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방법 논문

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

6.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60118

⸱

2020년 6월 2일

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

이 논문에서

요약

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

초록

중추 신경계 (CNS)의 신경 염증 상태는 생리적 및 병리학적 조건에서 중요한 역할을합니다. Microglia, 뇌에 상주 면역 세포, 때로는 침투 골수 파생 대 식 세포 (BMDMs), CNS에서 그들의 미세 환경의 염증 성 프로필을 조절. 면역 세포에서 세포 외 소포 (EV) 인구가 면역 중재자로 작동한다는 것은 지금 받아들여집니다. 따라서, 그들의 수집 및 격리는 그들의 내용을 확인 하지만 또한 받는 사람 세포에 그들의 생물학적 효과 평가 하는 것이 중요 하다. 현재 데이터는 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계를 포함한 미세글리아 세포 또는 혈액 대식세포로부터의 EV 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. 비표적 프로테오믹 분석은 EV 마커로서 단백질 시그니처의 유효성을 검증하고 생물학적 활성 EV 함량을 특징으로 합니다. Microglia 유래 EV는 또한 신경세포의 1차 배양에 기능적으로 사용되어 뉴라이트 의 면역 매체로서의 중요성을 평가했습니다. 결과는 마이크로글리아 유래 전기 자동차체가 시험관 내에서 신경이염 의 자생을 촉진하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 병행하여, 혈액 대식세포 유래 EV는 C6 신경교종 세포의 스페로이드 배양물에서 면역 매개체로서 기능적으로 사용되었고, 이들 EV가 시험관내 신경교종 세포 침범을 제어한다는 것을 보여주는 결과. 이 보고는 EV 매개면역 세포 기능을 평가하는 가능성을 강조하지만 또한 그러한 통신의 분자 기지를 이해합니다. 이 해독은 CNS 병리학의 미세 환경에서 면역 특성을 모방하기 위해 천연 소포 및 / 또는 치료 소포의 시험관 내 준비의 사용을 촉진 할 수 있습니다.

서론

많은 신경병학은 점점 더 고려되는 복잡한 기계장치인 신경 선동적인 상태와 관련있습니다, 그러나 면역 프로세스가 다양하고 세포 환경에 달려 있기 때문에 아직도 제대로 이해되지 않습니다. 실제로, CNS 무질서는 체계적으로 동일 활성화 신호 및 면역 세포 인구를 관련시키지 않으며 따라서 프로-또는 항염증 반응은 병리학의 원인 또는 결과로 평가하기 어렵습니다. "microglia"라고 불리는 뇌 상주 대식세포는 신경과 면역 계통 사이의 인터페이스에 있는 것처럼 보입니다1. 미세글리아는 골수성 기원을 가지며 원시 조혈 동안 노른자 낭으로부터 유래되어 뇌를 식민지화하는 반면, 말초 대식세포는 말초 대식세포가 되기 위한 확실한 조혈 동안 태아 간에서 유래된다2. 마이크로글리아 세포는 성상세포 및 올리고엔드로시트와 같은 뉴런 및 뉴런 유래 신경교세포와 통신한다3. 최근 몇 차례의 연구는 마이크로글리아가 CNS 발달 및 성인 조직 항상성 동안 신경성 가소성에 관여하고 있으며, 또한 신경퇴행성 질환과 관련된 염증 성 상태에서4,,5. 그렇지 않으면, 혈액 뇌 장벽의 무결성 다른 CNS 병 리에서 손상 될 수 있습니다. 면역 반응, 특히 교모세포종 다형성암에서, 혈관신생 과정과 림프혈관의 존재를 통해 혈액 뇌 장벽이 재구성됨에 따라 미세글리아 세포에 의해서만 지원되지 않는다6,,7. 따라서, 큰 골수 유래 대식세포(BMDMs) 침윤은 종양 의존성 혈관신생 기전 전반에 걸쳐 뇌종양에서 발생한다8. 암세포는 면역억제성질 및 종양성장으로 이어지는 침투된 BMDM에 상당한 영향을 미친다9. 따라서 면역세포와 이들의 뇌 미세환경 간의 통신은 세포 기원 및 활성화 신호가 다양함에 따라 이해하기 어렵다10,,11. 생리적 조건에서 면역 세포 관련 분자 서명의 기능을 체포 하는 이렇게 재미 있다. 이와 관련하여, 면역 세포와 세포 미세환경 사이의 세포-세포 통신은 세포외 소포(EV)의 방출을 통해 연구될 수 있다.

