이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60147

⸱

2020년 2월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

초록

Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.

HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, "돔"이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.

EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.

이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.

서론

일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.

HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다3. 이러한 세포주는 정상 유방 상피의 중요한 특성을 유지했기 때문에 분화 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다: HC11 세포는 클리어된 유방 지방 패드4에서덕트 상피를 부분적으로 재구성할 수 있다. 더욱이, 그들은 H이드로코르티손 또는 덱사메타손과 같은 스테로이드의 존재에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 2차원(2D) 배양물에서 분화할 수 있으며, 이외에도I은술린과 P롤락틴(HIP 배지)이 결여되어 표피 성장 인자(EGF), 분화 억제제5,6,7. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 β-카제인 및 WAP와 같은 우유 단백질을 생성하며, 이는 유도 후 4일 이내에 서양 블로팅에 의해 검출됩니다. 동시에, HC11 세포의 부분은 초보적인 유방 선과 같은 구조를 형성하여 "돔"이라고 불리는 지형적 방식으로. 돔은 유도 후 4-5일 동안 볼 수 있으며 점차 적으로 크기가 10일까지 증가하고, β-카제인 생산량의 증가와 함께8. 흥미롭게도, HC11 세포는 돌연변이 p539를소유하고, 따라서 전뇌성 상태를 나타낸다. 이러한 이유로, HC11 모델은 동일한 세포 시스템에서 신생물과 함께 분화의 신호 네트워크를 연구하는 데 이상적입니다.

EPH4 세포, IM-2 세포의 유도체는, 원래 임신 중 발브/c마우스(10)로부터분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래된 비종양성 세포주이다. EpH4 세포는 2D 배양에서 연속상피 단층을 형성하지만 선형구조(10,11)로분화하지 는 않는다. 그러나, EHS 마우스 육종세포(12)에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 이루어진 물질의 3D 성장에 이어(EHS 매트릭스, 매트릭스, 또는 마트리겔, 물질표참조), HIP를 가진 자극 이외에, EpH4 세포는 유방선 분화의 초기 단계를 재차화할 수 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 심근 기저 극성과 중공 루멘을 나타내는 스페로이드 (유방 골격이라고도 함)를 형성하며, 수유 유방 상피 세포와 유사한 우유 단백질 β-카제인 및 WAP를 생성 할 수 있습니다. 미분화되는 HC11 세포와는 달리, 일부 발현 중간엽마커(13)EpH4 세포는 순수한 발광형태(14)를나타낸다. EpH4 세포는 또한 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴15를통한 자극을 통해 2D 배양에서 우유 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 접근은 3D 문화에서 유방 동맥 미세 환경을 모방하는 규정 효력의 연구 결과 배제합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 도금 HC11 셀

  1. 멸균 기술을 사용하는 층류 후드에서 HC11 세포 배지의 50 mL로 병을 제조합니다: RPMI-1640 과 10% 태아 소 혈청 (FBS), 5 μg/mL 인슐린, 및 10 ng/mL EGF (재료 표참조).
  2. 접시 3 cm 페트리 접시 당 약 400,000 세포 : HC11 매체에 20 3cm 접시에 두 개의 10cm, 50 % confluent 페트리 접시를 전달합니다. 세포는 잘 퍼져 있어야하지만 건조는 피해야합니다.
    1. 진공 펌프를 사용하여 배지를 플라스크에 흡인합니다.
    2. 10cm 플레이트당 트립신 250 μL(재료 표참조)을 추가합니다. 트립신을 확산하고 부착 된 세포를 빼내기 위해 수평으로 유지하면서 접시를 양쪽에서 소용돌이치고 충돌하십시오.
    3. 4x 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법에서 관찰하기 위하여 세포가 파이펫팅의 앞에 가장자리에서 분리하기 시작했는지 확인합니다.
    4. 멸균 된 9 인치 파스퇴르 피펫에서 HC11 배지의 약 1.5 mL을 흡인하고 세포에 수직으로 분출합니다. 모든 세포를 빼내기 위해 분출하면서 페트리 접시를 돌이키십시오. 당신은 세포의 건조를 피하기 위해 빠르게 작동해야합니다.
    5. HC11 배지로 모든 세포를 병에 옮기고 소용돌이치세요.
    6. 각 3cm 페트리 접시에 셀 서스펜션의 피펫 2 mL. 페트리 접시를 교차하여 흔들어 고르게 펴발라보릅니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
  3. 다음날, 또는 세포가 ~90-100% 부유할 때, 배지를 흡인하고, FBS 및 인슐린으로 배지로 대체하지만 EGF가 결여된다.

