인간 난모세포를 위한 Piezo-ICSI

요약

여기에서는 피에조 구동 마이크로피펫을 사용하여 인간 난모세포에 세포질 내 정자를 주입하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

세포질 내 정자 주입(ICSI)에 의한 최초의 성공적인 임신이 보고된 이후, ICSI는 보조 생식 기술(ART)의 필수 기술이 되었습니다. ICSI는 스파이크 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 투명대와 멤브레인을 관통합니다. 그런 다음, 세포질은 일반적으로 막 파손을 위해 마이크로피펫으로 흡인됩니다(conventional-ICSI). 기존 ICSI 후 마우스 난모세포의 생존율과 수정율은 각각 16%와 8%로 낮았다. Kimura와 Yanagimachi는 피에조 구동 장치, 수은 및 마우스 ICSI를 위해 팁이 평평한 마이크로피펫을 적용했습니다. 멤브레인 파괴는 세포질 흡인 없이 이러한 유형의 장비를 마이크로피펫(piezo-ICSI)에 결합하여 반자동으로 수행할 수 있습니다. 이 연구자들은 기존 ICSI의 생존율과 수정율(80% 및 78%)이 기존 ICSI의 생존율과 수정율(16% 및 8%)에 비해 유의하게 높았다고 보고했다. 따라서 피에조-ICSI는 마우스 난모세포뿐만 아니라 인간 난모세포 ICSI에도 효과적일 수 있습니다. 그러나 인간 난모세포에 대한 기존 ICSI와 비교하여 피에조-ICSI의 효과를 평가한 논문은 5편에 불과합니다. 이 5개의 논문 모두 기존 ICSI에 비해 훨씬 더 높은 수정률을 보고했습니다. 여기에 설명된 피에조-ICSI 프로토콜의 목표는 기존 ICSI와 비교하여 ICSI의 임상 결과를 개선하는 것입니다.

서론

팔레르모 박사가 세포질 내 정자 주입(ICSI)¹을 통해 최초로 성공적인 임신을 했다고 보고한 이후, ICSI는 보조 생식 기술(ART)의 필수 기술이 되었습니다. ICSI는 스파이크 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 투명대와 멤브레인을 관통합니다. 그런 다음, 세포질은 일반적으로 막 파손을 위해 마이크로피펫으로 흡인됩니다(conventional-ICSI). 기존 ICSI 후 마우스 난모세포의 생존율과 수정율은 각각 16%와 8%로 낮았다². Kimura와 Yanagimachi는 마우스 ICSI²에 피에조 구동 장치, 수은 및 팁이 평평한 마이크로피펫을 적용했습니다. 멤브레인 파손은 이러한 유형의 장비(piezo-ICSI)를 결합하여 반자동으로 수행할 수 있습니다. 이 저자는 기존 ICSI(16% 및 8%)에 비해 피에조-ICSI의 생존율 및 수정률(80% 및 78%)이 유의하게 높다고 보고했습니다². 피에조 -ICSI에서 얻은 더 나은 결과의 이유 중 하나는 멤브레인 파손 과정 일 수 있습니다. piezo-ICSI는 마이크로피펫으로의 세포질 흡인 없이 멤브레인을 안정적이고 반자동으로 절단할 수 있습니다. 이러한 결과는 막이 파손되는 동안 마이크로피펫으로의 세포질 흡인이 마우스 난모세포에 침습적임을 시사했습니다. 따라서 피에조-ICSI는 마우스 난모세포뿐만 아니라 인간 난모세포 ICSI에도 효과적일 수 있습니다.

그러나 인간 난모세포에 대한 기존 ICSI와 비교하여 피에조-ICSI의 효과를 평가한 논문은 5편에 불과합니다. 이 5개의 논문 모두 기존 ICSI ^3,4,5,6,7의 수정률에 비해 피에조-ICSI의 수정률이 유의하게 높다고 보고했습니다(표 1). 따라서 피에조-ICSI는 기존 ICSI에 비해 생존율 및 수정률을 향상시킬 수 있습니다. 여기에 설명된 피에조-ICSI 프로토콜의 목표는 기존 ICSI와 비교하여 ICSI의 임상 결과를 개선하는 것입니다.

