방법 논문

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

DOI:

10.3791/60138

⸱

2021년 10월 26일

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

이 논문에서

요약

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여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

초록

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광견병에 대한 1 차적인 진단 양식의 한은 감염된 조직 견본에 있는 바이러스성 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (항원)의 검출입니다. 직접 형광 항체(DFA) 테스트 또는 직접적인 신속한 면역 조직화학 시험(DRIT)이 항원 검출에 가장 일반적으로 활용되지만, 두 검사 모두 항체를 사용하여 항원 검출 전에 슬라이드에 대한 노출을 위해 신선 및/또는 냉동 조직을 필요로 한다. 시료를 포름포민에서 채취및 고정하는 경우, 어느 테스트도 항원 검출에 최적이지만, 파라핀 블록 및 단면에 포함된 후 종래의 면역히토화학(IHC)에 의해 시험을 수행할 수 있다. 이 IHC 방법을 사용하면 조직은 항 광견병 항체로 염색되고, 섹션은 탈파화되고, 부분 적인 proteolysis 또는 그밖 방법에 의해 회수된 항원, 및 1 차 및 이차 항체로 배양됩니다. 항원은 고추냉이 과록시다제/아미노 에틸 카르바졸을 사용하여 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 시각화를 위해 헤마톡슬린으로 대응한다. 특정 항원 검출 외에도 포르말린 고정은 조직학적 변화의 결정, 표본 저장 및 운송을 위한 완화된 조건(주변 온도 미만), 회고적 사례를 테스트하는 능력 및 전염성 제의 불활성화를 통한 생물학적 안전 성 향상과 같은 다른 이점을 제공합니다.

서론

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광견병은 속 리사바이러스1에속하는 부정적인 감각 RNA 바이러스에 의해 유발되는 급성 진행성 뇌염이다. 광견병 바이러스 (RABV)로 인한 모든 인간 사망의 거의 99 %는 개2에의해 전달됩니다. 의심되는 동물의 광견병 진단은 뇌 조직3에서게놈 RNA (리보뉴클레오 단백질 복합체, RNP)와 복합체에서 항원 (주로 바이러스 인코딩 뉴클레오 단백질, N 단백질)의 검출에 의존한다. 직접 형광 항체(DFA) 시험에 의한 항원 검출은 광견병 진단4에대한 금본위제로 간주된다. 이 방법은 신선하거나 신선한 냉동 뇌 물질, 슬라이드에 터치 인상, 아세톤에 고정, 시판되는 형광 이소티오카네이트(FITC)를 사용하여 염색하고 단클론 또는 폴리클론 항체(mAbs/pAbs)로 표시하고 형광 현미경검사법 5에의해 읽습니다. DFA 시험은 신선한 두뇌 조직에서 광견병 항원 검출을 위해 급속하고, 민감하고, 특정합니다. 최근에는 직접 신속한 면역조직화학시험(DRIT), 수정된 면역조직화학(IHC) 기술이 DFA와 유사한 민감성을 나타내고 있음을 입증했지만, 시각화를 위한 광현미경검사의 장점을

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프로토콜

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IHC 프로토콜은 포르말린 고정 조직에서 수행되었지만, 이 조직이 있는 경우 RABV를 비활성화하는 동안 적절한 생체 안전 프로토콜을 적절히 따라야 합니다. 모든 생물안전 절차는 미생물 및 생물의학 연구소(BMBL) 제5판(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)의 생물안전에 설명되어 있으며, 여기에는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함한, 그리고12에기술된 바와 같이 예방 접종 요건이 기재되어 있다. 또한, 유해 화학물질(예: 포르말린, AEC 및 자일렌)의 적절한 봉쇄 및 취급(예: 연기 후드)을 따라야 합니다.

1. 조직의 포르말린 고정

  1. 24-72 h에 대해 13개의 인산염 완충 포르말린 용액(1:20 ~ 1:50 조직/포르말린 비율)으로13년 후에 수집된 3-5mm 뇌 조직을 놓습니다.
    주의: 포르말린은 독성 고정제입니다.
  2. 대략적인 조직 중량 (크기), 조직 모형 (두뇌 영역) 및 포르말린의 양을 기록합니다. 실험실은 고정 시간에 대한 레코드를 문서화하고 유지하는 것이 중요합니다.
  3. 포르말린 고정 후 및 처리 전에 더 긴....

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결과

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도 2는 테스트된 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조샘플의 대표적인 IHC 염색 결과를 보여줍니다. 그림 2A,D, G는 200x에서 양수 샘플을 나타내고, 그림 2B, E, H는 각각 400배율에 해당한다. 도 2A-C는 뇌간에 해당; 도 2D-F는 소뇌 및 푸르킨제 세포에 해당; 도 2G-I는 해마에 해당합니다. 그림 2C, F,.......

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토론

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증상 발병 후 광견병의 높은 사망률로 인해 RABV 감염에 대한 의심스러운 동물의 진단은 적절한 노출 후 예방 치료에 매우 중요합니다. 광견병 진단은 주로 신선하거나 냉동 된 조직을 사용하여 DFA, DRIT 및 PCR 기반 기술에 달려 있습니다. 포르말린 고정 조직의 테스트를 위해 IHC 검사는 RABV 항원의 민감하고 특정 검출을 위한 대체 방법을 제공합니다. 포르말린에 고정된 조직은 교차 연결같이 측사슬의 변형때문에 단백질이 안정되어 있는 동안, 견본은 항원 검출의 앞에 처리될 필요가 있습니다. 본 프로토콜에서, 에피토프는 RNP 복합체에 대한 1차 항체의 결합을 가능하게 하기 위해 프로테아제(예를 들어, Pronase)에 의한 부분적인 프로테오리틱 소화를 통해 회수되었다. N 단백질에 대한 mAbs 반응성이 주로 DFA 및 DRIT에 의존하지만, N 단백질에 대한 여러 전형체에 반응하는 pAbs는 IHC 테스트에 선호될 것입니다. 또한, 반응성 또는 pAbs는 mAbs에 비해 다른 RABV 변이체 및 비 광견병 리사바이러.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 질병 통제 및 예방 센터에 견본 제출을 위한 공중 위생 부서와 가진 실험실, 역학자 및 계열사에게 감사합니다. 이 보고서의 사실 인정 그리고 결론은 저자의 그이며 반드시 질병 통제 및 예방 센터의 공식적인 위치를 대표하지 않습니다. 무역 이름과 상업 소스의 사용은 식별을위한 것이며 질병 통제 및 예방 센터의 보증을 의미하지는 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3% 과산화수소Pharamacy 브랜드기성품 3% H2O2
3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC)Millipore SigmaA6926
아세테이트 버퍼 pH 5.2Poly Scientific R& D 주식회사s140
완충 포르말린 10% 인산염 완충Fisher ScientificSF100-4인증
커버 슬립 CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50mm
에탄올 190 ProofPharmco-AAPER111000190
Ethanol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Gill의 헤마톡실린 제형 #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kitseracare71-00-18마우스 기본 항체 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161마운팅 미디어
N,N, 디메틸 포름아미드 GRFisher ScientificD119
인산염 완충 식염수 HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 목표다중 공급업체
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 목표다중 공급업체
PronaseMillipore Sigma53702Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water 폴리 사이언티픽 R& D 주식회사s1887
Tissue-Tek 슬라이드 스테인 세트Fisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4조직학 등급
Zeiss Axioplan 2 이미징 - 현미경여러 공급업체

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....

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재인쇄 및 허가

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