Method Article

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

Abstract

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중추 신경계 (CNS)의 신경 염증 상태는 생리적 및 병리학적 조건에서 중요한 역할을합니다. Microglia, 뇌에 상주 면역 세포, 때로는 침투 골수 파생 대 식 세포 (BMDMs), CNS에서 그들의 미세 환경의 염증 성 프로필을 조절. 면역 세포에서 세포 외 소포 (EV) 인구가 면역 중재자로 작동한다는 것은 지금 받아들여집니다. 따라서, 그들의 수집 및 격리는 그들의 내용을 확인 하지만 또한 받는 사람 세포에 그들의 생물학적 효과 평가 하는 것이 중요 하다. 현재 데이터는 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계를 포함한 미세글리아 세포 또는 혈액 대식세포로부터의 EV 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. 비표적 프로테오믹 분석은 EV 마커로서 단백질 시그니처의 유효성을 검증하고 생물학적 활성 EV 함량을 특징으로 합니다. Microglia 유래 EV는 또한 신경세포의 1차 배양에 기능적으로 사용되어 뉴라이트 의 면역 매체로서의 중요성을 평가했습니다. 결과는 마이크로글리아 유래 전기 자동차체가 시험관 내에서 신경이염 의 자생을 촉진하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 병행하여, 혈액 대식세포 유래 EV는 C6 신경교종 세포의 스페로이드 배양물에서 면역 매개체로서 기능적으로 사용되었고, 이들 EV가 시험관내 신경교종 세포 침범을 제어한다는 것을 보여주는 결과. 이 보고는 EV 매개면역 세포 기능을 평가하는 가능성을 강조하지만 또한 그러한 통신의 분자 기지를 이해합니다. 이 해독은 CNS 병리학의 미세 환경에서 면역 특성을 모방하기 위해 천연 소포 및 / 또는 치료 소포의 시험관 내 준비의 사용을 촉진 할 수 있습니다.

Introduction

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많은 신경병학은 점점 더 고려되는 복잡한 기계장치인 신경 선동적인 상태와 관련있습니다, 그러나 면역 프로세스가 다양하고 세포 환경에 달려 있기 때문에 아직도 제대로 이해되지 않습니다. 실제로, CNS 무질서는 체계적으로 동일 활성화 신호 및 면역 세포 인구를 관련시키지 않으며 따라서 프로-또는 항염증 반응은 병리학의 원인 또는 결과로 평가하기 어렵습니다. "microglia"라고 불리는 뇌 상주 대식세포는 신경과 면역 계통 사이의 인터페이스에 있는 것처럼 보입니다1. 미세글리아는 골수성 기원을 가지며 원시 조혈 동안 노른자 낭으로부터 유래되어 뇌를 식민지화하는 반면, 말초 대식세포는 말초 대식세포가 되기 위한 확실한 조혈 동안 태아 간에서 유래된다2. 마이크로글리아 세포는 성상세포 및 올리고엔드로시트와 같은 뉴런 및 뉴런 유래 신경교세포와 통신한다3. 최근 몇 차례의 연구는 마이크로글리아가 CNS 발달 및 성인 조직 항상성 동안 신경성 가소성에 관여하고 있으며, 또한 신경퇴행성 질환과 관련된 염증 성 상태에서4,,5. 그렇지 않으면, 혈액 뇌 장벽의 무결성 다른....

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Protocol

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1. 마이크로 글리아 / 대식세포의 기본 문화

  1. 마이크로 글리아의 기본 문화
    1. 배양 상업용 쥐 1차 마이크로글리아(2 x 106 세포) (재료 표참조) 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 10% 엑소좀 프리 혈청, 페니실린 100 U/mL, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 37°C에서 9.0 g/L 포도당으로 보충됨2
    2. 48시간 배양 후 컨디셔닝된 배지를 수집하고 전기자동차의 격리를 진행한다.
  2. 대식 세포의 기본 문화
    1. 배양 상용 랫트 1차 대식세포(1 x 106 세포)를 제조자가 제공하는 배지에서 (재료표참조) 37°C 및 5%CO2에서,엑소좀프리 혈청과 함께.
    2. 24시간 배양 후 컨디셔닝된 배지를 수집하고 전기자동차의 격리를 진행한다.

