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방법 논문

약물 약동 및 독성 평가를 위한 장/간 미생물학 시스템

7.6K 조회수

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DOI:

10.3791/60184

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2020년 12월 3일

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1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

이 논문에서

요약

우리는 아세트아미노펜 (APAP)에 장과 간 오르가노이드를 가진 미생물 계통 (MPS)를 드러나. 이 문서에서는 MPS의 오르가노이드 생산 및 APAP 약동 및 독성 특성 평가를 위한 방법을 설명합니다. 또한 결과를 검증하는 데 필요한 조직 기능 분석을 설명합니다.

초록

최근에 도입된 미생물시스템(MPS)은 인간 유기체를 육성하는 것이 유전적으로 인간적이고 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 약물 개발 과정의 전임상 시험 단계에서 동물보다 더 나은 성능을 발휘할 것으로 예상된다. 본 연구에서, 인간 장 장벽(Caco-2 및 HT-29 세포의 공동 배양에 의해 에뮬레이트됨) 및 간 등가(분화된 HepaRG 세포 및 인간 간 석래 세포로 만든 스페로이드에 의해 에뮬레이트됨)는 일부 아세트아핀(Pcoinophen)을 평가하기 위해 2기관 칩(2-OC) 미세 유체 장치로 통합되었다. MPS는 세 개의 어셈블리를 했다: 장 만 2-OC, 간 만 2-OC, 그리고 내장/간 2-OC 두 오르가노이드를 perfusing 동일한 미디어와. PK 평가를 위해, 우리는 12 μM및 2 μM에서 장 장벽 (경구 경로를 에뮬레이션) 또는 매체 (정맥 경로를 에뮬레이션)를 통해 그것을 관리 한 후 사전 설정 된 시점에서 미디어에 APAP를 투여했습니다. 미디어 샘플은 반전 단계 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석되었다. 오르가노이드는 유전자 발현, TEER 값, 단백질 발현 및 활성을 위해 분석한 다음 형태학적 평가 집합에 수집, 고정 및 제출하였다. MTT 기술은 오르가노이드 생존가능성을 평가하는 데 잘 수행되었지만, 높은 함량 분석(HCA)은 APAP 처리에 응하여 매우 초기 독성 이벤트를 감지할 수 있었습니다. 우리는 미디어 흐름이 APAP 흡수에 크게 영향을 미치지 않는 반면 간 동등한 기능을 크게 향상시키는지 확인했습니다. APAP 인간 장 흡수 및 간 물질 대사 MPS에 에뮬레이트 될 수 있습니다. MPS 데이터와 실리코 모델링 의 연관성은 체외 방법의 예측 가능성을 개선하고 약동 및 독성 연구에서 동물 모델보다 더 나은 정확도를 제공 할 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

유전체학 및 프로테오믹 차이로 인해 동물 모델은 여러 인간의 결과에 대한 예측 가치가 제한적입니다. 또한, 그들은 시간이 많이 소요, 비싸고 윤리적으로 의심1. MPS는 예측 능력을 개선하고 임상 전 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 그들은 오르가노이드 오르가노이드 통신을 촉진하는 미디어 흐름하에서 오르가노이드 (장기의 인공 마메틱 기능 단위)를 육성하는 미세 유체 장치입니다. 인간 세포로 만든 오르가노이드는 번역 관련성2,3,4를증가시다. MPS는 유전적으로 인간이며 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 동물 실험보다 더 잘 수행 될 것으로 예상됩니다. 완벽하게 작동하면 MPS는 더 높은 속도로 더 의미 있는 결과를 제공하고 비용과 위험을4로낮출 것입니다. 많은 그룹은 여러 목적을 위해 MPS를 개발하고 있다, 특히 질병의 모델은 약물의 효능을 테스트.

노출 수준은 약물 효능 및 독성5,6,7,8,9,10,11,12를평가하기 위한 가장 중요한 매개변수 중 하나입니다. MPS는 전신 노출을 에뮬레이트하는 오르간성 통합을 허용하고 전통적인 2D 인간 조직 배양보다 더 잘 수행 될 것으로 예상된다. 이 기술은 화합물 장 흡수 및 간 대사4의예측을 크게 향상시킬 수 있습니다.

장과 간의 인간 동등한 모델을 통합하는 MPS는 약물 생체 이용률 및 전신 노출13,14,15에서이 두 기관의 중심 역할을 고려하여 좋은 출발점이다. APAP는 신장과 동등한 신장이 없는 MPS를 연구하기 위한 매력적인 약물로, 대사화는 주로 간16,17에의해 수행된다.

상기 2-OC는마이크로채널(16)에의해 상호 연결된 두 개의 상이한 인간 동등한 조직/오르가노이드의 배양에 적합한 2챔버 미세유체 장치이다. 약물의 체외 인간 구두/정맥 투여를 모방하고 APAP 약동학에 대한 장과 간 등가물의 교차 이야기의 효과를 평가하기 위해, 오르가노이드 기능성 및 생존가능성 외에도, 3개의 다른 MPS 어셈블리가 수행되었다: (1) Caco-2 + HT-29 세포 공동 배양을 포함하는 배양 삽입에 기초한 장 등가물로 구성된 "내장 2-OC MPS", 2-OC 장치에 통합; (2) 2-OC 장치에 통합된 HepaRG + HHSteC(인간 간 Stellate 세포)로 구성된 간 스페로이드로 구성된 "간 2-OC MPS"; 및 (3) "내장/간 2-OC MPS"는 마이크로 유체 채널을 통해 매체흐름에 의해 다른 장치 구획과 동등한 간구획으로 구성된다.

