3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

종양 미세 환경은 매우 복잡한 틈새 시장이며 종양 세포의 유지및 진행에 매우 중요합니다 1. 그것은 암세포뿐만 아니라 기질 섬유 아세포에 의해 형성됩니다. 종양 세포는 정상 조직의 기질과 특이적이고 다른 기질로 둘러싸여^있습니다2. 라미닌-332는 췌장 선암종^3과같은 상이한 종양의 기질에서 ectopically 발현되는 세포외 기질 단백질이다. 더욱이, ECM의 생화학적 조성물은 또한 그 생물학적 특성, 예: 강성 및 장력, 종양 벌크 내의 변화^4. 이 종양 기질, 또는 "반응성 기질"은 인접한 암세포에 섬유아세포의 적응과 종양 진행을 위한 유리하고 지지적인 환경을 개발하는 그밖 아주 중요한 선수의 모집에 기인합니다. 기질 섬유아세포의 분화는 암 관련 섬유아세포 (CAF)를 초래합니다. 이들 세포는 α-평활근 액틴(αSMA)⁵ 또는 신경/신경교항원 2(NG2)6과 같은 상이한 마커를 사용하여 식별될 수 있다.

CAFs를 사용하여 종양 미세환경(TME)을 재량화하는 데 가장 적합한 시험관내 모델은 선택하기 어렵다. 이러한 모델 시스템에 대해 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 TME의 생리적 파라미터를 모방하는 방법을 고려해야 합니다. TME 내에서, 상이한 세포 모형의 증식, 분화, 이동 및 침략과 같은 다른 프로세스가 생깁니다. 이러한 세포 과정은 다른 방법으로 개별적으로 수행 될 수있다. 그러나, 실험 조건은 종양 기질 ECM과의 세포 상호 작용을 고려해야 합니다, 지층의 강성은 CAF 분화 과정에 영향을 미치기 때문에. R.G. Wells는 세포 행동에 대한 매트릭스 강성의 영향에 대해 논평하고 시험관 내 배양 세포에서 관찰된 세포골격조직 및 분화 상태가 artefactual 7일 수 있음을 강조했다. 다른 자극은 기계적 장력^5,7을포함하여 CAF 분화에 관여하는 것 같습니다. 이를 피하기 위해 2D 연질 기판은 경직된 배양 접시 플라스틱의 문제를 우회하기 때문에 분화 연구를 위한 가능한 접근법이 될 수 있습니다. 섬유 아세포가 성장 할 수있는 부드러운 2D 표면은 콜라겐 - I 코팅 폴리 아크릴 아미드 젤일 수 있으며, 이에 따라 젤 강성은 폴리 아크릴 아미드 및 젤 크로스 링커의 농도에 의해 조작 될 수 있습니다. αSMA가 풍부한 스트레스 섬유의 접착력 및 형성은 겔 강성과 함께섬유아세포에서 강화된다 8. 이러한 결과는 더 많은 생리적 체외 분화 모델에 대한 부드러운 기판 스캐폴드의 중요성을 강조한다. 그러나, 우리의 손에 이 젤의 실험적인 재현성 그리고 화상 진찰은 도전적이었습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 차별화 및 침입 연구를 위한 3D 스페로이드 모델을 위한 2D 소프트 기판 시스템을 변경했습니다. 이 모델은 보다 임상적으로 관련성이 있고, 생체외 오르가노이드와 유사하게, 생체 내 세포-세포 상호작용, ECM 생산 및 증착, 세포 행동 뿐만 아니라 재류도^있다9.

스페로이드는 세포가 부착하는 기질이 부족할 때 형성됩니다. 세포가 접착제 표면없이 남아있을 때, 그들은 더 많거나 적은 구형 구조를 형성하기 위해 집계. 스페로이드가 한 가지 유형의 세포로 구성되어 있다면 호모스페로이드라고합니다. 2 개 이상의 다른 세포 유형으로 구성 하는 경우 그들은 헤 테 로스 페로이드를 형성.

스페로이드 제제를 위한 상이한 방법 들 중, 우리는 비부착 원형 바닥 96 웰 플레이트를 사용하여 프로토콜을 수행한다. 그것은 비용에 관하여 매우 효과적입니다. 여기서, 우리는 침략을 연구하기 위하여 섬유아세포, CAF 또는 CAF의 호모스페로이드를 둘 다 생성합니다. 주변 매트릭스로 들어갑니다.