전기자동차는 병리학적 조건뿐만 아니라 건강한 면역기능의 조절에서 점점 더 많이 연구되고 있다12,,13. 엑소좀과 마이크로베시클 2마리를 고려할 수 있습니다. 그(것)들은 다른 생물학 및 크기 범위를 제출합니다. 엑소좀은 ~ 30-150 nm 직경의 소포이며 내분계에서 생성되고 혈장 막과 다기관 (MVBs)의 융합 동안 분비됩니다. 상기 마이크로베식은 직경이 약 100-1,000 nm이고세포혈장막(14)으로부터바깥쪽으로 신진하여 생성된다. 엑소좀 대 마이크로비시클 의 차별은 크기와 분자 패턴에 따라 실현하기 어렵기 때문에 본 보고서에서는 EV라는 용어만 사용할 것입니다. CNS에 있는 EV 관련 커뮤니케이션은 선충, 곤충 또는 annelids15,,16를포함하여 무척추 동물 종에 그들의 관여를 보여주었기 때문에 조상 기계장치를 나타냅니다. 더욱이, 전기자동차가 상이종의 세포와 통신할 수 있다는 것을 보여주는 결과는 소포와 수용자 세포 사이의 표면 분자 인식에 기초한 키-잠금 시스템으로 이 메커니즘을 입증한 다음, 매개체16,,17의섭취를 허용한다. 실제로, EV는 단백질(예를 들어, 효소, 신호 전달, 생물발생 인자), 지질(예를 들어, 세라미드, 콜레스테롤) 또는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 miRNAs)과 같은 많은 분자를 함유하고 있어 수용자 세포 활동의 직간접적 조절제로서 작용한다14. 이것이 바로 이 유도론적 연구가 또한 면역 세포에서 수행되어 전기자동차를 분리하고 그들의 단백질 시그니처를 완전히 특성화하는18,,19.

초기 연구는 Wnt3a-또는 세로토닌 의존성 활성화20,,21에따른 유도성 메커니즘으로서 1차 배양된 쥐 마이크로글리아로부터 엑소좀의 방출을 입증했다. 기능적으로 CNS에서, 마이크로글리아 유래 EV는 뉴런 의 흥분성의 제어에 기여하는 뉴런에서 시냅스 말단에 의해 시냅스 소포방출을 조절한다 22,,23. Microglia 유래 EV는 또한 큰 두뇌 지구24,,25에서사이토카인 중재한 선동반응을 전파할 수 있었습니다. 중요한 것은, 통행료 유사 수용체 패밀리를 위한 다양한 리간드가 마이크로글리아26에서EV의 특정 생산을 활성화시킬 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 시험관 내 연구는 LPS 활성화 미세글리아 BV2 세포주가 프로-염증성 사이토카인27을포함하는 차동 EV 함량을 생성한다는 것을 보여준다. 따라서, CNS, 마이크로글리아 및 침투 BMDM에서 면역 세포 하위 집단의 기능적 다양성은 수신자 세포에 대한 EV 영향 및 EV 내용물의 식별을 포함하여 자신의 EV 집단을 통해 평가될 수 있다.

우리는 이전에 그들의 격리16,,19후에 microglia-및 BMDM 유래 전기 의 기능적 특성을 평가하는 방법을 기술했습니다. 본 보고서에서, 우리는 신경구 의 자생에 마이크로 글리아 유래 전기 의 효과, 그리고 신경교종 세포 응집체의 제어에 대식세포 파생 전기 의 효과 독립적으로 평가하는 것이 제안한다. 이 연구는 또한 EV 격리 절차를 검증하고 생물학적 활성 단백질 시그니처를 식별하기 위해 EV 분획의 광범위한 단백질 분석을 제안합니다. 유익한 효과 와 EV 내용물의 분자 해독 그들의 가능한 조작 하 고 뇌 질환에 치료 에이전트로 사용 하는 데 도움이 수 있습니다.

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프로토콜

1. 마이크로 글리아 / 대식세포의 기본 문화

  1. 마이크로 글리아의 기본 문화
    1. 배양 상업용 쥐 1차 마이크로글리아(2 x 106 세포) (재료 표참조) 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 10% 엑소좀 프리 혈청, 페니실린 100 U/mL, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 37°C에서 9.0 g/L 포도당으로 보충됨2
    2. 48시간 배양 후 컨디셔닝된 배지를 수집하고 전기자동차의 격리를 진행한다.
  2. 대식 세포의 기본 문화
    1. 배양 상용 랫트 1차 대식세포(1 x 106 세포)를 제조자가 제공하는 배지에서 (재료표참조) 37°C 및 5%CO2에서,엑소좀프리 혈청과 함께.
    2. 24시간 배양 후 컨디셔닝된 배지를 수집하고 전기자동차의 격리를 진행한다.