모든 아세이는 기계적 자극(압축, 스트레칭 및 전단)의 충격으로 인해 정적(유동 없음) 및 동적(흐름 없음) 조건하에서 수행되었다(압축, 스트레칭 및 전단) 세포 생존능력 및기능성(18,19,20). 본 기사는 인간 장 및 간 등가 모델을 포함하는 2-OC MPS에서 APAP 경구/정맥 투여 에뮬레이션 및 각각의 흡수/물질 대사 및 독성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

1. 2-OC에서 재배에 대한 조직 등가물의 생산

  1. 소장 장벽 동등한 생산
    1. 장 등가 매체를 사용하여 Caco-2 및 HT-29 세포를 유지하십시오: DMEM은 10% FBS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균증으로 보충되고, 1% 비필수 아미노산, 이는 이 원고에서 "DMEM S"로 명명된다.
    2. 매체를 제거하고, 1x DPBS로 두 번 세척하고 세포 배양 플라스크에서 자란 카코-2 세포를 해리하기 위해 0.25% 트립신/EDTA의 8mL을 추가한다(175cm2). 37°C에서 5분 동안 배양하고 트립신 억제제의 이중 부피를 적어도 첨가하여 반응을 중지한다. HT-29 세포에 대해 동일한 절차를 수행하여 이러한 세포의 양이 적어 더 작은 플라스크(75cm2)로유지되므로 시약 볼륨을 조정합니다.
    3. 원심분리기는 250 x g에서 5분 동안 두 튜브에서 상퍼를 제거하고, DMEM S. 카운트 세포의 10mL에서 세포 펠릿을 재보일시하여 80% 이상의 세포 생존가능성을 보장한다. 무균은 이전에 혈관 측 (인간 혈류를 나타내는)에서 잘 당 DMEM S의 400 μL로 채워진 24 웰 플레이트에 세포 배양 삽입을 통합합니다.
    4. 9:121의비율로 Caco-2 및 HT-29 세포를 공동 경배한다. DMEM S의 최종 부피 200 μL의 최종 부피에서 각 장에 상응하는 2.25 x 10 5 Caco-2 및2.5 x 104 HT-29 세포를 사용하십시오. 조심스럽게 섞입니다.
    5. 각 삽입의 apical 측(인간 장 루멘 측을 나타내는)에 세포 용액의 Pipette 200 μL을 삽입당 250,000개의 세포를 시드합니다. 3주 동안 인서츠에서 세포를 공동경작한다. 일주일에 세 번 이상 배지를 변경하여 멸균 파스퇴르 파이펫으로 무형 및 바식사이드 모두에서 스컬쳐하여 그대로 세포 장벽을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
      참고: 세포 장벽을 만지지 않도록 apical 측의 포부를 진행합니다(셀 인서트의 플라스틱 테두리에 파스퇴르 파이펫을 지원하여 흡인).
    6. 제조업체의 지시에 따라 볼트계23을사용하여 3일마다 TEER(전피 전기 저항)를 측정하여 단단한 단층 형성을 확인하십시오.
      1. 빈 을 수행, 세포 배양에 걸쳐 저항을 측정 세포 없이 삽입, 하지만 동일한 세포 배지와 동일한 세포 판에.
      2. 조직-동등한 저항으로부터 빈 저항을 빼서 조직 저항을 계산하고, 필터 멤브레인(0.6cm2)의유효 표면적으로 증식한다. 좋은 장 장벽 저항은 150에서 400 Ω
        참고: 21일 후에 는 세포를 완전히 분화하고 장 장벽이 형성되어야 하므로 장 등가물은 MPS에 통합될 준비가 되어 있습니다.
  2. 간 등가물 생산
    1. 간 동등한 매체를 사용하여 HepaRG 세포를 유지, 이는 윌리엄의 중간 E로 보충 10% 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 단위 /mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄상 구균, 5 μg/mL 인간 인슐린 과 5 x 10-5 M 하이드로코톤, 이 이름 HepaRG 배지를 2-3일마다 갱신하고 간세포 및 담고옥시테에서 분화를 시작하기 위해 2주 동안 세포 배양을 유지한다.
    2. 처음 2 주 후, 세포 분화24,25를완료하기 위해 추가 2 주 동안 HepaRG의 매체에 2 %DMSO를추가합니다. Stellate 세포 미디어(SteC CM)에서 HHSTeC를 성장시키고, 폴리 L-리신 코팅 세포 배양 플라스크를 사용하여 2~3일마다 미디어를 변화시다.
    3. 매체를 제거하고, 1x DPBS로 두 번 세척하고 0.05% 트립신/EDTA의 8mL을 추가하여 세포 배양 플라스크(175cm2)에서자란 HepaRG 세포를 해리시화한다. 37°C에서 5 내지 10분 동안 배양하고 트립신 억제제의 부피를 적어도 두 배 이상 첨가하여 반응을 중지한다. HHSTeC에 대해 동일한 수행, 이러한 세포의 작은 양이 필요하고 그들은 작은 플라스크 (75cm2)에서유지 될 수 있기 때문에 시약 볼륨을 적응.
    4. 원심분리기는 5분 동안 250 x g에서, 상류체를 제거하고 윌리엄스 E S 배지의 세포 펠릿을 재연한다. 셀을 계산하여 80% 이상의 세포 생존가능성을 보장합니다.
    5. HepaRG와 HHSTeC 세포를 각각 24:1의 비율로 결합한 간 스페로이드를 생성하여 윌리엄스 E S배지(16)에서생성한다. 4.8 x104 분화 된 HepaRG 및 0.2 x 104 HHSTeC를 추가하여 50,000 세포의 각 간 스페로이드를 80 μL의 부피로 구성합니다. 조심스럽게 섞입니다.
    6. 멀티채널 파이펫을 사용하여 384개의 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰에 결합된 셀 풀의 80 μL을 분배하며, 이는 둥근 바닥 형상을 가지고 있습니다.
      참고: 4일 후 약 300μm의 스페로이드가 형성됩니다.
    7. 넓은 보어 팁을 사용하여 간 스페로이드를 초저 부착 6 웰 플레이트로 옮기면 필요한 "일대일" 계산이 가능합니다.