프로토콜

아래에 설명된 피에조-ICSI 프로토콜은 Kameda Medical Center의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 장비 및 준비

1. 구동 장치, 작동 상자, 풋 스위치 및 컨트롤러로 구성된 피에조-ICSI 시스템을 사용합니다. 모든 유형의 도립 현미경 또는 3축 미세 조작기를 사용하십시오. 피에조 구동 장치를 마이크로피펫 홀더에 부착하고 풋스위치를 바닥에 놓습니다. 작업 상자에서 INTENSITY 레벨을 2로 설정하고 SPEED 레벨을 1로 설정합니다.
2. 팁이 평평한 시중에서 판매되는 피에조-ICSI 마이크로피펫을 사용하십시오. 마이크로피펫에 작동 액체(플루오로카본계 유체)를 20mm 길이로 채웁니다. 작동 액체에 기포가 혼합되지 않도록 하십시오. 액체 충전 장치를 사용하여 기포 또는 과도한 작동 액체를 피펫 뒤쪽으로 흡입합니다.
3. 주입 마이크로피펫 홀더에 마이크로피펫을 설치합니다. 주입 마이크로피펫 홀더에 실리콘 튜브가 있는 경우 피펫 헤드를 실리콘 튜브에 약 5mm 삽입합니다. 홀더 캡을 조이고 마이크로피펫을 단단히 고정합니다.
4. 구동 장치를 매니퓰레이터에 부착하고 무게로 인한 회전을 방지하기 위해 단단히 고정하십시오.
5. 마이크로피펫을 현미경 필드에 배치합니다. 인젝터를 작동하고 작동 액체를 마이크로피펫 헤드로 밀어 피펫 헤드 내부의 공기가 빠져나오도록 합니다. 현미경이 아닌 육안으로 피펫 헤드 내부에 공기가 남아 있지 않은지 확인합니다.
6. 그림 1과 같이 유리 바닥 접시에 ICSI 접시를 준비합니다. 7% 폴리비닐피롤리돈 용액(PVP)의 두 개의 마이크로액적을 준비합니다: 더 작은 마이크로액적은 마이크로피펫(5 μL) 준비용이고 다른 하나는 정자 선택(10 μL)용입니다. 완충된 매체로부터 유리 바닥 접시의 중앙에 만들어진 또 다른 물방울을 준비합니다. 이 미세방울은 난모세포를 위한 것으로 정자 주입(8 μL)에 사용됩니다.
7. 마이크로피펫의 헤드를 7% PVP 액적에 삽입하고 마이크로피펫의 내벽을 코팅합니다. 인젝터를 격렬하게 작동하여 작동 액체와 PVP 사이의 계면 경계를 따라 움직입니다. 피펫 헤드에서 약 800μm 떨어진 PVP로 마이크로피펫 내부를 헹굽니다.
   1. 계면 경계가 부드럽게 미끄러질 때까지 이 절차를 반복합니다(~3회 또는 4회).

2. 정자 고정화

1. 작업 상자에서 INTENSITY 레벨을 2로 설정하고 SPEED 레벨을 1로 설정합니다. 풋스위치가 켜져 있을 때 마이크로피펫 홀더에 부착된 구동 장치에서 피에조 펄스를 적용합니다. 시술 중에 피에조 펄스를 적용하면 "피에조 펄스" 아이콘이 비디오 오른쪽 상단에 나타납니다.
2. 밀도 구배(density gradient)를 사용하여 운동성 정자를 수집하고 수집된 운동성 정자를 완충된 배지에 유지합니다. 피펫을 사용하여 수집된 운동성 정자를 약 2-3 μL 동안 담고 있는 완충된 배지를 흡인합니다. 그런 다음 이 배지를 7% PVP 마이크로액적의 아래쪽에 주입합니다. 400배 배율에서 정자를 선택합니다.
   1. 마이크로피펫 팁을 선택한 정자의 꼬리에 부착한 다음 피에조 드라이브 유닛을 구동합니다. 일반적으로 한 번의 정자 고정을 위해 운전을 3회 반복합니다. 정자 고정 후 먼저 정자를 마이크로피펫 꼬리로 흡인합니다.