2. HC11 셀의 분화 유도, 모니터링 및 정량화

  1. 24 시간 동안 EGF가 결여된 배지에서 세포를 성장시키고, 10 3 cm 플레이트에 분화 배지(HIP medium)를 추가합니다: RPMI-1640은 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisone(재료 표참조), 5 μg/mL Insulin 및 5 μg/mL P롤락틴(재료 표참조)으로 보충하였다.
  2. 다른 10개의 3cm 플레이트를 대조군으로 유지하십시오: 10% FBS와 5 μg/mL 인슐린이 결여된 배지로 변경하십시오.
  3. 배지를 2-3일마다 HIP 처리 된 세포와 대조군 둘 다로 변경합니다. 세포가 분리되지 않도록 조심스럽게 배지를 피펫.
  4. 분화를 모니터링하려면 (즉, "돔"의 형성), 위상 대조 현미경 검사법하에 세포를 관찰(그림 1A,왼쪽 패널). 세포가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 경우, 형광 현미경 검사법 (여기 = 485 /20; 방출 = 530/25; 배율 240x; 20x 목표)(그림 1A,오른쪽 패널)에서 관찰하십시오.
  5. 분화 정도를 양량화하기 위해, 한 페트리 접시에서 단백질을 추출하여 각각 HIP 처리 된 세포 및 대조군, 총 10 일 동안 하루에 한 번, β-카제인에 대한 웨스턴 블롯을 프로브 (재료 표참조)(그림 1B).
    1. 1.5 mL 얼음 차가운 인산완식염수 (PBS)로 얼음에 세포를 1.8 ml 플라스틱 원심 분리튜브로 긁어 냅니다.
    2. 350 x g,1 분, 4 °C에서 세포를 펠렛.
    3. 얼음으로 차가운 PBS로 펠릿 2x를 빠르게 씻으십시오. 잔여물을 빼내십시오.
    4. 라시스 버퍼 만들기: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EdTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF), 10 μg/mL 아프로틴, 10 μg/mL leupeptin16. 페트리 접시 3cm당 100 μL을 넣습니다.
    5. 추위에 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리로 용해를 명확히하십시오.
    6. 단백질 농도를 결정하고(재료 표참조) 각 샘플에서 10-20 μg의 단백질을 10% 폴리아크릴아미드-SDS 젤에 로드합니다.
    7. 45V에서 15 시간, 또는 ~ 2-2.5 h에 대한 100V에서 전기 포어.
    8. 전기 블로팅 전달 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인상으로 전달하십시오 (재료 표참조).
    9. 0.1% 트웬-20 (TBST)와 트리스 버퍼링 식염수에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 블록.
    10. 1차 항체를 첨가하고, 염소 항-β-카제인을 희석1:2,000 또는 마우스 항β 액틴을 1:1,000 희석하였다(재료표참조).
    11. TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.
    12. 이차 항체, 고추냉이 과산화증(HRP) 연결된 당나귀 항염소 희석 1:2,500, 또는 HRP 연계 말 항마우스 항체를 1:10,000 희석하였다.
    13. TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.
    14. 제조업체의 지침에 따라 멤브레인에 ECL 시약을 추가합니다(재료 표참조).

3. EHS 매트릭스에서 EpH4 세포의 도금 및 3D 성장

참고 : 매트릭스는 온도 및 lt;10 ° C에서 액체이며 위의 온도에서 고체입니다. -80 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전날 밤 4°C에서 해동합니다. 티슈 배양 플레이트와 파이펫 팁을 취급 하기 전에 -20 °C에서 냉각 하 고 매트릭스, 플레이트 및 파이펫 팁을 얼음에 유지 하 고 응고하지 않도록 합니다.

  1. 10% FBS 및 5 μg/mL 인슐린을 가진 RPMI-1640 배지에서 2D에서 EpH4 세포를 성장시다 (EGF는 필요하지 않습니다).
  2. 2개의 50 mL 원추형 튜브에 10%(v/v, 3,500 μL) 또는 20%(v/v 2,000 μL) 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지를 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
  3. 원액 매트릭스 150 μL24 웰 플레이트의 10 웰 (각 1cm2)을 코팅합니다. 파이펫 팁을 사용하여 매트릭스를 펼지. 거품을 만들지 마십시오. 매트릭스가 우물의 바닥에 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 수평으로 유지하면서 부드럽게 플레이트의 측면을 누릅니다.
  4. 매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 37°C에서 24웰 플레이트를 배양한다.
  5. HC11 세포에 대해 위에서 설명한 바와 같이 EpH4 세포를 트립시니화하고 혈세포계로 계산합니다. 잘 당 5 x 104 세포를 1.5 mL 멸균 원유 원심 분리튜브로 옮기고 250 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
  6. 조심스럽게 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 놓습니다.
  7. 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지의 350 μL에서 세포를 재중단시키면서 원추형 튜브를 얼음 위에 유지하였다. 거품을 피하십시오. 단일 세포 현탁액을 보장하는 것이 중요합니다.
  8. 바닥 층 매트릭스가 고화되면 (매트릭스는 웰의 초기 코팅에 비해 반투명하고 밝은 색상으로 나타나야함), 각 코팅된 각 코팅에 350 μL의 셀 현탁액을 추가하고 CO2 인큐베이터에 37°C에 놓고 ~1시간 동안 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 합니다.
    1. 4x 목표와 위상 대조하에서 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 단일 셀이 표시되어야 합니다.
  9. 20% 매트릭스에서 부유한 350 μL 의 위에 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 200 μL을 첨가한다. 37 °C에서 배양하십시오.