2. 2-OC MPS에서 장과 간 등가물의 통합

  1. 흡수 분석용 장 2-OC MPS 어셈블리
    1. DMEM S의 파이펫 500 μL은 더 작은 구획에 2-OC 및 300 μL의 더 큰 구획으로 들어갑니다. 24 개의 우물 판에 해당하는 각 장 장벽의 바소포탈 및 정량 적 매체를 흡인하십시오. 멸균 집게를 사용하여 2-OC 회로당 하나의 인서트를 통합하여 특히 더 큰 구획에 통합합니다. 내장 배지의 200 μL을 정측에 적용합니다.
      참고: 오간노이드를 MPS에 통합할 때 거품이 형성되는 것을 피하십시오.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
  2. 간 2-OC MPS 조립 물질 대사 분석
    1. 윌리엄스 E S의 파이펫 650 μL은 큰 구획으로 들어가고 350 μL을 더 작은 구획으로 들어가 스페로이드를 받게 됩니다. 초저 부착 6 웰 플레이트에서 와이드 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 계산합니다. 각 간 등가물은 20개의스페로이드(26)로구성된다. 오르가노이드만 전달할 수 있는 와이드 보어 팁을 사용하여 회로당 20개의 간 등가물을 통합하여 2-OC의 작은 구획으로 옮습니다.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
  3. 흡수 및 신진 대사 분석에 대한 장 / 간 2-OC MPS 조립
    1. 두 개의 미디어(장과 간)를 1:4 비율로 결합하여 장 내 DMEM S200 μL과 바소측에 있는 윌리엄스 E S의 800 μL을 의미합니다. 2-OC에서 장과 간 등가물을 동시에 통합합니다.
    2. MPS를 가압 공기 공급에 연결해야 하는 제어 장치에 연결합니다. 매개 변수 설정: 약, ±300 바및 0.3Hz의 펌핑 주파수의 압력. 시험 물질 투여 전에 24시간 흐름을 시작합니다. 다음 날, APAP 치료를 수행합니다.
      참고: 모든 실험의 경우 세 개의 분리된 2-OC 회로(예: 1 및 1/2 2-OC 장치)를 의미하는 triplicate에서 각 시간 점을 수행합니다. 각 2-OC 회로의 총 부피는 1mL입니다.

3. 아세트아미노펜 (APAP) 준비

  1. 절대 에탄올에서 APAP를 용해, APAP 주식 솔루션을 준비합니다. 실험 당일, 각 배지(APAP 용액)에서 APAP를 희석하여 "경구 투여"와 "정맥 투여"에 대한 2 μM의 농도로 희석한다.
  2. 차량 제어 및 치료 용액에서 에탄올의 최종 농도가 두 행정부모두에 0.5%인지 확인합니다. 양수 조절(100mM APAP)의 경우 에탄올 농도는 2%이다.

4. 약물 관리 및 미디어 샘플링 테스트

  1. APAP "구두" 관리 및 미디어 샘플링
    1. 적절한 배양 배지의 2-OC. Pipette 500 μL에서 각 장 장벽의 바소포 및 정계 배지를 유기성 바식측의 큰 구획으로 배양하고 300 μL을 작은 구획에 흡인한다.
    2. 거품을 확인하고 경구 투여를 모방하여 시험 물질과 함께 장 장벽 동등한 치료를 진행한다. APAP "구두" 투여는 장 내 "루멘 측"(도1B)을나타내는 장 배양 인서트의 정황 측에 12 μM APAP 용액의 200 μL을 첨가하여 투여한다. MPS를 제어 장치에 연결합니다.
    3. 다음 시점에서 apical 및 바소쪽 측면에서 총 볼륨을 수집 : 0 h, 5 분, 15 분, 30 분, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h15,27. 정적 및 동적 조건에서 triplicate에서 모든 실험을 수행하고 별도의 마이크로 튜브에서 각 삼중 기류의 각 샘플을 수집합니다. HPLC/UV를 사용하여 샘플을 분석합니다.
      참고: 별도의 정문 및 바소포탈 샘플을 분리합니다.
  2. APAP "정맥" 관리 및 미디어 샘플링
    1. 2 μM APAP 용액을 간 구획에 직접 투여하여 "정맥 내" 경로를 에뮬레이트합니다. 모든 2-OC 중간 콘텐츠를 흡인. 테스트 물질을 대형 구획에 함유하고 있으며 동일한 매체의 350 μL을 포함하는 윌리엄스 E S의 Pipette 650 μL이 20개의 스페로이드를 포함하는 작은 구획에 들어갑니다. 0h, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간,24h 27,28: 다음 시점에서 모든볼륨을수집합니다.
    2. 정적 및 동적 조건에서 트리플리케이트로 모든 실험을 수행합니다. 각 삼중항의 각 샘플을 별도의 마이크로튜브로 수집합니다. HPLC/UV를 사용하여 샘플을 분석합니다.