이 연구 결과를 위한 목표는 인간 적인 췌장 암종 생검에서 격리된 1 차적인 CAFs를 이용하기 위한 것이었습니다. 그러나, 세포를 장악하기 위하여 생검은 부족하고 이 이유로, 이 연구 결과에서 사용된 CAFs는 HTERT를 포함하는 lentivirus를 사용하여 불멸되었습니다. 그(것)들은 iCAFs에게 불리고, 그들의 일반적인 대응, 1 차적인 인간 췌장 섬유아세포는, iNFs에게 불립니다. 인간 췌장 섬유아세포 및 췌장 덕트 암종 세포인 AsPC-I 및 PANC-I는 시판되고 있다.

이 프로토콜은 CAF 분화 과정에서 라미닌-332-인테그린 상호작용의 효과를 연구하는데 사용되었다. 이러한 상호작용과 그 기능의 특이성을 증명하기 위해, 억제제 화합물이 사용되었다: BM2, 인테그린 결합 부위를 차단하는 단일클론 항체는 라미닌-332 α3^사슬(10)또는 레빈 1, 뱀 독 유래 화합물을 차단하는 라미닌 결합 인테그린 α3β1, α6β1 및 α7β1^11,12.

침략 분석의 경우, 세포는 이종세포에서 상이한 세포 유형을 구별하기 위해 mCherry(iCAF및 인테그린 α3 KO iCAF) 또는 GFP(AsPC-I 및 PANC-I)를 코딩하는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스로 트랜스사이링되었다. 그(것)들을 불멸화하고 형광 성 단백질 (mCherry 및 GFP) 식으로 그(것)들을 표지하기 위하여 세포의 transduction는 추가 정보를 위해 상담되어야 하는 이전 연구^13에서기술됩니다.

1. 세포 매트릭스 상호 작용의 다른 TGF-β1 억제 화합물을 사용하여 섬유아세포/CAF 분화를 위한 시험관내 모델로서 3D 스페로이드

1. 6 mg/mL 메틸셀룰로오스 용액 1부와 세포 배양 배지 3부분, MEM을 1%의 열불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하여 스페로이드 형성 용액을 얻습니다.
2. 새로 해동된 불멸의 정상 섬유아세포(iNFs), 불멸화된 CAF(iCAFs) 또는 인테그린 α3β1 KO iCAF(최대 25항) 를 스페로이드 형성 용액에 재혼한다. 하나의 96 웰 플레이트를 준비하는 경우, 과량의 스페로이드 형성 용액, 10 mL을 준비하고 75,000 세포를 추가하고 각 스페로이드가 750 개의 세포로 구성되고 플레이트의 각 웰당 100 μL이 분포된다는 것을 명심하십시오.
3. 사이토카인 또는 인테그린 억제제가 연구에 포함되어 있는 경우, 이러한 화합물을 세포 현탁액에 추가하여 형성 중에 스페로이드에 포함시킵니다. iNFs는 분화를 유발하기 위해 TGF-β1의 10 ng/mL로 자극됩니다. 적절한 경우, 20 μg/mL BM2 또는 레빈 1의 10 μg/mL과 같은 TGF-β1과 함께 억제제 화합물을 추가하십시오.
4. 이미 분화되어 있기 때문에 TGF-β1 자극없이 동일한 방법으로 CAF 호모스페로이드를 준비합니다. 어떠한 화합물도 첨가하지 않고 인테그린 α3 KO CAF 호모스페로이드를 준비한다.
5. 각 웰에 용액의 100 μL을 첨가하여 둥근 바닥 96 멀티 웰 플레이트에 스페로이드 형성 용액을 분배한다. 스페로이드 용액이 우물에 분포 될 때마다, 위아래로 파이펫팅하여 잘 혼합, 여러 번.
6. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 배치하여 각각의 우물에서 하나의 스페로이드가 형성될 수 있도록 한다.
7. 약 24 시간 후에 구형체를 수집하고 다른 하류 목적을 위해 그들을 사용합니다 : 면역 형광 염색, 실시간 (RT) q-PCR 및 유세포 분석. 스페로이드 내의 ECM 단백질의 침착을 포함하여 세포 내 및 세포 외 항원의 발현을 검출하려면 면역 형광 염색을 사용하십시오. 단일 세포로 스페로이드가 분해 된 후 유세포 측정에 의해 막 고정 수용체를 정량화하십시오. 유전자 활성화 및 전사 변화를 검출하려면, spheroid 세포로부터 분리된 mRNA의 RT q-PCR를 사용한다.

