이 프로토콜은 상대적으로 손상되지 않은 위치에서 눈꺼풀, 안구 표면, 전방 및 후방 세그먼트로 마우스 안구를 분리하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
조직학적 검사 및 면역 조직화학을 위한 통합 안구 표면 조직을 얻기 위한 손상되지 않은 안구의 분리
이 논문에서
요약
초록
안구 표면 (OS)는 세 개의 연결된 부분으로 상피 시트로 구성되어 있습니다 : 팔피 결막, 구근 결막 및 각막 상피. OS의 중단은 각막염, 결막염 또는 둘 다 (각막결막염)로 이끌어 낼 것입니다. 특정 유전자 변형 또는 인공 수술을 가진 실험 동물 모델에서, OS 상피 시트의 모든 부분을 검사하여 각 부분의 상대적인 병리학적 변화를 병렬로 평가하는 것이 유용하다. 그러나, 왜곡이나 손상없이 전체적으로 OS 조직의 해부는 물리적으로 분리아직 이동 눈꺼풀과 안구에 부착 된 OS의 부드러움과 얇음으로 인해, 도전하고있다. 또한, 단단한 두개골 /궤도 뼈에 의해 형성 된 깊은 눈 소켓은 완전히 해부를 작동하기위한 제한된 공간을 떠나 안구에 의해 점유된다. 그 결과, 안구를 얼굴 측에서 연관된 OS 조직과 직접 해부하면 종종 조직 손상, 특히 팔근과 구근 결막으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이등분 마우스 머리에서 두개골과 궤도 뼈를 순차적으로 제거하고 눈꺼풀, 안구 표면, 렌즈 및 망막을 한 조각으로 모두 남기는 방법을 설명했습니다. OS 시트의 무결성은 잘 보존되었고 단일 섹션에서 역사학 또는 면스테인에 의해 검사 될 수 있었습니다.
서론
안구 표면은 팔모골 결막, 구근 결막 및 각막1을포함한 국부상피의 연속 시트로 구성됩니다. 많은 선 구조는 안구 표면 상피와 연관되어 있으며 함께 건조 및 환경 침입으로부터 각막 표면을 보호하는 눈물 막층을 생성한다2. OS의 중단은 각막염, 결막염 또는 둘 다 (각막결막염)로 이끌어 낼 것입니다. 유전 적 요인과 환경 자극제 또는 그 상호 작용모두 OS3,4의병리학적 변경에 기여합니다. 따라서, 다양한 유전자 조작 및 물리적 또는 화학적 유도 동물 모델이 인간 OS의 질병 과정을 연구하는 데 사용되어 왔다.
마우스 OS의 구조와 기능은 여러 면에서 인간의 구조와 기능과 유사합니다. 안구 땀샘에 의해 분비되는 눈물 막 성분은 또한 마우스와 인간 사이에서 유사합니다. 인간의 OS 질환의 해명 기전을 위해 마우스 모델을 사용하여 많은 연구가 수행되었습니다5,6,7. 많은 경우에, 동일한 실험 ....
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프로토콜
마우스의 사용과 관련된 모든 절차는 동물 관리 및 사용위원회, 중산 안과 센터에 의해 승인되었으며, 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다.
1. 안구 표면과 눈꺼풀이 있는 안구 해부
- 머리를 해부하십시오.
- 자궁 경부 탈구에 의해 산후 일 10 (P10) 및 P28 마우스 (마우스 균주에 대한 재료의 표 참조), 날카로운 가위 쌍에 의해 목에서 머리를 잘라.
- 시상 중간선을 따라 직선 가위를 한 쌍의 이분 머리는 비강에 rostrally 에서 시작(그림 1A,B).
참고 : 두개골 뼈는 마우스 노화로 굳어지며 가위를 가능한 한 중간선을 따라 자르지 않도록주의하십시오. - 이등분된 머리의 각 절반을 깨끗한 페트리 접시에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 턱과 혀를 먼저 잘라냅니다. 시신경을 시신경을 시신경이 시신경 위치 이전에 절단하여 제거하고 두개골 벽에 부착된 후각 전구를 포함한 모든 뇌 조직을 제거합니다.