5. 계측 및 크로마토그래피 조건

  1. HPLC 분석
    1. 표 1에따라 HPLC 분석에 대한 모든 관련 매개 변수를 설정합니다.
    2. 진공 상태에서 0.45 μm 멤브레인 필터를 통해 이동 단계를 필터링합니다. 0.22 μm 모공 크기 PVDF 주사기 필터(직경 13mm)를 통해 샘플을 필터링하고 유리병에 보관합니다. 측정을 시작합니다.
  2. 스톡 솔루션, 교정 표준 및 품질 관리(QC) 샘플
    1. 암모늄 아세테이트 버퍼(100mM, pH 6.8)로 APAP 스톡 솔루션 10m를 준비하고, 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)로 희석된 DMEM S 및 윌리엄스 E S 세포 배양 배지로 더욱 희석하여 0.25에서 100.00 μM까지 다양한 작업 솔루션을 달성한다.
    2. 삼중 교정에 교정 샘플 세트와 트리플리케이트의 4개 수준에서 품질 관리 샘플을 포함합니다. 직렬 희석으로 이러한 표준을 준비합니다.
    3. APAP 명목 표준 농도에 비해 APAP 피크 영역의 교정 곡선을 만듭니다. 각 교정 곡선에 대한 선형 회귀 적합을 결정합니다. 육안 검사, 상관 계수, 인터-런 정확도 및 정밀도 값으로 다양한 교정 모델의 적합성을 평가합니다.
    4. DMEM S와 윌리엄스 E S 미디어의 빈 샘플을 심모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석하여 sextuplicate에 주입합니다. 0.50(LOQ), 4.50, 45.00 및 90.00 μM의 APAP 농도에 대해 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)로 희석된 DMEM S 및 Williams E S 미디어에서 품질 관리 샘플의 트리클리카를 준비합니다.
    5. 품질 관리 샘플이 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 것과 다른 새로운 스톡 솔루션에서 제조되었는지 확인합니다. 품질 관리 샘플을 사용하여 실행 내 및 실행 간 변형을 조사합니다.
  3. 유효성 검사 절차
    1. 이전에 보고된절차(29,30)에따라 생체 분석 방법 검증을 수행한다. 각각 윌리엄스 E S와 DMEM S 세포 배양 매체를 고려하여 5~6개의 별도 경우에 크로마토그래피 실행을 수행한다.
    2. APAP의 0.25내지 100.00 μM에 이르는 교정지점, DMEM S 또는 윌리엄스 E S 세포 배양 배지에서 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석된 교정 지점이 각각의 명목 농도(축)에 대한 APAP(축 y)의 피크 영역에 따라 플롯되도록 한다. 이러한 표준 교정 곡선의 경사면을 암모늄 아세테이트 버퍼에서 제조한 교정 곡선의 경사면을 비교합니다. 모든 교정 곡선의 상관 관계 값이 0.998 이상인지 확인합니다.
    3. 5일 또는 6일 동안 4개의 서로 다른 레벨 LLOQ, 낮음, 중간 및 고품질 제어에서 복제를 사용하여 대리 매트릭스의 별분(내부 및 인터-런)에 대한 정밀도와 정확도(내부 및 인터런)를 결정합니다. 0.50, 4.50, 45.00 및 90.00 μM APAP 농도(n= 3)를 포함하는 암모늄 아세테이트 버퍼(1:1, v/v)에서 희석된 DMEM S 또는 Williams E S 세포 배양 배지에서 같은 날 에 대한 정밀도 및 정확도 측정을 수행합니다.
    4. 최근에 획득한 교정 곡선에서 APAP 농도를 포함하는 각 품질 관리 샘플 집합을 평가합니다. 간섭 성분에 의한 관심 화합물및 가능한 다른 크로마토그래피 피크의 분리 정도에 의해 분석의 선택성을 테스트한다.
  4. 정량화(LLOQ) 하한 및 검출 제한(LOD)
    1. 응답 및 경사 접근 방식의 표준 편차를 기준으로 정량화(LLOQ)의 하한을 결정합니다. α y-intercept및 S의 표준 편차는 교정곡선(29,30)을 플로팅하여 얻어진 직선의 경사인 수식(10α/S)을 사용하여 계산한다. 교정곡선(29,30)의경사로 나눈 빈칸의 표준 편차의 3.3배를 고려하여 검출한계(LOD)를추정한다.