2. 전기 의 격리

  1. 컨디셔닝 매체로부터 전기 자동차 사전 분리
    1. 조건부 배양 배지를 마이크로글리아 또는 대식세포 배양물(단계 1.1.2 또는 1.2.2단계)에서 원엽 관으로 옮김을 전달한다.
    2. 1,200 x g에서 실온(RT)에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 세포를 펠렛한다.
    3. 상급체를 새 원유관으로 옮김. RT에서 20분 동안 1,200 x g의 원심분리기를 사용하여 사멸체를 제거합니다.
    4. 상급체를 10.4 mL 폴리 카보네이트 튜브로 옮기고 튜브를 70.1 Ti 로터로 옮니다. 100,000 x g의 초원심분리기는 4°C에서 90분 동안 전기를 펠렛한다.
    5. 상판을 버리고 0.20 μm의 0.20 μM의 EV를 함유하는 펠릿을 재중단하여 여과된 인산완충염(PBS)을 하였다.
  2. 전기 자동차 분리
    1. 집에서 만든 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (SEC)의 준비
      1. 유리 크로마토그래피 컬럼(길이: 26cm, 직경: 0.6 cm)을 비우십시오(재료 표참조), 세척하고 살균하십시오.
      2. 기둥 아래쪽에 60 μm 필터를 놓습니다.
      3. 가교 아가로즈 겔 여과 염기 매트릭스로 컬럼을 쌓아 직경 0.6 cm 및 높이 20cm의 고정상을 만듭니다.
      4. 0.20 μm 여과 된 PBS의 50 mL로 위상을 헹구다. 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관하십시오.
    2. 다시 일시 중단된 EV 펠릿을 SEC 열의 고정 단계 위에 놓습니다.
    3. 컬럼의 건조를 방지하기 위해 고정상 상단에 0.20 μm 의 여과된 PBS를 계속 추가하면서 250 μL의 20개의 순차적 분획을 수집합니다. 필요한 경우 분획을 -20°C에 보관하십시오.
      참고: 분자 분석을 위한 EV 무결성을 유지하기 위해 -80°C에서 1주일 이상 보관할 수 있습니다.
  3. SEC 분획의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 질량 분석
    1. 섹션 2.2에 설명된 대로 EV 격리를 진행합니다.
    2. 200 μL의 펩타이드 교정 혼합 용액으로 EV 펠릿을 다시 일시 중단합니다(재료 표참조).
    3. 섹션 2.2.1 ~ 2.2.3에 설명된 대로 EV 컬렉션을 진행합니다.
    4. 진공 농축기로 분획을 완전히 건조시면 됩니다.
    5. 분획을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)의 10 μL로 재구성합니다.
    6. MALDI 연마 강판 에 α 시아노-4-하이드록시나믹 산 (HCCA) 매트릭스의 1 μL과 재구성 된 분획의 1 μL을 혼합합니다.
    7. MALDI 질량 분석계로 모든 분획을 분석합니다.
    8. 전용 소프트웨어로 생성된 스펙트럼을 분석합니다(재료 표참조).