4. 3D로 자란 EpH4 세포의 분화 유도(그림 2)

참고: 분화 외에도, EpH4 세포는 3D 배양에서 HGF (간세포 성장 인자)로 자극 될 때 수관 발생을 겪을 수 있습니다. 관내 외성장은 HIP 및 HGF 자극의 10일 후에 볼 수 있다.

  1. 매트릭스에서 도금 후 1일 EpH4 세포의 분화 유도를 시작한다. 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 우물에서 10 % 매트릭스를 포함하는 상단 매체의 150 μL을 조심스럽게 제거하십시오. HIP 및 10% 매트릭스를 함유한 EpH4 배지 200 μL을 첨가합니다.
  2. 최대 10일 동안 2일마다 10% 매트릭스-HIP 배지를 교체합니다. HIP 없이 동일한 10% 매트릭스 배지에서 대조군 세포를 성장시다.
  3. 위상 대비 하에서 유방구 형성을 모니터링합니다(그림3A,하부 패널).

5. 3D로 자란 EpH4 세포의 튜불로제네시스 유도(그림 3A 및 3C)

  1. 3.1-3.9단계에서 상세히 설명된 바와 같이 매트릭스에서 성장을 위해 24개의 웰 플레이트 및 EpH4 세포를 준비한다. 매트릭스에서 세포를 도금한 다음 날, 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 웰에서 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 150 μL을 제거한다. 10% 매트릭스, HIP 및 20 ng/mL HGF를 포함하는 EpH4 배지 200 μL을 추가합니다(재료 표참조).
  2. 최대 12-14일 동안 2일마다 10% 매트릭스/HIP/HGF 배지를 교체하십시오.
  3. 20x 또는 40x 대물렌즈(그림3A,우측 패널)를 사용하여 관 형성을 현미경으로 모니터링합니다.

6. 분화의 정량 : β 카제인을위한 웨스턴 블로팅

  1. 조심스럽게 우물에서 10 % 매트릭스 - HIP 매체 떨어져 파이펫. 20% 매트릭스 층을 350 μL의 얼음 차가운 PBS로 2x 헹구어 내보소서. 스페로이드는 여전히 매트릭스 층에 있어야합니다.
  2. 700-1,000 μL의 얼음 차가운 PBS를 1 mM에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 우물에 직접 넣습니다. 파이펫 팁으로 우물에서 100% 매트릭스의 바닥 층을 부드럽게 분리하여 해당 층에 존재하는 스페로이드를 회수합니다. 4°C에서 30분간 부드럽게 흔들어 주세요.
  3. 조심스럽게 원유관에 스페로이드 현탁액을 옮김을 옮김을 옮김. PBS-EDTA의 ~ 500 μL로 우물을 헹구어 우물에 남아있는 스페로이드를 회수하고 원유 관에 추가하십시오.
  4. 추가로 30 분 동안 얼음에 바위. 매트릭스가 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 보이는 매트릭스 덩어리가 보이면 PBS-EDTA를 더 추가하거나 더 오래 흔들어 주세요.
  5. 5 분 동안 350 x g에서 스페로이드를 펠렛하는 용액을 원심 분리기.
  6. 상월체를 흡인하고, 얼음-차가운 용해 완충액에서 스페로이드를 용해시키고, β-카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP에 대한 프로브는16단계의 2.5단계에서와 같이 서양 블로팅에 의해. 1차 항체로서, 염소 항-β-카제인을 1:2,000, 토끼 항사이클린 D1희석 1:2,000, 마우스 항-p120 희석 1:2,000을 사용한다. 이차 항체의 경우, HRP 연동 당나귀 항염소 희석 1:2,500, HRP 링크 당나귀 안티 토끼 희석 1:2,500, HRP 링크 말 항 마우스 희석 1:10,000을 사용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

상피 세포와 지방세포의 분화가 카데린2의합류와 결합을 필요로 한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 당사와 다른 사람들은 세포 간 부착 및 E-또는 N-카데린 및 카데린-11의 결합을 입증했습니다. 배양 된 세포의 합류와 함께 발생, 작은 GTPases Rac 및 세포 분열 제어 단백질 (Cdc42)의 활성의 극적인 증가를 트리거,이 과정은 인터류킨 -6 (IL6) 가족 사이토 카인 및 Stat3의 활성화로 이어진다 (전사-3의 신호 트랜스듀서 및 활성제16,17)18, 18. 18. 18. cadherin/Rac/IL6/Stat3 통로의 많은 분대가 분화 및 신생물 변환에 모두 참여할 수 있기 때문에, 그들은 이 두 정...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.