6. 조직 등가물 생존/기능

  1. Mtt
    1. MTT 분석기를 수행하여 MPS 분석의 모든 시간 지점에서 오르가노이드 생존가능성을 평가합니다. 음의 제어로 셀 미디어와 차량을 사용합니다. 양성 조절으로서, 세포 배지에서 희석된 100mMM APAP 및 1% NaOH로 오르가노이드를 치료한다.
    2. 96웰 플레이트에서 개별 우물에 대해 각각 복제된 각 의 20개의 스페로이드를 전송하고, 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 삽입물을 24개의 웰 셀 플레이트로 이송하여, 1장의 소장을 웰당 동등한 1개를 배치한다. 1x DPBS로 티슈 등가물을 세 번 세척합니다.
    3. 1 mg/mL MTT 용액의 300 μL을 각 셀 배지에 희석하여 양면으로 추가합니다. 표준 세포 배양 조건에서 플레이트를 3시간 동안 배양한다.
    4. 배관하여 MTT 용액을 각 에서 신중하게 제거합니다. 4°C에서 하룻밤 사이에 200 μL의 이소프로판올을 사용하여 장 및 간 등가물에서 MTT 포르마잔을 추출한다.
      참고: 증발을 방지하기 위해 뚜껑을 밀봉합니다.
    5. 각 수퍼중의 200 μL을 96개의 잘 마이크로 테스트 플레이트에서 미리 확인된 각각의 음부로 이송한다. 이소프로판올을 빈 칸으로 사용하십시오.
    6. 570 nm에서 플레이트 리더의 포르마잔 흡광도를 읽으십시오. MTT를 줄이기 위해 세포의 상대적 능력을 계산합니다(%) 100% 셀 생존가능성으로 간주되는 음극과 비교하여 각 시간점의 평균 광학 밀도를 사용한다.
  2. 세포화학/히스토로지
    1. 장 및 간 등가물을 실온에서 25분 동안 수정하여 0.1M 인산염 식염수 버퍼, pH 7.4에서 4%(w/v) 파라포름알데히드를 사용합니다. 매번 10분 동안 PBS 버퍼에서 오가노이드를 5회 세척합니다. 장과 간 등가물을 테트라메틸로다민 이소티오카네이트-팔로이신 또는 알렉사 플루오르 647 폰로이드인, PBS31에서1:50을 염색한다.
    2. 완전한 동결 될 때까지 액체 질소로 전송하기 전에 RT에서 적응하기 위해 몇 분 동안 OCT 동결 매체로 전송합니다. 저온을 사용하여 약 10-12 μm 두께의 간 스페로이드 저온 섹션을 수행합니다.
    3. DAPI를 장착하는 배지에 조직 섹션을 마운트합니다. 공초점 형광 현미경 검사법에 의해 그들을 검사하십시오.
    4. 확립된 프로토콜에 따라 헤마톡시린 및 에오신 염색을 수행하기 위해 고정 후 오르가노이드를 동결한다. 전술한 바와 같이 조직을 잘라낸 후 장착 매체로 슬라이드를 마운트하고 광학 현미경을 사용하여 조직학적 이미지를 취합니다.
  3. 높은 함량 분석
    1. 세포의 미토콘드리아 및 핵 염색
      1. DMSO의 lyophilized 분말을 재구성하여 1 mM 미토콘드리아 염색 스톡 솔루션(예: 미토트래커 딥 레드 FM)을 만듭니다. 빛으로부터 보호 -20 °C에 알리 인용 재고 솔루션을 저장합니다. 1mM 미토콘드리아 염색 스톡 용액을 예동(37°C) 조직 배양 배지에서 최종 농도(200nM)로 희석한다.
      2. 세포 배양 매체를 제거합니다. 미토콘드리아 염색 용액을 추가하여 5%CO2로가습된 대기에서 37°C에서 15-45분 동안 샘플을 완전히 커버하고 세포를 배양한다.
      3. 미토콘드리아 염색 작업 용액을 조심스럽게 제거하고 실온에서 15 분 동안 PBS에서 2-4 % 파라 포름 알데히드 고정으로 대체하십시오.
      4. 고정 된 셀을 PBS로 부드럽게 헹구십시오 5 분 동안. 세탁 과정을 두 번 반복합니다.
      5. 초순수 10mL에서 10mg/mL(16.23M) 핵산 염색 스톡 용액을 100 mg의 Hoechst 33342 염료100 mg을 용해하여 준비한다.
        참고: 주식 용액은 -20°C에서 빛으로부터 보호된 알리인용 및 저장되어야 합니다.
      6. PBS에서 0.2-2.0 μg/mL 핵산 염색 작업 용액을 준비하고 실온에서 10분 동안 핵산 염색 작업 용액으로 고정된 세포를 배양한다.
      7. 핵산 염색 작업 용액을 제거하고 PBS로 세포를 부드럽게 헹구십시오. 세포는 빛으로부터 보호되는 4°C에서 PBS로 보관해야 합니다.
    2. 미토콘드리아 및 핵 염색 분석
      1. 핵산 얼룩에 적합한 필터 세트로 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석합니다(λEx/λEm: 361/497 nm) 및 미토콘드리아 얼룩(λEx/λEm: 644/665 nm). 핵산 양성 염색에 의해 세포를 찾아 세포 수를 정량화한다. 미토콘드리아의 미토콘드리아 얼룩 형광 강도를 정량화합니다.