2. 전기 의 격리

  1. 컨디셔닝 매체로부터 전기 자동차 사전 분리
    1. 조건부 배양....

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Results

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세포외 소포(EV)에 생물학적 효과를 어트리뷰팅하는 주요 과제 중 하나는 전체 배양 배지에서 EV를 분리하는 기능입니다. 이 보고서에서는 EV 마커를 검증하고 생리 활성 화합물을 식별하기 위해 단백질 시그니처의 대규모 분석에 결합된 초원심분리(UC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 방법을 제시합니다. 대식세포-또는 마이크로글리아 유래 EV는 각각 24시간 또는 48시간 배양 후 컨디셔닝된 배지로부터 분리되었다(도1).

figure-results-1
그림 1: 세포외 소포(EV) 수집 및 격리 전략. 세포자자리 몸체 및 세포 파편은 연속적인 원심분리 단계에 의해 마이크로글리아-또는 대식세포 조절 배지로부터.......

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Discussion

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중추 신경계 (CNS)는 세포 간 통신이 항상성에 필요한 정상적인 신경 기능을 조절하는 복잡한 조직입니다30. 전기자동차는 현재 세포간 통신을 위한 중요한 분자화물(31)으로널리 연구되고 기술되고 있다. 그(것)들은 특히 건강하고 병리학적인 조건에 있는 그들의 기능에 영향을 미치는 수신자 세포에 중재자의 칵테일을 전달합니다32. 최근 연구에 따르면 EV는 CNS24,33,,34 및 특히 뇌 면역 세포35,,36에서중요한 역할을 합니다., 프로-항 염증 면역 반응 사이의 균형은 중요 하 고 시 냅 스 개발 및 일생 동안 신경 활동 하는.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 작품은 미니스테르 드 L'Education Nationale, 드 L'Enseignement 수페리어 에 드 라 레체르슈와 INSERM에 의해 지원되었다. 우리는 악기및 기술 자문에 대한 액세스 BICeL- 캠퍼스 과학 도시 시설을 감사하게 인정합니다. 장 파스칼 지메노, 소울라이마네 아불루아르, 이자벨 푸르니에가 질량분광에 도움을 주신 것을 진심으로 감사드립니다. 타니나 아랍, 크리스텔 반 캠프, 프랑수아 르 마레크-크로크, 야코포 비지올리, 피에르 에릭 소티에르가 과학 기술 발전에 크게 기여한 것을 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% 미니-프로테안  TGX 프리캐스트 단백질 젤Bio-rad4561045EDU 
아세토니트릴피셔 화학제품A955-1 
Amicon 50 kDa 원심 필터MerckUFC505024 
암모늄 바이카보네이시그마-알드리치9830 
HSP90 α/β 항체 (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 플러스 보충제GibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex 믹서벤치마크 과학BV1003 
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액 (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTips머크 밀리포어ZTC18S096 
C6 쥐 신경교종 세포ATCCATCC CCL-107 
표준 튜브Sarstedt62.554.002 
원심분리기Eppendorf5804000010 
CO2 인큐베이터ThermoFisher  
컨포칼 현미경 LSM880Carl ZeissLSM880 
커버 글라스Marienfeld111580 
배양 접시 (60mm)Sarstedt82.1473 
디티오트레이톨시그마-알드리치43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 액체 크로마토그래프ThermoFisher  
전자현미경 JEM-2100JEOL  
에틸렌 글리콜 - 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N 프라임 , N 프라임 - 테트라 아세트산시그마 - 알드리치03777-10G 
에틸렌디아민테트라아세트산시그마-알드리치ED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1엑소좀 고갈 FBS
ExoCarta 데이터베이스 (Evs의 상위 100개 단백질)  http://www.exocarta.org/
소 태아 세럼Gibco16140071 
태아 호스 세럼BiowestS0960-500 
필트로푸르 S 0.2사르슈테트83.1826.001 
피셔브랜드  프로브가 있는 Q500 초음파 발생기Fisherbrand12893543 
FlexAnalysis브루커  
형광 장착 매체AgilentS3023 
포름산시그마-알드리치695076 