세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입니다. 따라서, 세포층을 통해 균일한 분화를 달성하기 위해서는, 파종시에 페트리 접시 내의 세포의 균일한 분포를 달성하는 것이 중요하다. 이는 분화의 정량이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 트립시니화는 단일 세포 현탁액이 달성되고 세포가 조작으로 인해 생존력을 잃지 않도록 최적화되어야 합니다.

트립시니화되는 세포는 높은 밀도로 성장한 세포가 서로 강하게 부착되는 경향이 있기 때문에 하위 (50-70%)이어...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.

캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스 재단 교육 프로그램에서 CBCF 박사 펠로우십과 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 하나드 아단은 NSERC 여름 학생의 수혜자였다. BS는 퀸즈 대학 대학원 상에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
30% 아크릴아미드/0.8% 비스 솔루션Bio Rad1610154웨스턴 블로팅
안티 사이클린 D1 항체토끼, 산타크루즈sc-717웨스턴 블로팅
안티-p120 항체마우스, 산타크루즈sc-373751웨스턴 블로팅
안티-&베타; 액틴 항체마우스, 세포 신호 전달 기술3700웨스턴 블로팅
안티-&베타; 카제인 항체염소, 산타 크루즈 생명 공학sc-17971웨스턴 블로팅
아프로티닌바이오 샵APR600용해 버퍼
Bicinchonic Acid SolutionSigmaB9643-1L-KC단백질 측정
소 혈청 알부민Bio ShopALB007.500단백질 측정
투명도 Western ECL 기질Bio Rad170-5061웨스턴 블로팅
구리(II) 황산염시그마C2284-25ML단백질 측정
DAPIThermofisher ScientificD1306염색
디지토닌Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500염색
EDTABio ShopEDT001.500
표피 성장 인자시그마HC11 세포용 E9644 배지
태아 송아지 혈청PAAA15-751세포 배양 배지
염소-안티 토끼-HRP산타크루즈SC-2004웨스턴 블로팅
간세포 성장 인자 재조합GibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9세포 배양
말 안티 마우스 HRP세포 신호 전달 기술7076웨스턴 블로팅
하이드로코르티손시그마H0888HIP 매체
인슐린시그마I6634HIP
매체 층류 후드BioGard 후드세포 배양
류펩틴Bio ShopLEU001.10용해 완충액
매트릭스 (Engelbreth-Holm-Swarm 매트릭스, Matrigel)CorningCACB 354230
마우스 안티 염소 HRPSanta Cruzsc-8360웨스턴 블로팅
Mowiol 4-88 시약Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GM염색
다광자 컨포칼 현미경Leica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850용해 버퍼
Na4P207시그마125F-0262용해 버퍼
NaClBio ShopSOD001.1웨스턴 블로팅
NaFFisher Scientific7681-49-4리시스 버퍼
니콘 디지털 카메라Coolpix 995
니트로셀룰로오스바이오 라드1620112웨스턴 블로팅
NP-40시그마9016-45-9
파라포름알데히드 피셔 Scientific30525-89-4염색
위상차 현미경Olympus IX70세포 배양
Phenylmethylsuphonyl fluorideSigma329-98-6lysis buffer
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
ProlactinSigmaL6520HIP Medium
RPMI-1640SigmaR8758Cell 배양 매체
조직 배양 접시 35Sarstedt83.3900.세포 배양
조직 배양 플레이트-24 웰Sarstedt83.1836.300세포 배양
전달 장치CBS Scientific CoEBU-302웨스턴 블로팅
트리스 아세테이트바이오 샵TRA222.500웨스턴 블로팅
트립신시그마9002-07-7.세포 배양
Tween-20Bio ShopTWN510.500웨스턴 블로팅
Veritical Gel 전기영동 시스템CBS Scientific CoMGV-202-33웨스턴 블로팅

참고문헌

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598(2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127(2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

마우스 유선 상피 세포HC11 세포 분화EpH4 세포 분화HIP 배지 처리3D 매트릭스 배양웨스턴 블롯 분석위상차 현미경 검사공초점 현미경 검사Rac 신호 조절맘모스피어 형성
마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.