여기에 제시된 것은 설치류 눈에 생물학적 제제의 장기 전달을 위한 불멸화된 세포의 미세 캡슐화에서 중합체로서 알긴산을 사용하기 위한 프로토콜이다.
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이 논문에서
요약
초록
눈의 후방 극의 질병에 대한 개발 중인 많은 현재 치료법은 생물학적 제제입니다. 이 약은 빈번하게 관리될 필요가 있습니다, 일반적으로 intravitreal 주사를 통해. 선택의 생물학적을 발현하는 캡슐화된 세포는 국소 단백질 생산 및 방출을 위한 도구가 되고 있다(예를 들어, 장기 약물 전달을 통해). 또한 캡슐화 시스템은 세포 안팎으로 영양분, 폐기물 및 치료 요인을 확산시키는 투과성 물질을 활용합니다. 이것은 숙주 면역 반응에서 세포를 마스킹하는 동안 발생, 숙주 면역 계통의 억제에 대한 필요성을 피하고. 이 프로토콜은 마이크로 캡슐화 기술로 전기 분무 방법과 결합된 마이크로 캡슐화에서 중합체로서 알긴산의 사용을 설명합니다. ARPE-19 세포, 자발적으로 발생 하는 인간 RPE 세포 주, 그것의 수명 기능 으로 인해 장기 세포 치료 실험에 사용 되었습니다., 그리고 캡슐 화 및 마우스 눈에 캡슐전달에 대 한 여기 사용 됩니다. 원고는 세포 미세 캡슐화, 품질 관리 및 안구 전달에 대한 단계를 요약합니다.
서론
세포 기반 치료법은 의학에서 널리 적용된 혁신적인 생물학적 기술을 나타냅니다. 최근에는 퇴행성 신경질환, 안구질환, 암 치료에 성공적으로 적용되고 있다. 세포 치료는 세포 보충에서 약 납품에 의하여 광범위한 필드를 커버하고, 이 프로토콜은 후자에 집중합니다. 생분해성 알긴산 마이크로캡슐(MC)은 전달 시스템으로서 효과를 보였으며, 생물의학 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 알긴산은 간단한 겔화 공정, 생분해성, 우수한 생체 적합성 및 생체내조건 하에서 의 안정성1,2,,3,,4로인해 마이크로 캡슐화에 사용되어 왔다.
전기 분무 방법은, 마이크로 캡슐화 기술로, 알긴산 (염기 중합체) 및 폴리-l-오르니틴 (이차 코팅 폴리머)를 사용하여 펩티드와 단백질을 캡슐화하는 데 성공적으로 활용되었습니다. 두 폴리머 는 자연적으로 발견되고 생체 적합성5,,6,,7에사용됩니다. 그러나, 세포 기반 치료법의 주요 과제는 면역억제약물에 의한 부작용을 피하기 위해 숙주 면역계의 억제이다. 알긴산 마이크로캡슐의 투과성은 숙주 면역반응으로부터그들을 마스킹하는 동안 세포 내로 영양분, 폐기물 및 치료 인자를 확산시키는 세포 캡슐화에 적합한 특성으로 간주된다8,9,,10.
눈에서, 캡슐화된 세포는 망막색소변성증 또는 노화관련 황반변성의 치료를 위해 생물학적 제제(즉, 성장인자11,,12 및 성장 인자 길항제13)의지속적인 전달을 위한 임상 시험에서 사용되어 왔다. 보체 억제제 와 같은 그밖표적은 또한 전임상 조정에서 현재 탐구되고 있습니다.
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프로토콜
모든 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 프로토콜 ID 00399에 따라 사우스 캐롤라이나 동물 관리 및 사용 위원회의 의과 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 세포 배양
- 인간 망막 색소 상피 세포(ARPE-19) 세포주를 생성하여 발표된 프로토콜14,,15에따라 선택한 유전자를 안정적으로 발현한다.
- Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에서 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충하십시오.
- 세포를 37°C 및 5%CO2에서배양한다.
- 2-3일마다 매번 매체를 교체하십시오.