  4. ImageJ의 형태 측정(스페로이드 계산)
    1. 높은 콘텐츠 분석(HCA) 이미지를 콜럼버스 소프트웨어의 *.flex 파일로 내보냅니다. Bio-Formats 플러그인32를사용하여 ImageJ에서 회색 스케일로 .flex 파일을 가져오기 : 파일 > 가져오기 > 바이오 포맷.
    2. 가져오기 옵션 창에서 하이퍼스택 보기를 선택하고 분할 아래의 분할 채널을 별도의 창으로 사용하도록 설정합니다. 이 옵션을 사용하면 특정 채널(예: DAPI, 미토트래커 등)의 모든 파일에 액세스할 수 있습니다. 메모리 관리 에서 가상 스택 사용을 선택하지 마십시오.
      참고: 배양 배지가 UV 파장(예: 405 nm)에서 감소함에 따라 이미지에서 DAPI 채널을 "먼지"로 사용하는 것이 바람직하다.
    3. .flex 파일의 임베디드 값에 따라 로드되지 않은 경우 픽셀 크기조정(분석 및 설정 배율)을조정합니다. 가우시안 블러 필터를 적용하여 과도한 소음을 제거하고 모양 윤곽의 요철을 피하십시오. 공정 > 필터 > 가우시안 블러. 2.0에서 3.0 사이의 시그마(반지름)의 높은 값은 대부분의 경우에 이상적입니다. 스택에 여러 이미지가 있는 경우 모든 이미지에 적용합니다(프로세스 스택 창에서 예 선택).
    4. 임계값을 사용하여 배경 및 오르가노이드(개체)를 분리하는 이진 이미지를 생성합니다. 이미지 및 gt를 클릭하고 조정 > 임계값을 클릭합니다. 빨간색 마스크를 사용하여 이미지의 강도에 따라 값을 조정하고, 오르가노이드 모양에 맞게 형태가 그대로 유지됩니다. 이미지에 흰색 배경이 있는 경우 어두운 배경을 사용하지 않도록 설정합니다. 적용을클릭합니다.
    5. 이진 창으로 스택 변환에서 임계값 메서드를 선택합니다. 일반적으로 이러한 종류의 이미지 처리에서 기본값 또는 삼각형이 선호됩니다. 배경을 어둡게유지합니다. 스택에 여러 이미지가 있는 경우 각 이미지에 대한 임계값 계산을 선택합니다.
    6. 프로세스 및 gt; 바이너리 > 채우기 구멍을 선택합니다. 선택적으로 백그라운드에서 구멍을 제거합니다. 프로세스 > 바이너리 > 옵션s에서 블랙 배경을 선택하고 채우기 구멍을 다시 실행합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 검은색 배경 옵션을 사용하지 않도록 설정합니다.
    7. 객체를 분리합니다. 오르가노이드의 경우 분수령 방법은 좋은 선택입니다. 프로세스 및 gt; 바이너리 > 유역클릭. 셰이프 분석을 실행합니다.
      1. 분석 및 측정 설정을 선택합니다. 몇 가지 옵션을 사용할 수 있습니다(https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html 세부 정보). 오가노이드의 경우 영역, 평균 회색 값, 최소 및 최대 회색 값 및 셰이프 설명자 선택합니다. 선택적으로 표시 레이블을 선택하여 이미지 및 과학적 표기서의개체를 식별합니다. 확인을 클릭합니다.
      2. 분석 및 gt를 선택하고 입자를 분석합니다. 크기 및 순환 제한을 선택합니다. 이미지의 모든 오브젝트를 측정하려면 각각 0-infinity 및 0.00-1.00을 유지합니다. 쇼에서객체를 식별할 수 있도록 윤곽선을 선택합니다. 결과를 출력할 수 있도록 표시 결과를 사용하도록 설정합니다. 테두리에 닿는 객체를 제외하려면 모서리에 제외합니다. 구멍을 포함하므로 오브젝트의 최종 내부 구멍이 주 모양의 일부로 간주됩니다.
    8. 모든 이미지 스택에 대해 모양 분석을 반복하면 결과가 단일 테이블에 추가됩니다. 결과 테이블을 파일 > 저장으로 쉼표(.csv) 파일로 내보냅니다.
  5. 실시간 PCR
    1. 페놀과 구아니오티오카네이트의 단면식 용액을 사용하여 조직 등가물에서 RNA를 추출하여 제조업체의 지시에 따라 추출합니다.
    2. 총 RNA의 1 - 2 μg의 역전사에 의해 cDNA 합성을 수행한다.
    3. 유전자 특이적 프라이머(표5)를사용하여 모든 표적을 증폭하여 실시간 정량적 PCR을 수행합니다. 각 qRT-PCR에는 역전사 RNA 30ng및 각 프라이머의 100nM이 포함되어 있습니다.
    4. PCR 조건을 따르십시오 : 3 분 동안 50 °C (1 주기); 5 분 동안 95 °C (1 주기); 95°C30초, 59°C45초, 72°C는 45초(35~40사이클)에 대해 서한다.
  6. CYP 분석
    1. 간 2-OC 어셈블리에 대한 섹션 2.2를 따르십시오. 실험군은 12시간, 24시간, 차량 제어를 위한 노셀 제어, APAP 2 μM 치료제이다. APAP 2 μM 준비 및 치료를 위해 섹션 3.3 및 4.2를 따르십시오.