3. Piezo-ICSI 수술 (신축성이 높은 막을 가진 난모세포)

1. 정자의 머리를 마이크로피펫의 머리에서 약 한 줄기 길이의 정자 뒤쪽 위치에 유지합니다. 피에조 구동 장치(난모세포 1개당 약 5회)를 구동하는 동안 마이크로피펫을 전진시켜 투명대의 변형 없이 천자를 수행합니다. 마이크로피펫 팁이 투명대의 내층에 도달한 다음 투명대의 속이 빈 조각이 마이크로피펫으로 완전히 흡인되면 투명대(zona pellucida)의 천공이 완료됩니다.
2. 마이크로피펫 내부의 투명대의 속이 빈 조각을 제거하고 동시에 정자를 마이크로피펫의 머리로 이동합니다. 마이크로피펫을 밀어 넣고 난모세포 직경의 약 90%까지 세포질막을 늘립니다.
3. 충분히 늘어나면 피에조 드라이브를 한 번 시작하여 멤브레인을 파열시킵니다. 멤브레인이 되돌아온 것이 확인되면 멤브레인 파손이 완료됩니다.
4. 막이 파괴된 후 정자의 머리를 난모세포에 주입합니다. 정자의 머리를 세포질에 확실히 주입한 후에는 불필요한 액체를 넣지 않도록 주의해야 합니다.

4. Piezo-ICSI 수술 (신축성이 낮은 막을 가진 난모세포)

참고: 스트레칭 중에 자발적으로 파열될 수 있는 낮은 신장 능력 막을 가진 난모세포를 처리하는 방법을 설명합니다.

1. 세포질막이 늘어나는 지점까지 높은 신장 능력막으로 난모세포와 동일한 동작을 수행합니다.
2. 작용 중에 막이 자발적으로 파열된 경우, 정자 주입 후 난모세포의 퇴화를 방지하기 위해 정자 머리를 더 앞으로 밀지 말고 마이크로피펫 위치에서 정자의 머리를 주입합니다.
3. 정자의 머리를 세포질에 확실히 주입한 후에는 불필요한 액체를 넣지 않도록 주의해야 합니다.

결과

상기에서 기술된 종래의 ICSI 및 피에조-ICSI는 4명의 배아학자에 의해 10,488개의 성숙한 난모세포(1,744 주기)에 대해 수행되었습니다. 이 중 3,522개의 난모세포(587주기)는 2013년 1월부터 2016년 9월까지 기존 ICSI를 통해 수정되었으며, 2016년 10월부터 2020년 12월 사이에 가메다 메디컬 센터에서 6,966개의 난모세포(1,157주기)를 피에조-ICSI로 수정했습니다. 표 1 은 여성의 평균 연령, 수정률, 생존율, 퇴행률, 5일차 배반포 비율 및 기존 ICSI 및 피에조-ICSI의 주기당 평균 동결 보존된 배반포 수를 보여줍니다. 여성의 피에조-ICSI의 평균 연령은 기존 ICSI에 비해 더 높았지만, 수정, 생존 및 배반포의 비율과 피에조-ICSI의 주기당 냉동 보존된 배반포의 평균 수는 기존 ICSI에 비해 유의하게 높았습니다(표 2).

그림 1: 피에조-ICSI에 사용되는 ICSI 접시. 미세방울의 레이아웃은 여기에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

공부	기존-ICSI	피에조-ICSI
Yanagida 외 (1999)	66%a의	79%b
타케우치 외 (2001)	83%이a	90%비
히라오카 외 (2015)	68%이a	89%비
후루하시 외 (2019)	64%이a	75%비
후지이 외 (2020)	71%ᅡ	84%비
같은 줄에 ab<0.05

표 1: 기존 ICSI와 피에조-ICSI의 수정률 비교. 모든 보고서에서 기존 ICSI에 비해 피에조-ICSI에서 상당히 높은 수정률이 관찰되었습니다.