- 표준 조직 배양 절차를 사용하여 70%-80% 합류에 도달한 후에 세포를 통로.
2. 세포 캡슐화
- 나트륨 알긴산나트륨을 탈이온화(DI) 물과 혼합하여 최종 농도를 2%v로 만들고 0.2 μm 멸균 주사기 필터로 여과하여 정화합니다.
- 10 mM HEPES 완충 식염수 (pH = 7.4)로 트립시니화, 원심 분리 및 세척하여 알긴산 용액과 혼합 될 세포를 준비시다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산하고 알긴산 용액에서 최종 세포 농도를 1 x 106으로 조정합니다.
참고: 캡슐화 과정은 멸균 된 후드 내부에서 실행되어야합니다. - ~ 300 μL 알긴산과 세포 혼합물을 3 mL 주사기에 넣고 주사기 펌프에 부착합니다. 용액은 30 G 무딘 팁 바늘을 통해 멸균 겔링 욕조에 7 mm의 주사기 팁 아래의 멸균 50 mL 비커에 배치되어 바늘을 목욕 분무 거리까지 펌핑한다.
- 겔화 목욕은 100 mM 염화 칼슘 (CaCl2)과0.5 % w / v 폴리 L-오르니틴 (PLO)을 포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수의 40 mL의 부피를 포함합니다. PLO는 조사자의 필요에 따라 생략하거나 변경할 수 있는 보조 폴리머 코팅이다.
- 전압 및 유량을 조정하고 캡슐화 공정 중에 60mm/h 유량 및 6.0 kV 초기 전압을 일정하게 유지하여 ~ 150 μm의 마이크로 캡슐 크기를 생성합니다.
- 바늘에 고전압 발생기 바늘 팁의 양극 와이어 (빨간색)의 클립을 연결하고 겔링 욕조에 잠기는 구리 와이어에 접지 클립 (검은 색)을 연결합니다. 알긴산 + 세포 혼합물(1 mL)의 1회 배치는 캡슐화된 세포(약 25,000마이크로캡슐)를 준비하는 데 약 30분이 소요된다.
- 세척 액 (1.5 mM CaCl 2, pH = 7.4를 포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수)로 세포를 포함하는 형성된 마이크로캡슐을두 번 세척한다. 세탁시 PBS를 사용하지 마십시오.
- 캡슐화된 세포를 10% FBS로 배양하여 37°C 및 5%CO2에서가습된 인큐베이터에서 DMEM 매질 보충제를 보충하였다.
참고: 캡슐화 공정 계측기는 그림 1에도시되어 있습니다.
3. 캡슐화가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는다는 확인
- 캡슐화된 세포를 24시간 동안 배양한 후, 염색을 위해 500 μL(~30 마이크로캡슐)의 작은 샘플을 준비한다.
- 세척 용액 (1.5 mM CaCl2를포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수)을 사용하여 마이크로 캡슐을 2 x 씻어 내고 살아있는 / 죽은 분석 키트를 사용하여 살아있는 죽은 생존을 위해 얼룩을 지으십시오.
- 칼세인 AM(아세톡시메틸)과 에티듐 호모디머-1의 염색 혼합물을 각각 2 μM 및 4 μM의 최종 농도에서 준비한다.
- 캡슐화된 세포에 염색 혼합물 2 mL를 넣고 실온(RT)에서 어둠 속에서 30-45분 동안 배양한다.
- 신중한 포부로 염색 용액을 흡인하고 세척 용액으로 마이크로 캡슐을 2 x 씻어 내세요. 형광 현미경 시스템을 사용하여 캡슐화된 세포를 관찰하고 이미지화합니다.
참고: 캡슐화 문서는 그림 2에나와 있습니다.
4. 캡슐이 생물학적 제제의 전달 및 전달에 적합한 크기임을 확인
- 마우스 눈에 있는 Intravitreal 주사는 전형적으로 2.5 μL 해밀턴 주사기에 붙어 있는 27 G 무딘 끝 바늘 (210 μm의 내경)로 수행됩니다.