3. 전기자동차의 특성화

  1. 나노 입자 추적 분석 (NTA)
    참고:     NTA 분석은 나노입자 추적 분석 기기(재료 표참조)와 자동 주사기 펌프로 수행됩니다.
    1. 0.20 μm 여과 된 PBS로 단계 2.2.3에서 각 SEC 분획의 희석 (1 : 50 ~ 1 : 500 범위)을 만듭니다.
    2. EV 응집체를 제거하는 솔루션을 소용돌이.
    3. 희석된 용액을 1mL 주사기에 넣고 자동 주사기 펌프에 넣습니다.
    4. 카메라 설정을 화면 이득 수준(3) 및 카메라 수준(13)으로 조정합니다.
    5. 실행을 클릭하고 다음 스크립트를 시작합니다.
      1. 분석 챔버에서 샘플을 로드합니다(주입 속도: 15초에 1,000).
      2. 비디오 녹화를 위한 속도 흐름을 감소시키고 안정화합니다(주입 속도: 15초에 25). 파티클 흐름의 3개의 연속 60s 비디오를 캡처합니다.
      3. 비디오 분석 전에 카메라 레벨(13)과 검출 임계값(3)을 조정합니다. 설정 | 클릭 분석을 시작하고 분석이 완료되면 내보내기를 클릭합니다.
    6. 각 분획 분석 사이에 0.20 μm 의 1 mL로 세척하여 여과된 PBS를 여과합니다.
  2. 전자 현미경 검사법 (EM) 분석
    1. 섹션 2에 설명된 대로 전기를 분리합니다.
      참고: 멸균 조건은 필요하지 않습니다.
    2. 섹션 3.1을 반복하여 전기 를 정량화합니다.
      참고: EM 분석에는 양수 분수만 사용됩니다.
    3. 50kDa 원심 필터(재료 표참조)를 사용하여 EV 함유 SEC 분획을 집중시킵니다.
    4. 농축 된 전기 전기 를 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 30 μL로 다시 일시 중단하십시오.
    5. 시료의 10 μL을 탄소 코팅 구리 그리드에 적재합니다.
    6. 젖은 환경에서 20 분 동안 배양하십시오.
    7. 그리드에서 시료를 잘 흡수하기 위해 3.2.5 단계와 3.2.6단계를 반복합니다.
    8. RT에서 5 분 동안 PBS에서 1 % 글루타랄데히드 한 방울로 그리드를 옮김.
    9. 샘플을 초순수로 여러 번 세척하십시오.
    10. 얼음에 10 분 동안 샘플을 대조 4 % 우라닐 아세테이트와 2 % 메틸 셀룰로오스 (1 : 9, v / v)의 혼합물. 필터 페이퍼를 사용하여 혼합물의 과잉을 제거합니다.
    11. 샘플을 건조시키고 200 kV에서 투과 전자 현미경으로 관찰하십시오 (재료 표참조).
  3. 웨스턴 블롯 분석
    1. 단백질 추출
      1. 3.2.1 ~ 3.2.3 단계를 반복하여 전기 를 분리하고 농축하십시오.
      2. RIPA 완충제 50 μL (150 mM 염화나트륨 [NaCl], 50 mM 트리스, 5 mM 에틸렌 글리콜-비스 (2-아미노틸레더)-N,N,N′, N′, N′,N′-테트라 아세트산 [EGTA], 2 mMM에틸렌디아민 테트라아세트산 [EDT], EDT 100 mM 불소 나트륨 [NaF], 10 mM Pyrophosphate, 1% 노니데트 P-40, 1 mM 페닐메탄술포닐 불소 [PMSF], 1x 프로테아제 억제제) EV 샘플 (필터에 EV 농도에서 유래 25 μL) 단백질을 추출하기 위해 5 분 동안.
      3. 5 s (진폭 : 500 W; 주파수 : 20 kHz의)에 대한 소음, 얼음에 3 번.
      4. 4 °C에서 10 분 동안 20,000 x g에서 원심 분리로 반분리를 제거하십시오.
      5. 상급체를 수집하고 브래드포드 단백질 분석 방법으로 단백질 농도를 측정합니다.
    2. 나트륨 도데실 황산폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 및 서쪽 블로팅
      1. 단백질 추출물(30 μg)을 5c Laemmli 샘플 버퍼(v/v)와 혼합합니다.
      2. 단백질 믹스를 12% 폴리아크릴아미드 젤에 적재합니다.
      3. TGS 완충액(25 mM Tris pH 8.5, 192 mM 글리신 및 0.1% SDS)으로 젤내의 단백질을 15분 동안 70V, 45분 동안 120V로 마이그레이션합니다.
      4. 단백질을 반건조 시스템으로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 30분 동안 230V로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮기십시오.
      5. 차단 완충제 (0.05 % 트웬 20 w / v, 0.1 M PBS, pH 7.4에서 5 % 분유 w / v)로 RT에서 1 시간 동안 멤브레인을 포화시킵니다.