	기존-ICSI	피에조-ICSI	P
여성의 평균 연령	38.6 ± 0.2	39.2 ± 0.2	<0.05
아니요. 사이클의 수	587	1,157	-
아니요. 난모세포의 수	3,522	6,966	-
아니요. 시비의 (%)	2,352 (66.8)	5,411 (77.7)	<0.01
아니요. 생존율(%)	3,303 (93.8)	6,767 (97.1)	<0.01
아니요. 퇴행의 (%)	219 (6.2)	199 (2.9)	<0.01
아니요. 배반포의 (%)	915 (38.9)	2,787 (51.5)	<0.01
보통 그렇지 않습니다. 사이클당 동결보존된 배반포 수	3.8 ± 0.2	5.1 ± 0.2	<0.01

표 2: 기존 ICSI와 피에조 ICSI의 효능을 비교한 Kameda Medical Center의 임상 결과. 모든 비교 항목에서, 종래의 ICSI와 비교하여 피에조-ICSI에서 유의하게 더 나은 결과가 관찰되었다.

토론

그 결과, 피에조-ICSI의 수정률, 생존율, 5일차 배반포 비율 및 평균 동결보존배반포 수가 기존 ICSI에 비해 유의하게 높았음을 보여주었습니다.

피에조-ICSI 프로토콜에는 2가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 피펫 홀더의 홀더 캡을 단단히 비틀는 것입니다. 두 번째 단계는 마이크로피펫으로 흡입된 PVP 부피를 300마이크로미터 미만으로 유지하는 것입니다. 마이크로 피펫 홀더의 홀더 캡을 느슨하게 비틀고 PVP를 300 마이크로 미터 이상 (정자의 전체 길이는 약 60 마이크로 미터) 이상으로 흡인하면 피에조 파워의 감소로 인해 정자 고정, 구역 개방 및 막 파손에 어려움을 겪습니다. 특히, 우리는 시술 중에 마이크로피펫으로 흡입된 PVP 부피에 항상 주의를 기울여야 합니다. 이것이 피에조 -ICSI의 한계입니다.

피에조 파워를 생성하기 위해 마이크로피펫 내부에 소량의 무거운 액체를 작동 액체로 배치하는 것이 필수적입니다. 이전 보고서에서 수은은 작동 액체 ^2,3,4로 사용되었습니다. 그러나 안전을 위해 수은 대신 플루오로 카본 기반 유체를 사용할 수 있습니다 5,6,7,8,9,11. 플루오로카본계 액체는 비중이 1.8이며 무색, 투명, 비수용성입니다. 작동 액체는 정자를 보유하고있는 PVP와 직접 접촉합니다. PVP가 수술액에 노출되면 정자 또는 난모세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 피에조-ICSI의 수정, 생존율, 5일차 배반포의 비율은 본 연구에서 기존의 ICSI에 비해 유의하게 높았다. 우리는 작동 액체와 PVP 사이의 직접 접촉으로 인한 위험이 매우 낮다고 생각합니다.

우리는 이전에 오일 주입기와 공기 주입기로 마이크로피펫 준비 시간을 측정했습니다. 오일 인젝터와 에어 인젝터의 마이크로피펫 준비에 대한 평균 시간은 각각 233초와 106초였습니다(P < 0.05)⁸. 공기 주입기를 사용한 마이크로피펫 준비 시간은 오일이 없기 때문에 더 짧습니다. 오일의 존재는 끈적임으로 인해 마이크로피펫 준비 시간을 연장합니다. 마이크로피펫을 피펫 홀더에 삽입한 후 마이크로피펫 내부의 오일 영역에 기포가 섞이면 피에조-ICSI가 작동하지 않으므로 피펫을 폐기해야 합니다. 또한 마이크로피펫 준비 중에 낭비되는 마이크로피펫의 수를 계산했습니다. 오일 주입기와 공기 주입기의 환자당 평균 낭비된 마이크로피펫 수는 0.28 ± 0.56 및 0 ± 0(P < 0.05)으로 각각⁸이었다. 그러나 피에조-ICSI⁸ 이후 생존율(99% 및 99%), 수정률(89% 및 90%), 양질의 3일차 배아(61% 및 61%)에서는 오일 주입기와 공기 주입기 간에 유의한 차이가 없었다. 연구 기간 동안 공기 주입 그룹(90명)에 비해 오일 주입 그룹(90명)에서 3.2시간과 25개의 마이크로피펫을 추가로 낭비했다⁸. 결과는 오일 주입기 대신 공기 주입기를 사용하는 것이 피에조 ICSI의 좋은 변형임을 나타냅니다.