- 100 ~200 μm에 이르는 캡슐을 생성하고, 혈청이 없는 매체로 희석한 다음, 조심스럽게 해밀턴 주사기로 끌어올리십시오. 알긴산 캡슐이 PBS에서 용해될 것이기 때문에 PBS는 적합한 차량이 아닙니다.
- 캡슐을 함유한 1 μL 방울을 현미경 슬라이드에 천천히 꺼내고 직립 된 밝은 필드 현미경을 사용하여 무결성을 결정하십시오.
- 그에 따라 전압 및 유량을 조정하여 캡슐 크기(단계 2.3 참조)를 조정합니다. 더 작은 마이크로 캡슐은 전압을 증가시키고 유량8을약간 감소시킴으로써 비선형 방식으로 생산됩니다. 우리의 손에, 직경 150 μm의 캡슐이 가장 적합한 것으로 판명되었습니다. 캡슐 크기의 조정은 또한 다른 파라미터를 변경하는 동안 알긴산 농도를 일정하게 유지하는 것에 달려 있습니다.
- 원하는 생물학적 제제의 분비량을 결정하기 위해 혈청 이없는 배지에서 적절한 크기의 캡슐에 별도의 세포 세트를 유지한다. 민감한 ELISA 또는 서쪽 블로팅을 사용하여 상급제에서 생물학적 제제의 농도를 결정하십시오.
- 치료의 알려진 PK/PD(약동학/약력학)에 따라 주입해야 하는 캡슐의 필요한 양을 결정합니다. 우리의 손에, 10 마우스 눈 당 캡슐은 가장 효과적인 것으로 판명.
5. 마우스 유리체로 캡슐 전달
- 해부 현미경을 사용하여 인트라비트 주사를 수행합니다. 수술 시 사용되는 수술 설정 및 재료는 그림 3을 참조하십시오. intravitreous 주사에 대한 자세한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다16.
- 자일라진과 케타민 (20 mg/kg 및 80 mg/kg) 또는 특정 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인 한 다른 선호 하는 마 필적의 복 강 주사에 의해 마우스를 마 세. 발가락 핀치17을사용하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 페닐에프린 HCL로 마우스 동공을 넓히다 (2.5%) 및 아트로핀 황산염 (1%) 유리체 챔버의 좋은 가시성을 허용하고 시술 중에 수분을 유지하기 위해 눈에 윤활유 아이 젤을 적용합니다.
- 가이드 구멍으로 26G 바늘로 팔다리에 공막구멍을 뚫고 1) 바늘이 눈과 테이블이 있는 45° 각도에 있고 2) 경정맥이 렌즈에 구멍을 뚫지 않도록 위쪽으로 향하게 됩니다.
- 육안으로 검사를 통해 45° 각도로 해밀턴 주사기에 부착된 27G 무딘 팁 바늘을 사용하여 캡슐을 조심스럽게 주입하여 바늘로 렌즈를 만지지 않도록 하십시오. 렌즈의 부상은 백내장 형성으로 이어질 것입니다. 캡슐은 해부 현미경을 사용하여 유리체에서 볼 수 있어야합니다(도 4A).
- 바늘의 철회 후, 덱사메타손 안과 항생제 연고 이외에 항생제 연고 네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염으로 주사 부위를 치료하십시오.
- 고니오테르 하이프로멜로스 데멀센트 안과 용액 적용 (2.5%) 회복 기간 동안 각막이 건조하지 않도록 두 눈으로.
- 37°C에서 유지된 가열 패드에 마우스를 놓고 완전히 깨어날 때까지 모니터합니다.
- 캡슐화된 ARPE-19 세포의 성공적인 주입은 광학 적인 일관성 단층 촬영 또는 다른 방법에 의해 눈을 이미징 할 때 약간의 파편으로 마우스의 유리체 챔버에서 손상되지 않은 캡슐의 존재를 밝혀야합니다(그림 4B).
- 주입 된 마우스 눈, 수술로 인해 회복의 몇 일 후, 지금 손에 실험 패러다임에 대한 준비가되어 있습니다.
참고: 눈에 있는 캡슐의 외과 적 설치 및 문서화는 각각 그림 3및 그림 4에묘사됩니다.