2. 구형의 면역 형광 염색

1. 약 24시간 후에 실험 조건당 또는 단백질당 1.5 mL 반응 튜브로 분석할 수 있는 스페로이드를 수집한다. 예를 들어, TGF-β1로 자극된 iNFs의 스페로이드를 대조군 iNFs와 다른 튜브에 놓고, 이는 처리되지 않았다. 너무 강한 전단력으로 인해 스페로이드의 파열을 방지하려면 오리피스를 확대하기 위해 파이펫 팁의 끝을 잘라. 한 반응 튜브에 적어도 5-10개의 스페로이드를 포함시키고, 복제를 허용하고 세척 단계 동안 가능한 손실을 고려한다.
2. 1,000 x g에서 약 30-60s에 대한 벤치 상단 원심 분리기와 스페로이드를 원심 분리기. 펠릿 된 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅으로 메틸 셀룰로오스 함유 상월제물질을 조심스럽게 제거하십시오.
3. 1x PBS의 50 μL로 씻으소서. 원심 분리 단계를 반복하고 2.2에 설명된 대로 파이펫팅을 통해 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
4. 염색할 단백질에 따라 PBS에서 4% 파라포름알데히드의 50 μL을 실온(αSMA, NG2 및 인테그린 α3β1의 경우) 또는 -20°C에서 10분 동안 50 μL의 메탄올로 고정합니다(라미닌-332 하위 유닛의 경우).
5. 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
6. 실온에서 4 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 -X로 세포를 투과시.
7. 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
8. 5% FBS 및 2% BSA를 함유하는 PBS에서 스페로이드를 인큐베이션하고, RT에서 1시간 동안 비특이적 단백질 상호작용 부위를 차단한다.
9. PBS에서 1차 항체의 30 μL, 2.5% FBS 및 1% BSA를 밤새 4°C에서 배양한다. 다음과 같은 1차 항체가 사용되었다: 5 μg/mL에서 항αSMA Cy-3 공액 및 항NG2; BM2 항 라미닌 α3, 6F12 항 라미닌 β3 및 항 라미닌 γ2 20 μg/mL.
10. 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
11. PBS에서 30 μL의 이차 항체, 2.5% FBS 및 90 분 동안 RT에서 1 % BSA로 스페로이드를 배양합니다. 사용된 다음이두번째 항체는: 알렉사 488 항토끼 및 항마우스(5 μg/mL)였다.
12. 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
13. 실온에서 4분 동안 30 μL의 DAPI 염색 용액으로 세포를 배양합니다.
14. 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
15. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PS 한 방울에 유리 슬라이드에 스페로이드를 놓습니다.
16. 10배배의 배율을 사용하여 레이저 스캐닝 현미경으로 형광 현미경으로 스페로이드를 이미지화한다. z 스택 (15-20 스택 평면)의 다른 광학 평면에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 가져 가라. 현미경에서 레이저 설정을 확립하려면 관심 있는 항원 또는 이차 항체로만 염색된 스페로이드에 대해 음성세포로 구성된 스페로이드를 사용한다. 비교할 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 다시 사용합니다.
17. 이전에 게시 된 ImageJ 소프트웨어로 현미경 이미지를 분석¹⁴. 단계는 추가 그림1에 요약되어 있습니다. 배경으로서, 관심 있는 무세포 영역(ROI)의 통합 신호 밀도를 결정한다. 총 교정 된 세포 형광 (TCCF)을 다음과 같이 계산하십시오.
    
