 러버 | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | 마이크로 드라이브 몰드 |
| 준비 용 실버 페인트 | GC 전자 | 22-023 | 실버 프린트 II 코팅, 접지선 |
| 두개골 나사 | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8mm 직경, 0.200mm 나사 피치 |
| 표준 수술 용 가위 | ROBOZ | RS-5880 | |
| 입체 식 장치 | Kopf | 모델 942 | |
| 슈퍼 접착제 | 록타이트 | LOC230992 | 가이드 포스트 |
| 외과 핀셋 | ROBOZ | RS-5135 | |
| 테트로드 트위스터 | 준 야마모토 | TT-01 | |
| 테트로드 와이어 | Sandvik | PX000004 |
참고문헌
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple refere....
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재인쇄 및 허가