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결과
ARPE-19 세포는 캡슐을 눈에 이식할 때 캡슐화 및 장기 생존을 가능하게 하는 것으로 나타난 자발적인 불멸의 인간 RPE 세포주입니다. 알긴산 캡슐화 도구는 그림 1에나와 있습니다. 본 연구에서, 알긴산캡슐에 캡슐화시, 알긴산 캡슐의 세포가 밝은 필드 이미징에 의해 확인되었다는 것이 입증되었다(도2A). 살아있는 죽은 세포는 캡슐 내부의 세포에서 수행되었고, 캡슐화 후 90%의 생존가능성을 입증하였다(도2B). 캡슐 내부의 세포의 장기적인 생존을 보장하기 위해, 캡슐을 구연산나트륨에 용해시키고 세포를 다시 도금하였다(그림2C). 독립적인 실험에서 안정된 형질감염 ARPE-19 세포가 원하는 생물학적 제제를 발현및 분비한 것을 확인한후,세포를 안전하게 캡슐화하기 위한 파라미...
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토론
이 세포 캡슐화 기술은 상대적으로 빠르고 수행하기 쉽습니다. 그러나 정확한 다운스트림 결과를 얻으려면 특정 지점을 염두에 두어야 합니다. 세포는 캡슐화 하기 전에 페트리 접시에 배양에서 유지 되어야 하 고 적절 한 합류에서 개최. 캡슐화는 가능하면 조절 된 공기 흐름이있는 적절한 환기 후드에서 수행해야합니다. 공기 전류가 너무 강하면 캡슐 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 특히 장기 실험에서 영향을 미칠 수 있습니다. 멸균 기구 및 용액은 캡슐 내의 세포를 장기적으로 유지 보수하는 데 매우 중요합니다.
현재, 살아있는 죽은 염색 캡슐 내에서 세포의 생존을 결정 하기 위해 확인 도구로 사용 됩니다. 캡슐 당 및 현재 조건 하에 세포의 수 (즉, 일반적으로 캡슐 당 12-20 세포) 또한 시각적으로 결정 됩니다. 캡슐화된 셀 일괄 처리의 각 배치의 실행 가능성은 이 방법으로 모니터링됩니다. 세포의 생존 가능성을 추가로 결정하기 위해 캡슐화된 세포는 용해되고 다시 배양됩니다. 이것은 또...
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (R01EY019320), 재향 군인 업무부 (RX000444 및 BX003050), 사우스 캐롤라이나 스마트 스테이트 인다우먼트에 의해 B. R. 수여 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3 mL 주사기 | BD | 309656 | |
| 30 G 1" 무딘 바늘 | SAI 주입 기술 | B30-100 | |
| 알긴산 나트륨 염, 갈조류 | Sigma | A0682 | |
| 아트로핀 황산염 점안액 (1%)Akorn | NDC 17478-215-15 | 동공 확장용 | |
| BD 1 mL 주사기 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and 회사 | DG518105 500029609 REF 309625 | 마 |
| 염화칼슘, 무수, 과립 | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | 마취 중 눈 윤활 |
| Hamilton 바늘 / 주사기 팁 : 27 G, 소형 허브 RN NDL, custum 길이 (12 mm), 포인트 스타일 3, 6 / PK | 캡슐 | 의 유리체 내 전달을위한 | 7803-01 |
| Hamilton 주사기 : 2.5 µ L, 모델 62 RN SYR, NDL 별도 판매 | 의 유리체내 전달을 위한 | Hamilton | 7632-01 |
| HEPES 완충액, 1M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| 고전압 발생기 | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트 | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-오르니틴 염산염, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| 네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염 및 덱사메타손 안과 연고 | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | 유리체강내 주사 후 감염 방지용 항생제 |
| 페놀레프린 염산염 점안액(2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | 동공 확장용 |
| 염화나트륨 | 시그마 | S-5886 | |
| 멸균 주사기 필터, 0.2 μ m | VWR | 28143-312 | |
| 주사기 펌프 | GRASEBY | MS16A |
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