      참고: 모든 샘플이 CYP 분석에 대해 동시에 준비되도록 하려면 24시간 치료를 시작한 후 12시간 동안 치료를 시작합니다. CYP 활성의 세포 없음 제어를 0.5% 에탄올 용액과 차량 제어로 처리합니다.
    2. 실온에서 3m mM 발광 기판 스톡 솔루션을 해동하고 윌리엄의 E S. 빛으로부터 1:1000 희석을 합니다.
    3. 스페로이드를 수집하고 각 실험 군을 96웰 플레이트의 우물로 옮기다. 매체를 제거하고 1x DPBS의 100 μL로 두 번 세척하고 우물당 3 μM 기판 용액의 80 μL을 추가하십시오. 윌리엄의 E S 배지에서 세포 없음 제어를 유지합니다. 배경 제어를 위해 스페로이드 나 기판 솔루션없이 우물을 저장합니다. 37°C에서 30-60분 동안 5% CO2로배양하여 빛으로부터 보호합니다.
    4. 에스트라아제와 재구성 버퍼를 사용하여 류필립루시페린 검출 시약(LDR)을 평형화한다. 소용돌이 또는 반전하여 섞습니다. 다음 단계까지 적절한 볼륨을 실온에 저장합니다.
      참고: 재구성된 LDR은 실온에서 24시간 또는 활동 손실 없이 1주 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -20°C에 보관하십시오.
    5. 잠복 후 흰색 불투명 96 웰 마이크로 플레이트의 세 가지 다른 우물에서 그대로 스페로이드의 상체 25 μL을 전송합니다. 우물당 LDR 25 μL을 추가하고 균질화합니다.
    6. 20 분 동안 실온에서 흰색 접시를 배양. 발광계에서 발광을 읽어보십시오. 불소계를 사용하지 마십시오.
    7. 테스트 복합 처리 및 처리되지 않은(차량 제어) 값에서 백그라운드 발광 값(셀 제어 없음)을 빼서 순 신호를 계산합니다. CYP3A4 활동의 백분율 변화를 순 처리값을 처리되지 않은 값으로 나누고 100으로 곱하여 계산합니다.
  7. 웨스턴 블로팅
    1. 확인된 1.5 mL 마이크로튜브로 간 스페로이드를 전달한다. 중간을 제거하고 1x DPBS의 100 μL로 두 번 세척하십시오.
    2. 간 스페로이드를 100 μL의 세포 용해 RIPA 버퍼를 4°C에서 20분 동안 용해합니다. 원심분리기는 15분, 4°C 및 11000 rpm에 대한 것입니다. 상체를 다른 식별된 1.5 mL 마이크로튜브로 전송합니다.
    3. 브래드포드 방법을 통해 얻은 단백질의 양을 정량화한다. 그라데이션 폴리아크릴아미드 겔3-15%의 정량화된 세포 용액으로부터 10~50μg의 단백질을 적재하고 SDS-PAGE를 수행한다.
    4. 전자에서 0.22 μm PVDF 멤브레인으로 하중 된 단백질을 반건조 시스템 장비를 통해 전달합니다. 50m Tris-HCl 및 192m 글리신의 전송 용액을 사용하십시오. 전송할 젤 수(한 번에 1~2개)에 따라 장비 파라미터를 설정합니다.
    5. TBS-T 버퍼에서 3-5% 탈지 우유 용액으로 PVDF 멤브레인에 대한 비특이적 상호 작용을 차단합니다: 트웬 20의 0.1%로 보충된 Tris-Buffered Saline(50m Tris pH 7.6, 150mM MM 나트륨 염화나트륨). 실온에서 1 시간 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 멤브레인을 유지합니다.
    6. 실온에서 3-5 분 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 TBS-T로 씻으십시오. 이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.
    7. TBS-T에서 알부민 및 비골민 1차 항체를 각각 1:1000 및 1:2000으로 희석한다. 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체로 멤브레인을 배양하여 부드럽게 일정한 흔들림을 가합니다.
      참고: 항상 제조업체의 지침을 따라 항체를 희석시합니다.
    8. 1 차적인 항체및 세척막을 3회(단계 6.7.6)를 제거한다. TBS-T에서 ECL 항마우스 IgG 이차 항체를 1:5000으로 희석시. 실온에서 2 시간 동안 부드럽게 일정한 흔들림 아래 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.
    9. 이차 항체를 제거하고 멤브레인을 세척하십시오(6.7.6 단계). ECL 웨스턴 블로팅 기판을 사용하여 단백질 검출을 수행합니다. 30~30분 동안 자동방사선 필름을 노출합니다. 삼중피에서 면역 블로팅 검출을 수행합니다.