      6. 차단 완충액에서 희석된 마우스 단일클론 항-인간 열 충격 단백질 90(HSP90) 항체로 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양한다(1:100).
      7. 멤브레인을 PBS-Tween(PBS, 0.05% 트웬 20 w/v)으로 15분 동안 세 번 세척합니다.
      8. 차단 완충액에서 희석된 염소 고추냉이 과산화 페록시다아제 와 함께 RT에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다(1:10,000).
        참고: 음성 대조는 이차 항체를 단독으로 사용하여 수행됩니다.
      9. 세탁 단계(3.3.2.7 단계)를 반복합니다.
      10. 향상된 화학 발광 (ECL) 서쪽 블로팅 기판 키트로 멤브레인을 공개하십시오 (재료 표참조).
  4. 프로테오믹 분석
    1. 단백질 추출 및 인젤 소화
      1. 3.2.1에서 3.2.3 단계까지 반복하여 전기 를 분리하고 집중하십시오. EV 단백질 추출을 위해 3.3.1 단계를 반복합니다.
      2. 12% 폴리아크릴아미드 겔의 스태킹 겔에서 단백질 이동을 수행합니다.
      3. RT에서 20 분 동안 쿠마시 블루로 젤의 단백질을 고정하십시오.
      4. 각 컬러 젤 조각을 절제하고 1mm3의작은 조각으로 잘라.
      5. 각 용액의 300 μL로 연속적으로 겔 조각을 세척하십시오 : 15 분 동안 초순수, 100 % 아세토니트릴 (ACN) 15 분, 100 mM 암모늄 중탄산염 (NH4HCO3)15 분, ACN : 100 mMNH4HCO3 (1:1, v / v) 15 분, 10 분 동안 연속 적으로 10 % 교반.
      6. 진공 농축기로 완전히 젤 조각을 건조시면 됩니다.
      7. 56°C에서 1시간 동안 10 mMM dithiothreitol을 함유한 100 mMNH4HCO3의 100 μL로 단백질 감소를 수행합니다.
      8. 100 mM NH4HCO3의 100 μL로 단백질 알킬화를 수행하여 RT에서 어둠 속에서 45 분 동안 50 mM 요오도아세타미드를 함유합니다.
      9. 각 용액의 300 μL로 젤 조각을 연속적으로 세척하십시오: 15분 동안 NH4HCO3의 100 mM, ACN:20 mM NH4HCO 3(1:1, v/v) 15분, 100% ACN을 연속 교반으로 5분 동안 세척합니다.3
      10. 진공 농축기로 젤 조각을 완전히 건조시면 됩니다.
      11. 37°C에서 20 mM NH4HCO3에서 50 μL의 트립신(12.5 μg/mL)으로 단백질 소화를 수행합니다.
      12. 37°C에서 30분 동안 50 μL의 100% ACN으로 젤에서 소화된 단백질을 추출한 다음, RT에서 15분간 연속 교반하였다.
      13. 20 mM NH4HCO3 용액에서 5% TFA의 50 μL을 연속 교반으로 20 분 동안 다음 추출 절차를 두 번 반복하십시오.
      14. 100 μL의 100 μL을 10분 동안 연속 교반하여 10분간 추가합니다.
      15. 진공 농축기가 있는 건조 소화 된 단백질을 0.1 % TFA의 20 μL에서 다시 중단하십시오.
      16. C18 역상 매체를 사용하여 10 μL 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 탈염 및 농축하는 펩티드(재료 표참조) 및 ACN:0.1% 포믹산(FA)(80:20, v/v)으로 펩티드를 용출합니다.
      17. 진공 농축기로 시료를 완전히 건조시키고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 위해 ACN:0.1% FA(2:98, v/v)의 20μL로 재중단합니다.
    2. LC-MS/MS 분석
      1. 소화된 펩티드를 LC-MS/MS 계측기에 적재하고 다른42에상세히 기술된 파라미터에 따라 샘플 및 데이터 분석을 수행한다.
    3. 원시 데이터 분석
      1. 질량 분석 데이터를 처리하여 단백질을 식별하고 각 시료의 확인된 단백질을 표준 매개 변수를 사용하여 정량적 프로테오믹스 소프트웨어 패키지와 비교합니다.
      2. 표준 매개 변수를 사용하여 단백질 네트워크 및 생물학적 프로세스를 예측하는 소프트웨어에서 EV 양성 샘플의 배타적이고 과도하게 표현된 단백질 목록을 수출합니다.
      3. 엑소카르타 오픈 액세스 데이터베이스의 상위 100개의 EV 마커와 분획에서 확인된 단백질 목록을 비교합니다(재료 표참조).