- 이제 나머지 조직은 안구와 관련된 모든 두개골 / 궤도 뼈를 가져야합니다
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결과
다른 관점에서 본 주요 두개골 뼈는 그림 1A-E에설명되어 있으며 색상은 서로 다른 골격을 나타내고 있습니다. 우리는 해부 과정의 데모를 위해 4 주 된 동물을 사용했습니다. 해부 단계 1.1.1-1.1.3 및 짧은 접두사(단계 1.1.4)에 이어, 관련 안면 골격을 가진 안구는 도 1E에서입증된다. 전방(비강 및 상전)과 후방(예를 들어, 정수리)뿐만 아니라 안구 위에 주로 상악골과 정면 뼈를 가진 조직 블록을 생성한 에스모이드 뼈를 제거하기 위한 트리밍(도1F). 도 1F에서 지정된 부위에 따라 이러한 뼈를 순차적으로 제거하여 하데린 선.......
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토론
온전한 안구의 준비를 위한 중요한 알림은 모든 궤도 뼈, 특히 작은 눈 소켓의 바닥 근처에 있는 juga 및 상구 뼈를 완전히 제거해야 한다는 것입니다. 남은 뼈는 계속되는 역학을 복잡하게 할 수 있습니다. 뼈의 작은 조각이 우연히 해부에서 완전히 제거되지 않은 경우, 그것은 샤프 트위즈 의 쌍을 사용하여 포함 파라핀 블록에서 선택 될 수있다. 남은 구멍은 이 수술 후 녹은 파라핀으로 채워져야 합니다.
렌즈를 다룰 때는 추가주의를 기울여야 합니다. 깨진 렌즈 조각은 일반적으로 전체 섹션을 통해 흩어져 있습니다. 이것은 현미경 검사 및 심상 분석에 상당히 영향을 미칠 것입니다. 렌즈를 제거하려고 하면 안구 표면(안면 쪽에서 수술이 수행된 경우) 또는 망막(수술이 망막의 광학 디스크 측에서 나온 경우)이 손상될 수 있습니다. 해부없이 렌즈 조직의 존재의 부정적인 영향을 감소시키는 또 다른 방법은 단면 방향을 변경하는 것입니다. 예를 들어, 안구 표면 형태를 저장하려면 파라핀 블록의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 원고의 비판적 독서에 대한 룽 주 교수에게 감사하고, 기술 지원에 대한 모든 실험실 구성원. 이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (NSFC: 31571077)의 보조금에 의해 지원되었다; 중국 베이징, 광저우 시 과학 및 기술 혁신 프로젝트 (201707020009; 광저우, 광동성, 중국), "100 인 계획" 선 야센 대학에서 (8300-18821104; 광저우, 광동성, 중국), 중산 안과 센터에서 안과의 국가 핵심 연구소에서 연구 자금 (303060202400339; 광저우, 광동성, 중국).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1&시간; 인산염 완충 식염수(PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml 원심분리기 튜브 | Corning | 430829 | |
| 접착 현미경 슬라이드 | 다양한 | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | 권장 농도 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | 권장 농도 1:500 - 1,000 |
| 항-K12 항체 | Abcam | ab124975 | 권장 농도 1:1,000 |
| 항-K14 항체 | Abcam | ab7800 | 권장 농도 1:800 |
| 구연산 | 다양한 | ||
| 커버 슬라이드 | 다양한 | ||
| 곡선 겸자 | 세계 정밀 기기 | 14127 | |
| 해부 현미경. | Olmpus | SZ61 | |
| 에틸 알코올 | 다양한 | ||
| 형광 현미경 | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G 장착 매체 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 마이크로 해부 가위 - 스트레이트 블레이드 | 세계 정밀 기기 | 503242 | |
| 전자 레인지 | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| 마우스 균주 | C57 / BL6 및 Sv129 혼합 | ||
| No.4 스트레이트 집게 | 세계 정밀 기기 | 501978-6 | |
| 일반 염소 혈청 | 다양한 | ||
| 파라 포름 알데히드 (PFA) | 다양 | 한 4 % 용액을 1 회 준비; PBS 및 0.45&mu로 필터링; m 여과기 막 | |
| 조직 배양 접시 | 각종 | ||
| Trisodium 구연산염 | 각종 | ||
| Triton X-100 | 시그마 Aldrich | SLBW6818 |
참고문헌
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al.
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재인쇄 및 허가