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결과

2-OC MPS에서 PK APAP 테스트를 수행하기 위해, 첫 번째 단계는 인간 장 및 간 등가물(organoids)을 제조하는 것이다. PK APAP 분석기 시작 전에 2-OC 미세유체장치(도 1A)24h에 통합된다. 다음 날, 매체가 변경되고 모델이 APAP에 노출됩니다. 도 1은 2-OC장치(도 1B)및 APAP PK 실험 시간과정(도 1C)에내장 및 간 등가물을 도시한다. 우리는 MTT 분석, TEER 측정, HCA, 실시간 PCR, 서부 블로팅, 조직학 및 공초점 형광 현미경을 2D 배양 및 3D 오르간노이드에서 수행하여 조직의 생존가능성을 확인하고 가능한 APAP 독성 효과를 감지했습니다. 공초점 형광 현미경 이미지에서, DAPI 및 Phalloidin으로 염색된 장 등가 시료(핵 및 액틴각각)는 비처리(도...

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토론

조사 신약의 약리학적 특성에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 평가는 다음 개발 단계의 위험을 줄이는 데 중요합니다. MPS는 예측 능력을 개선하고 전임상 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 우리 그룹은 납 최적화에 주로 필요한 약동및 독성 특성의 평가에 발전하고 있습니다. 우리는 두 개의 챔버가있는 2-OC 미세 유체 장치와 협력하여 두 개의 오르가노이드를 통합 할 수 있었습니다. APAP는 고품질의 인간 데이터를 많이 가지고 있기 때문에 선택되었으며, 대부분 간에서 대사되며 간 독성 특성을 표시합니다. 연구 프로토콜은 약물이 자원 봉사자에게 구두로 투여되는 인간 상 I 임상 시험의 몇 가지 단계를 모방하는 것을 목표로하고, 주기적인 혈액 샘플은 약동적 특성및 생화학 및 임상 매개 변수를 알기 위해 약물의 농도를 평가하기 위해 그려져 안전성과 내성을 평가하기 위해 수집됩니다. 따라서 MPS가 신뢰할 수 있는 예측을 제공할 만큼 충분히 진화하면 I 단계 예심에서 실패의 위험을 크게 줄...

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공개 사항

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감사의 글

우리는 크리스티 구겐 -기요루조 박사, 단위 522 INSERM에서 박사 필립 그리폰과 생물 물질의 사용을위한 단위 271 INSERM에서 박사 크리스티안 트레포에 감사하고 학술 연구를 수행하기 위해 우리를 위해 다음 사용할 수 있도록.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235칼슘 없음, 마그네슘 없음
2-OCTissUse GmbH2-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde세포 고정에 사용
AcetaminophenSigma AldrichA7085MPS 분석에 사용
아세토니트릴테디아HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientific컨포칼 실험
암모늄 아세테이트Sigma AldrichHPLC
Caco-2 세포Sigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
세포 배양 플라스크Sarstedt
컨포칼 형광 현미경LeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM 고포도당Thermo Fisher Scientific12800017보충제 추가: 10% 소 태아 혈청, mL 페니실린당 100 단위, 100 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산
DMSOSigma AldrichD4540HepaRG 배지에 2% 추가
에탄올합성 태
아 소 혈청Thermo Fisher Scientific12657029
동결 매체 OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.&무역; 화합물은 수용성 글리콜 및 수지의 제형으로, -10°C의 온도에서 저온 유지 장치 절단을 위한 편리한 표본 매트릭스를 제공합니다. C 이하.
헤마톡실린 & Eosin
HepaRG 세포Biopredic InternationalHPR101미분화 세포
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300세포 및 모든 배양 보충제
Hoechst 33342HCA 실험
HT-29 세포Sigma Aldrich85061109
인간 인슐린Invitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
하이드로코르티손시그마 AldrichH0888
이소프로판올머크278475
Karnovsky' s 고정제
L-글루타민Thermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 가드 컬럼 SSPhenomenexHPLC
현미경LeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µ m 기공 크기 인서트MerckPIHP01250
Millicell ERS-2 미터MerckMERS00002TEER 측정에 사용
MitoTracker Deep RedHCA 실험
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P 시스템Agilent Technologies
Neubauer 챔버셀 계수
Operetta High Content Imaging SystemPerkin Elmer
Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell Culture
PermountThermo Fisher Scientific조직학
프라이머RT-qPCR
PVDF 멤브레인BioRad
PVDF 주사기 필터0.22 μ m 기공 크기
역상 Luna C18 컬럼PhenomenexHPLC
Shaker 수행에 사용 (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000MTT 분석을 개선하기 위한 스페로이드에 사용됨
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301STeC CM 보충제
추가 SuperScriptIITM 역전사 효소Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR 마스터 믹스Thermo Fisher Scientific
TRizol TM 시약Thermo Fisher ScientificTrizol은 페놀과 guanidine isothiocyanate의 monophasic 해결책입니다.
트립신/EDTA 솔루션Thermo Fisher ScientificR001100
초저 부착 플레이트CorningCLS3471-24EA6웰
Vectashield plus DAPI 장착 매체
White Opaque 96웰 마이크로플레이트PerkinHelmer
광각 팁
Williams EPan BiotechP04-29510보충제 추가: 10% 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민, ml 페니실린당 100개, 100 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신 및 5 &마이크로; g/mL 인간 인슐린
수행에 사용

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