4. 기능적 전대 효과 분석

  1. PC-12 세포주에서의 노이라이트 아웃성장 분석
    1. 배양 PC12 세포주 전체 DMEM 배지(2 mM L-글루타민, 10% 태아 말 혈청(FHS), 5% 태아 소 혈청(FBS), 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신).
      참고: 혈청은 전체 절차에서 엑소좀 무료입니다.
    2. 커버 유리 (모든 우물)를 24 웰 플레이트에 추가하십시오. 폴리-D-리신 (0.1 mg / mL)과 씨앗 260,000 세포 / 잘 플레이트를 코팅합니다.
    3. 5%CO2에서 37 °C에서 세포를 배양합니다.
    4. 배양 24시간 후, 배지를 DMEM 분화 배지(DMEM 2 mM L-글루타민, 0.1% FHS, 100 UI/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신)와 1 x 106 마이크로글리아 EV(단계 1.1.2)로 변경합니다.
      참고: 제어 조건은 분화 배지에서 마이크로글리아 EV 없이 수행된다.
    5. 4일째에, 모든 우물을 100 μL의 완전한 DMEM 배지로 적재하십시오.
    6. 파종 후 7일째에, RT에서 20분 동안 4% PFA로 세포를 고치고 PBS로 3회(각 10분)를 헹구어 보시고.
    7. 로다민-컨쥬게이트 파할로이드로 세포를 4°C에서 30분 동안 염색하고 PBS로 3회(각 10분)를 헹구세요.
    8. 희석 된 Hoechst 33342 (1: 10,000)로 세포를 RT에서 30 분 동안 얼룩지게하고 PBS로 3 회 (각 10 분)를 헹구습니다.
    9. 형광 마운팅 매체가 있는 슬라이드에 커버 유리를 장착합니다(재료 표참조).
    10. 공초점 현미경으로 슬라이드를 분석하고 각 슬라이드의 5 개의 임의의 이미지를 가져 가라.
    11. 다른 곳에서 상세히 설명한 바와 같이 자동화된 정량화 소프트웨어(총 뉴라이트 길이)를 사용하여 neurite 의 성장을측정합니다(43.)
  2. 쥐 1 차 적인 뉴런에 Neurite 파생
    1. 폴리-D-리신(0.1 mg/mL)과 라미닌(20 μg/mL)으로 8웰 유리 슬라이드를 코팅합니다.
    2. 배양 랫트 상업적 1차 뉴런을 적절한 배양 배지에서(재료표참조)에 웰당 50,000개의 세포를 도금하고 37°C에서 5%CO2 미만에서 세포를 48시간 동안 배양하였다.
      참고: 혈청은 전체 절차에서 엑소좀이 없습니다.
    3. 1 x 106 마이크로글리아 EV를 뉴런 배양 배지에 넣고 37°C에서 5%CO2 미만에서 배양하여 48시간 더 추가합니다.
      참고: 제어 조건은 뉴런 배양 배지에서 마이크로글리아 EV 없이 수행된다.
    4. 4.1.6단계에서 4.1.9단계로 세포를 수정하고 얼룩을 지도록 하십시오.
    5. 4.1.10 및 4.1.11 단계를 수행하여 슬라이드를 분석합니다.
  3. 신경교종 세포 침략
    1. 완전한 DMEM 배지(10% FBS를 함유한 DMEM, 2 mML-글루타민, 1x 항생제)에서 C6 쥐 신경교종 세포를 20 μL에서 8,000개의 최종 농도에서 5% 콜라겐을 함유하는 재중단.
      참고: 혈청은 전체 절차에서 엑소좀이 없습니다.
    2. 60mm 조직 배양 접시의 바닥에 PBS 5 mL을 놓습니다. 뚜껑의 바닥에 세포 현탁액의 20 μL (8,000 세포)의 뚜껑 및 예금 방울을 반전.
    3. 뚜껑을 PBS 충전 된 바닥 챔버상으로 반전시키고 세포 스페로이드가 형성 될 때까지 72 시간 동안 37 °C 및 5 %CO2에서 플레이트를 배양합니다.
    4. 1 x 108 대식세포 EV(단계 1.2.2)를 2.2 mg/mL 콜라겐 혼합물(소 콜라겐 타입 I 용액 2 mL[3 mg/mL]에 10x 최소 필수 배지(MEM)와 0.1 M M m 수산화 나트륨 500 μL을 첨가합니다.
      참고: 대조군 조건은 콜라겐 혼합물에서 대식세포 EV 없이 수행된다.
    5. 세포 스페로이드를 포함하기 위한 24웰 플레이트에 EV를 함유한 콜라겐 혼합물을 분배한다.
    6. 새로 형성된 세포 스페로이드를 각 우물의 중앙에 이식합니다.
    7. 37°C에서 30분 동안 접시를 배양하고 5%CO2를 배양하여 겔을 고화시다.
    8. 그 후, 각각의 웰에서 콜라겐 매트릭스 위에 완전한 DMEM 배지의 400 μL을 오버레이한다.
    9. 37°C 및 5%CO2에서총 6일 동안 전체 시스템을 인큐베이션한다.
      참고: 스페로이드에서 세포 침공은 4x/0.10 N.A. 목표를 사용하여 반전된 광 현미경을 사용하여 디지털 사진에 의해 감시됩니다.
    10. 매일 각 우물의 이미지를 획득합니다.
    11. 앞서 설명한 바와 같이 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리하고 세포 스페로이드 영역의 침입을 정량화하는42.
      참고: 침략 과 스페로이드 지역은 0 일째에 측정 된 침략과 스페로이드 영역으로 매일 정상화되었다.