piezo-ICSI는 마이크로피펫으로 세포질 흡인 없이 멤브레인을 반자동으로 절단할 수 있습니다. 이 멤브레인 파손 절차는 안정적이고 쉽습니다. 피에조-ICSI는 또한 ICSI 교육 기간을 단축하는 데 기여할 수 있습니다. 우리는 이전에 젊은 배아학자를 위해 생존율, 수정, 배반포에 대한 piezo-ICSI의 효과를 평가했습니다. 이 젊은 배아학자는 임상 ICSI 치료를 시작하기 전에 피에조-ICSI 실습을 30회 받았습니다. 우리는 1차 100개의 난모세포에 대해 젊은 배아학자와 고참 배아학자의 생존, 수정, 배반포 비율을 비교했습니다. 젊은 배아학자와 고령 배아학자의 생존율, 수정, 배반포율은 각각 100%와 97%, 87%와 91%, 47%, 57%였다⁹. 모든 비교 항목에서 젊은 배아학자와 고참 배아학자 사이에는 유의미한 차이가 없었다. 이러한 결과는 piezo-ICSI가 젊은 배아학자의 ICSI 교육 기간을 단축하는 데 기여할 수 있는 막 파괴 절차에서 중요하다는 것을 나타냅니다.

일부 연구자들은 세포질 내 형태학적으로 선택된 정자 주입(IMSI)의 임상적 효율성을 보고했습니다. Setti 등은 메타 분석 연구에서 ICSI와 IMSI의 임상 결과를 비교했다¹⁰. ICSI군과 IMSI 그룹 간의 수정률에는 유의한 차이가 없었다¹⁰. 그러나 IMSI 그룹의 최고 품질 배아 비율은 ICSI 그룹¹⁰에 비해 유의하게 높았습니다. 우리가 아는 한, 피에조-ICSI와 결합된 IMSI가 수정 및 배아 발달에 미치는 영향을 조사한 연구는 없습니다. 우리는 piezo-ICSI에서 수정 및 배아 발달에 대한 정자 선택 확대(400배 대 1,200배)의 효과를 후향적으로 조사했습니다. 1,200x 그룹(92%)의 수정률은 400x 그룹(77%)에 비해 유의하게 높았다(P=0.0002)¹¹. 1,200x 그룹(64%)의 양질의 3일차 배아 비율은 400x 그룹(46%)에 비해 유의하게 높았습니다(P=0.0021)¹. 우리는 1,200배 배율로 정자의 머리에 액포가 없는 정자를 선택하려고 했습니다. 이 절차는 정자 DNA 단편화 정도가 더 낮은 정자를 선택할 수 있습니다¹². 따라서, IMSI는 피에조-ICSI의 새로운 응용일 수 있다.

여기에서는 인간 ART에서 생존 가능한 난모세포를 놓치지 않고 ICSI 결과를 개선할 수 있는 피에조-ICSI에 대한 프로토콜에 대해 설명했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에어 인젝터	NARISHIGE CORPORATION	IM-12
피에조 드라이브 유닛	PRIME TECH Ltd.	PMM4GD
마이크로 피펫	PRIME TECH Ltd.	PINU06-20FT
작동 액체	3M	3M ™ 노벡&트레이드;
PVP 7% 즉시 사용 가능한 솔루션	Cooper Surgical, Inc.	ART-4005-A
완충 매체	시험관	G-MOPS PLUS
유리 바닥 접시	NIPRO	87-453
도립 현미경	OLYMPUS CORPORATION	IX-73