18. TCCF가 스페로이드 영역과 스택 수로 정규화됨에 따라 스페로이드의 총 보정형형형형(TCF)을 결정합니다.
    

3. 호모 스페로이드의 RT Q-PCR

1. RT-qPCR을 수행하려면 적어도 288개의 스페로이드(3개의 96웰 플레이트에 해당)를 50 mL 반응 튜브에 수집합니다. 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 펠릿 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅하여 메틸 셀룰로오스 함유 상급물질을 제거하십시오.
2. 1 x PBS의 1 mL로 세척하고 1.5 mL 반응 튜브에 스페로이드를 전송합니다. 1,000 x g에서 약 30-60s에 대한 벤치 상단 원심 분리기와 스페로이드를 원심 분리기. 펠릿 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅하여 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
3. 스페로이드를 4 mg/mL 콜라게나아제 B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl_2로 37°C에서 약 30-45분 동안 약 30-45분 동안 부드럽게 소용돌이치고 맥동하여 5분마다 간헐적으로 분리하여 분리합니다.
4. 3.2단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 상업용 RNA 절연 키트를 사용하여 분해된 스페로이드 세포로부터 총 RNA를 분리합니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 절연 된 mRNA를 상용 키트로 cDNA로 반전시됩니다.
7. 실시간 PCR에 의해 복제된 전사 수준을 정량화합니다. 사용 된 프라이머는 이었다: α-SMA: Fw 5′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3′, 레브 5′ ACAGAGTATTTTTGCGCCCGAA-3′^15; 라미닌 α3 체인: Fw 5′-GCTCAGCTGTGTTTGA-3′, 레브 5′-TGTCTGCCTGCGC-3′^16; 라미닌 β3 체인: Fw 5′-GGCAGATGATTAGAGAGGAA-3′ 레브 5′-CGGACCTGCTGGAGGAGGTGT-3′^17; 라미닌 γ2 체인: Fw 5′-GATGGCATTCACTGCAG-3′ 레브 5′-TCGAGCACTAAGAGATGG-3′ ^16; NG2: Fw 5′-CTGCAGGTCTTGTGGCA-3′ 레브 5′-TTGGCTTTTTTTGACCCTGACTATG-3′^18; 인테그린 α3 소단위: Fw 5'-AGGGGACCTTCAGGGCA-3' 레브 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'^19; TOP-1: Fw 5′-CCAGACGAGCTCGGAAC-3′ 레브 5′-GTCCAGGAGGCTCTCTTGAA-3′²⁰.
8. 방정식을 사용하여 TOP-1과 같은 내인성 참조 유전자의 Ct 값에 대한 Ct 값을 수정합니다: 2^{- ΔΔCt.} ΔΔCt = ΔCt (표적 샘플) – ΔCt (기준 샘플) 및 ΔCt = 표적 유전자 또는 기준 유전자의 Ct – TOP-I.

4. 인테그린 발현의 유세포분석

1. 유세포 분석의 경우, 적어도 288개의 스페로이드(3개의 96웰 플레이트에 해당)를 50 mL 반응 튜브로 수집합니다. 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 피펫팅하여 메틸 셀룰로오스 함유 상급물질을 제거하십시오.
2. 1 x PBS의 1 mL로 세척하고 1.5 mL 반응 튜브에 스페로이드를 전송합니다. 원심 분리 단계를 반복하고 파이펫팅을 통해 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
3. 3.3단계에서 기재된 바와 같이 스페로이드를 해리한다.
4. 4.2단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
5. 비특이적 결합 부위를 차단하고 Fcγ 수용체(CD16, CD32 및 CD64)에 대한 검출 관련 항체의 결합을 방지하기 위해 2% 말 혈청(또는 다른 동물 종의 혈청)을 함유하는 PBS의 100 μL에서 세포를 배양하는 항체는 실험에 사용) 및 0.1% BSA를 4°C에서 20분 동안 회전하였다.
6. 세포내 마커를 염색하는 경우, 단계 2.2-2.5에 설명된 대로 세포를 수정/퍼메아빌화합니다.
7. 2% 말 혈청 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS의 100 μL에서 1차 항체로 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 1차 항체를 10 μg/mL로 희석한다.
8. 100 μL의 PBS + 0.1% BSA로 세 번 세척하고, 상단 벤치 원심분리기의 원심분리 단계는 1,000 x g사이입니다.
9. 2% 말 혈청 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS의 100 μL에서 이차 항체로 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 이차 항체를 10 μg/mL로 희석합니다.
10. 4.7단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
11. 유세포계에서 2.0 x 10⁴ 개의 염색 된 세포를 분석하십시오. FSC-SSC 도트 플롯을 통해 단일 라이브 셀에 대한 게이트 및 선택된 형광에 적합한 채널 상에서 게이트된 세포의 형광을 분석한다.