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결과

세포외 소포(EV)에 생물학적 효과를 어트리뷰팅하는 주요 과제 중 하나는 전체 배양 배지에서 EV를 분리하는 기능입니다. 이 보고서에서는 EV 마커를 검증하고 생리 활성 화합물을 식별하기 위해 단백질 시그니처의 대규모 분석에 결합된 초원심분리(UC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 방법을 제시합니다. 대식세포-또는 마이크로글리아 유래 EV는 각각 24시간 또는 48시간 배양 후 컨디셔닝된 배지로부터 분리되었다(도1).

figure-results-1
그림 1: 세포외 소포(EV) 수집 및 격리 전략. 세포자자리 몸체 및 세포 파편은 연속적인 원심분리 단계에 의해 마이크로글리아-또는 대식세포 조절 배지로부터...

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토론

중추 신경계 (CNS)는 세포 간 통신이 항상성에 필요한 정상적인 신경 기능을 조절하는 복잡한 조직입니다30. 전기자동차는 현재 세포간 통신을 위한 중요한 분자화물(31)으로널리 연구되고 기술되고 있다. 그(것)들은 특히 건강하고 병리학적인 조건에 있는 그들의 기능에 영향을 미치는 수신자 세포에 중재자의 칵테일을 전달합니다32. 최근 연구에 따르면 EV는 CNS24,33,,34 및 특히 뇌 면역 세포35,,36에서중요한 역할을 합니다., 프로-항 염증 면역 반응 사이의 균형은 중요 하 고 시 냅 스 개발 및 일생 동안 신경 활동 하는...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