Formvar-carbon 코팅 구리 그리드Agar scientific LtdAGS162-3 
포도당시그마-알드리치G8769 
글루타르알데히드시그마-알드리치340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
이도아세트아미드시그마-알드리치I1149 
InstantBlue Coomassie 단백질 스테인익스페디온ISB1L 
도립 광 현미경 CKX53Olympus  
L-글루타민Gibco25030-024 
LabTek II 8 웰  Nunc154534 
Laemmli 2x바이오 라드1610737 
라미닌코닝354232 
MaxQuant 소프트웨어(단백질 식별 소프트웨어)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT 폴란드 스텔브루커8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
메틸셀룰로오스시그마-알드리치M6385-100G 
MiliQ 워터머크 밀리포어  
밀크레질레이트REGILAIT300 
Mini PROTEAN 수직 전기영동 셀Bio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC 컬럼GE 헬스케어 더 이상 사용할 수 없습니다
나노사이트 NS300맬번 파날리티칼NS300 
NanoSight NTA 소프트웨어 v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight 주사기 펌프Malvern Panalytical  
뉴로기저깁코21103-049 
니트로셀룰로오스 멤브레인GE 헬스케어10600007 
노니뎃 P-40플루카56741 
Nunc 멀티디쉬 24 웰ThermoFisher82.1473 
파라포름알데히드전기 현미경 과학15713 
PC-12 세포주ATCCATCC CRL-1721 
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122 
펩타이드 보정 믹스LaserBio LabsC101 
Peroxidase Affini순수 염소 안티 마우스 IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus 소프트웨어(식별된 단백질 처리)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
페닐메탄설포닐 플루오라이드시그마-알드리치78830 
인산염 완충액 식염Invitrogen14190094칼슘 없음, 마그네슘
pluriStrainer M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
폴리-D-라이신시그마-알드리치P6407 
폴리카보네이트 원심분리기 튜브Beckman Coulter355651 
프로테아제 억제제Sigma-AldrichS8830-20TAB 
PureCol세포 시스템5005 
Q-Exactive 질량분석기ThermoFisher  
rapifleX 질량 분석기Brucker  
쥐 피질 신경 세포응용R882N-20세포 기원 : 18 일째 배아 Sprague Dawley 쥐의 뇌 피질에서 파생
쥐 대식 세포 & 마이크로글리아 배양 중간세포 응용 프로그램R620K-100세포 원본 : 정상 건강한 쥐 뼈 골수
쥐 주요 대식 세포세포 응용 프로그램R8818-10a 
쥐의 기본 마이크로아그리아LonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE 헬스케어17014001 
시퀀싱 등급 변형 트립신PromegaV5111 
슬라이드더스터100204 
염화나트륨ScharlauSO0227 
나트륨 도데실 설페이트 시그마-알드리치L3771 
나트륨 플루오라이드시그마-알드리치S7920-100G 
수산화나트륨ScharlabSO0420005P 
나트륨 피로인산Sigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac 진공 농축기ThermoFisher  
스트링 소프트웨어(기능성 단백질 결합 네트워크)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura 확장 기간 기판ThermoFisher34075 
주사기 1.0 mL테루모8SS01H1 
Trans-Blot SD 반건조 전사 세포Bio-Rad1703940 
트리플루오로아세트산시그마-알드리치T6508 
트리스인터침UP031657 
트리스-글리신EuromedexEU0550 
트윈 20시그마-알드리치P2287 
초원심분리기Beckman CoulterA95765 
초원심분리기 로터 70.1 TiBeckman Coulter342184 
우라닐 아세테이트한천 과학 주식 회사AGR1260A 
Whatman 필터 페이퍼 Sigma-AldrichWHA10347510 
&알파;-시아노-4-하이드록시신남산시그마-알드리치C2020-25G 
트 라 수 염

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

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