Method Article

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

Abstract

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동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.

Introduction

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동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 - 단백질 상호 작용 및 시간 역학

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 분석 디자인

  1. 후보 항체 제제
    1. 관심 있는 각 단백질에 대해 3-5개의 항체를 선택하여 선별합니다. 가능하면 다른 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체를 사용하십시오. 또한 하나의 비특이적 조절 항체를 포함한다.
    2. Tris를 제거하려면 항체를 30 kDa 스핀 필터에 추가하고 최소 부피로 회전하고 인산완충 식염수 (PBS)의 500 μL을 추가하고 3 번 반복하여 버퍼 교환을 수행하십시오. 담체 단백질을 제거하려면 제조업체의 프로토콜에 따라 항체 정제를 수행하십시오 (특정 정제 권장 사항에 대한 재료 표 참조).
      참고 : 이것은 무료 아민 그룹 (예 : Tris)이있는 담체 단백질 및 완충제가 COOH 그룹과 반응하고 후속 비드 커플링 및 생물 항성 반응을 담금질하기 때문에 수행됩니다. 모든 항체가 정제되어 있는지 확인 (캐리어 단백질 없음) 및 원발성 아민이없는 완충제 (즉, Tris 없음).
    3. 데이비스와 슈럼(20)에 의해 기재된 바와 같이 각 항체를카복실레이트 변형 라텍스(CML) 비드에 결합한다. 항체를 보존하기 위해 비드 커플링 반응을 최대 1/5까지 축소합니다(즉, 3.6 x 106 구슬, 0.2-1 mg/mL 항체의....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

항체 스크리닝
그림 2 B는 코넥신36 단백질에 대한 스크린의 결과를 나타낸다. 대부분의 IP_probe 조합은 IgG 컨트롤에 대한 신호를 생성하지 않습니다. 단일클론 항체 1E5 및 1E5 또는 폴리클로날 항체(6200)를 가진 프로브를 가진 IP는 IgG 대조군과 비교하여 비드 분포에서 우회적인 변화를 일으킨다. 여기서, IP 1E5 및 프로브 6200poly는 IP 및 프로브와 동일한 항체를 사용하지 않기 위해 선택되었으며, 둘 다 2개의 독립적인 항체에 의해 인식되는 비특이적 단백질의 확률을 감소시키고, 이를 사용하여 공동 연관성을 검출할 확률을 증가시키기 위해 선택되었다. 다른 에피토프. IgG 컨트롤에 비해 최소 1-2로그 가 더 높은 MFI를 사용하는 IP_probe 조합을 선택하는 것이 가장 좋지만, 대안이 없는 경우 컨트롤과 일관되게 구별되는 약한 MFI를 생성하는 쌍이 사용될 수 있습니다. .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이는 데이터 분석을 위해 저장됩니다. 유세포계 마이크로플레이트 캐리어(사용자 지정 냉장 지침의 경우 그림 S1 참조)를 포함하여 구슬과 용해액을 항상 차갑게 유지하는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 단백질 상호 작용은 실온에서 빠르게 해리되며, 수정되지 않은 실온 유동 세포계를 사용하는 초기 시도는 많은 온도-불안정한 상호 작용의 식별로 끝났지만 의도된 대로 변경되지는 않습니다. 자극.

QMI는 항체 기반 분석기이므로 항체의 초기 선택이 중요합니다........

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96웰 평평한 바닥 플레이트Bio Rad171025001
96웰 PCR 플레이트VWR82006-704
Bioplex 200 시스템(HTF포함) Bio Rad171000205부분적으로 냉장 보관하도록 수정됨, 자세한 내용은 그림 S1 참조
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
CML 비드InvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex 마이크로스피어 LuminexMC12xxx-01
MESSigmaM3671
마이크로플레이트 필름, 비멸균USA Scientific2920-0000
포스포타제 억제제 칵테일 #2SigmaP5726
프로테아제 억제제 칵테일SigmaP8340
샌드위치 준비 냉장고NorlakeSMP 36 15Bioplex 200 Sodium의 맞춤형 냉장용
불소시그마201154
오르토바나데이트 나트륨시그마450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152
xxx는 항체 정제 에 사용되는 3자리 비드 영역인 Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206입니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

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