제시된 작품은 미니스테르 드 L'Education Nationale, 드 L'Enseignement 수페리어 에 드 라 레체르슈와 INSERM에 의해 지원되었다. 우리는 악기및 기술 자문에 대한 액세스 BICeL- 캠퍼스 과학 도시 시설을 감사하게 인정합니다. 장 파스칼 지메노, 소울라이마네 아불루아르, 이자벨 푸르니에가 질량분광에 도움을 주신 것을 진심으로 감사드립니다. 타니나 아랍, 크리스텔 반 캠프, 프랑수아 르 마레크-크로크, 야코포 비지올리, 피에르 에릭 소티에르가 과학 기술 발전에 크게 기여한 것을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12% 미니-프로테안  TGX 프리캐스트 단백질 젤Bio-rad4561045EDU 
아세토니트릴피셔 화학제품A955-1 
Amicon 50 kDa 원심 필터MerckUFC505024 
암모늄 바이카보네이시그마-알드리치9830 
HSP90 α/β 항체 (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
B27 플러스 보충제GibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex 믹서벤치마크 과학BV1003 
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액 (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTips머크 밀리포어ZTC18S096 
C6 쥐 신경교종 세포ATCCATCC CCL-107 
표준 튜브Sarstedt62.554.002 
원심분리기Eppendorf5804000010 
CO2 인큐베이터ThermoFisher  
컨포칼 현미경 LSM880Carl ZeissLSM880 
커버 글라스Marienfeld111580 
배양 접시 (60mm)Sarstedt82.1473 
디티오트레이톨시그마-알드리치43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 액체 크로마토그래프ThermoFisher  
전자현미경 JEM-2100JEOL  
에틸렌 글리콜 - 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N 프라임 , N 프라임 - 테트라 아세트산시그마 - 알드리치03777-10G 
에틸렌디아민테트라아세트산시그마-알드리치ED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1엑소좀 고갈 FBS
ExoCarta 데이터베이스 (Evs의 상위 100개 단백질)  http://www.exocarta.org/
소 태아 세럼Gibco16140071 
태아 호스 세럼BiowestS0960-500 
필트로푸르 S 0.2사르슈테트83.1826.001 
피셔브랜드  프로브가 있는 Q500 초음파 발생기Fisherbrand12893543 
FlexAnalysis브루커  
형광 장착 매체AgilentS3023 
포름산시그마-알드리치695076 
Formvar-carbon 코팅 구리 그리드Agar scientific LtdAGS162-3 
포도당시그마-알드리치G8769 
글루타르알데히드시그마-알드리치340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
이도아세트아미드시그마-알드리치I1149 
InstantBlue Coomassie 단백질 스테인익스페디온ISB1L 
도립 광 현미경 CKX53Olympus  
L-글루타민Gibco25030-024 
LabTek II 8 웰  Nunc154534 
Laemmli 2x바이오 라드1610737 
라미닌코닝354232 
MaxQuant 소프트웨어(단백질 식별 소프트웨어)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT 폴란드 스텔브루커8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
메틸셀룰로오스시그마-알드리치M6385-100G 
MiliQ 워터머크 밀리포어  
밀크레질레이트REGILAIT300 
Mini PROTEAN 수직 전기영동 셀Bio-Rad1658000FC 
MonoP FPLC 컬럼GE 헬스케어 더 이상 사용할 수 없습니다
나노사이트 NS300맬번 파날리티칼NS300 
NanoSight NTA 소프트웨어 v3.2Malvern Panalytical  
NanoSight 주사기 펌프Malvern Panalytical  
뉴로기저깁코21103-049 
니트로셀룰로오스 멤브레인GE 헬스케어10600007 
노니뎃 P-40플루카56741 
Nunc 멀티디쉬 24 웰ThermoFisher82.1473 
파라포름알데히드전기 현미경 과학15713 
PC-12 세포주ATCCATCC CRL-1721 
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122 
펩타이드 보정 믹스LaserBio LabsC101 
Peroxidase Affini순수 염소 안티 마우스 IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Perseus 소프트웨어(식별된 단백질 처리)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugateSanta-cruzsc-362065 
페닐메탄설포닐 플루오라이드시그마-알드리치78830 
인산염 완충액 식염Invitrogen14190094칼슘 없음, 마그네슘
pluriStrainer M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
폴리-D-라이신시그마-알드리치P6407 
폴리카보네이트 원심분리기 튜브Beckman Coulter355651 
프로테아제 억제제Sigma-AldrichS8830-20TAB 
PureCol세포 시스템5005 
Q-Exactive 질량분석기ThermoFisher  
rapifleX 질량 분석기Brucker  
쥐 피질 신경 세포응용R882N-20세포 기원 : 18 일째 배아 Sprague Dawley 쥐의 뇌 피질에서 파생
쥐 대식 세포 & 마이크로글리아 배양 중간세포 응용 프로그램R620K-100세포 원본 : 정상 건강한 쥐 뼈 골수
쥐 주요 대식 세포세포 응용 프로그램R8818-10a 
쥐의 기본 마이크로아그리아LonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE 헬스케어17014001 
시퀀싱 등급 변형 트립신PromegaV5111 
슬라이드더스터100204 
염화나트륨ScharlauSO0227 
나트륨 도데실 설페이트 시그마-알드리치L3771 
나트륨 플루오라이드시그마-알드리치S7920-100G 
수산화나트륨ScharlabSO0420005P 
나트륨 피로인산Sigma-AldrichS6422-100G 
SpeedVac 진공 농축기ThermoFisher  
스트링 소프트웨어(기능성 단백질 결합 네트워크)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura 확장 기간 기판ThermoFisher34075 
주사기 1.0 mL테루모8SS01H1 
Trans-Blot SD 반건조 전사 세포Bio-Rad1703940 
트리플루오로아세트산시그마-알드리치T6508 
트리스인터침UP031657 
트리스-글리신EuromedexEU0550 
트윈 20시그마-알드리치P2287 
초원심분리기Beckman CoulterA95765 
초원심분리기 로터 70.1 TiBeckman Coulter342184 
우라닐 아세테이트한천 과학 주식 회사AGR1260A 
Whatman 필터 페이퍼 Sigma-AldrichWHA10347510 
&알파;-시아노-4-하이드록시신남산시그마-알드리치C2020-25G 
트 라 수 염

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