5. 이종스페로이드를 이용한 침략 분석

1. 표1에 요약된 바와 같이 상이한 세포 유형 및 대응 배지를 포함하는 헤테로스페로이드용 스페로이드 형성 용액을 준비한다. 세포는 이전에 mCherry 또는 GFP 발현을 위한 벡터를 포함하는 렌티바이러스로 변환되었다.
2. 플레이트의 각 웰에서 스페로이드 형성 용액의 100 μL을 채우고 각각의 웰에 하나의 스페로이드가 형성될 수 있도록 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
3. 1.5 mL 반응 튜브에 래트 테일 콜라겐 I 2 mg/mL, 상업용 겔화 매트릭스 의 30%, 라미닌-332의 2.5 μg/mL을 함유하는 젤라틴 매트릭스 혼합물 60 μL을 준비합니다. μ-슬라이드 혈관신생 챔버의 3개의 웰에 15 μL을 신속하게 분배한다. 이미 겔을 함유하고 있는 각 웰에 스페로이드 1개를 포함시다.
4. 필요한 경우 현미경으로 피펫을 사용하여 스페로이드의 위치를 우물 의 중심으로 빠르게 조정하십시오.
5. 다음 이종에 대해 5.2-5.3 단계를 반복하고 호모스페로이드에 대해 다시 반복하십시오.
6. 겔을 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 고형화한 다음, 겔을 세포 배양 배지와 부드럽게 오버레이한다.
7. 레이저 스캐닝 현미경으로 형광 현미경으로 구형을 이미지화합니다. z-스택의 상이한 광학 평면과 침략의 다른 시점(예: 0h, 24h, 48h 및 72h)에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 취합니다.
8. 침입 암세포의 수를 계산하여 이미지를 분석합니다. 침입 세포는 스페로이드를 떠나 침략적인 지역을 입력한 그들입니다. 침략적인 지역은 보충 그림 2에 설명된 대로, 침략 실험의 시작 부분에 있는 가장 먼 침략한 세포및 스페로이드의 스페로이드 경계에 의해 주어진 외부와 내부 둘레 사이 고리 지역으로 정의됩니다, 각각 .

이 실험 디자인의 결과는 Martins Cavaco 등13에게시되며, 이러한 실험에서 가져온 결론에 대한 추가 읽기를 권장합니다.

도1은 면역형광 스페로이드의 대표적인 이미지로서, 불멸화된 정상 섬유아세포와 불멸의 CAF(그림 1A)의 인테그린 α3소단위의 면역염색뿐만 아니라 면역형광을 나타낸다. 정량화(도1B)및 qPCR에 의한 인테그린 α3 소단위 유전자의 전사 수준(도1C). 이 결과 패널은 인테그린 α3가 iCAF에서 정상 대응에 비해 업 조절된다는 것을 보여줍니다. 이는 인테그린 α3β1이 췌장 섬유아세포 분화를 위한 마커로 간주될 수 있음을 입증하였다. 이것은 또한 유세포 분석 연구13에의해 입증되었습니다.

그림 1. iNF 및 iCaF에 의한 인테그린 α3 소단위의 발현. 인테그린 α3 소단위는 iCAF에 의해 업그레이팅되어 췌장 CAF에 대한 분화 마커로서의 잠재력을 반영합니다. (a) iCAF의 호모스페로이드와 비교하여 정상 췌장섬유아세포(iNFS)의 호모스페로이드의 면역형광 염색은 분화된 세포에서 인테그린 α3 소단위의 증가된 신호를 나타낸다. (b) 스페로이드 내의 세포의 형광 신호를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 3D 스페로이드의 Z-스택 이미지로 정량화하였다. 3개의 독립적인 실험의 ±SEM을 의미하여 t-검정(*, p< 0.1)에 의해 도시되고 비교된다. (C) 해리된 스페로이드로부터 수득된 세포를 인테그린 α3 소단위의 전사 수준에 대해 분석하였다. 두 개의 독립적인 실험에서 배 변화가 t 검정에 의해 도시되고 비교됨에 따라 ΔΔCt-값의 ± SEM을 의미한다. 0.1의 유의 수준에 도달하지 는 않았지만, 인테그린 α3-인코딩 mRNA의 전사 수준은 iNFs보다 iCAFs에서 더 높다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. 이종 및 호모스페로이드의 세포 조성. 헤테로 및 호모스페로이드를 조립하는 데 필요한 세포의 수뿐만 아니라 스페로이드 형성 용액에 사용해야 하는 상응하는 배지는 다음 표에 요약되어 있다.

추가 그림 1. ImageJ를 사용하여 스페로이드에 관심 있는 단백질의 면역형광 염색을 정량화하기 위한 순차적 단계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 2. 침략 분석에서 침입암세포의 수를 정량화하기 위한 순차적 단계는 ImageJ를 이용하여. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 이 자료는 저자의 견해만을 반영하며 유럽 연합은 그 안에 포함된 정보로 인해 발생할 수 있는 사용에 대해 책임을 지지 않습니다.