여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.
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방법 논문
성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
성상 세포는 성인 두뇌에 있는 가장 풍부한 세포 모형 중 입니다, 기능의 복합성에서 중요한 역할을 하는 곳에. 뇌 항상성의 중심 플레이어로서, 성상 세포는 중요한 대사 산물과 세포 외 물, 이온, 및 글루타민산염과 뉴런을 공급합니다. "삼중 분" 시냅스의 필수적인 구성 요소인 성상 세포는 시냅스의 형성, 가지 치기, 유지 보수 및 변조에도 중요합니다. 이러한 고도의 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해, 성상 세포는 자신과 다른 신경교 세포와 통신, 뉴런, 뇌 혈관, 세포 세포를 포함하는 전문 막 단백질의 무리를 통해 세포 외 환경 접착 분자, 아쿠아포린, 이온 채널, 신경 전달 물질 수송기 및 갭 접합 분자. 이 동적 플럭스를 지원하기 위해, 성상 세포, 뉴런처럼, 밀접하게 조정하고 효율적인 세포 내 수송에 의존. 세포 내 인신 매매가 광범위하게 묘사 된 뉴런과 는 달리, 성상 세포에서 미세 관 기반 의 수송은 덜 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고, 세포막 단백질과 세포내 세포기관 수송의 엑소좀 및 내분비 인신 매매는 성상 세포의 정상적인 생물학을 조율하고, 이 프로세스는 수시로 질병에서 또는 상해에 응하여 영향을 받습니다. 여기에서 우리는 고품질 뮤린 점성체를 배양하고, 형광성 성상 세포 단백질 및 관심 있는 세포기관에 표시하고, 시간 경과 공초점 현미경 을 사용하여 세포내 수송 역학을 기록하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 또한 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI) 플러그인을 사용하여 획득한 영화에서 관련 전송 매개 변수를 추출하고 정량화하는 방법을 시연합니다.
서론
성상 세포는 성인 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포로 독특한 발달 및적시 성 기능을 수행합니다 1. 성상 세포는 시냅스 형성을 용이하게 하는 신경 전달 물질 수용체, 수송기 및 세포 접착 분자를 포함하는 트라이 파르트 족속 시냅스의 일환으로 전과 후 발착 단자와직접 접촉을 통해 시냅스 발달을 조절합니다. 및 뉴런-성상세포 통신2. 또한, 성상세포는 시냅스 전달을 능동적으로 제어하고 시냅스 갈라진 자로부터 흥분성 신경 전달 물질을 신속하게 제거하고 신경 전달 물질을 재활용하며 시냅스 가지치기에 참여함으로써 신경 흥분성 물질을 방지합니다3 , 4개 , 5개 , 6. 이러한 고도로 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해 성상 세포는 다른 신경교 세포와 세포 접착 분자, 아쿠아 포린, 이온 채널을 포함한 특수 막 단백질을 통해 뉴런과 통신합니다. 신경 전달 물질 수송기, 및 갭 접합 분자. 성상 세포는 적극적으로 그들의 세포 내 및 세포 외 환경에서 변동에 응하여
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프로토콜
모든 동물 절차는 채플 힐 동물 관리 및 사용위원회에서 노스 캐롤라이나 대학의 승인으로 수행되었다 (IACUC).
1. 뇌 해부 및 기본 마우스 성상 세포의 문화
참고 : 다음 프로토콜은 맥카시와 deVellis13,14,15에의해 개발 된 원래 절차를 다음과 출판 된 방법에서 적응되었다 . 맥카시/데벨리스(MD) 성상세포의 혼합 세포 배양은 산후 2-4(P2−P4) 마우스 코르티케, 반유사성 인자로 처리되고, 최종 농축 성상세포 배양을 산출하도록 정제된다. 어느 성별의 마우스 새끼로부터4개의 코르티케는 하나의 T75 조직 배양 플라스크 배양액을 생성하기에 충분하다.
- T75 플라스크 바닥(100% 각진 목 접근, 0.22 μm 소수성 환기 필터 캡)을 폴리-D-리신(0.1 M Tris 완충제의 1 mg/mL, pH 8.5)으로 코팅하고 해부를 시작하기 전에 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 해부 절차를 시작하기 전에, 성상 세포 배양 배지의 30 mL (덜베코의 수정 된 독수리의 배지 [....
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결과
위에서 설명한 기본 마우스 MD 성상 세포를 확립하기 위한 프로토콜은 재현 가능한 고품질 문화를 생성해야 합니다. 배양체는 처음에 성상세포, 섬유아세포 및 마이크로글리아 및 올리고엔드로시트를 포함한 다른 신경교 세포의 혼합을 포함하지만(그림1Bi, Biv;적색 화살촉), DIV5-DIV7 사이의 혼합 배양에 AraC를 첨가하는 것은 최소화한다. 이러한 오염 세포의 증식. 병용 아라C 처리 및 쉐이킹 계 정제 전략은 정제 단계만을 포함하는 전통적인 프로토콜에 비해 성상 세포 배양체(도1Bii)의순도를 풍부하게 한다(도1Bv;blue; blue; 화살촉)13. AraC 또는 좌측 치료되지 않은 채 처리된 정제된 성상세포 배양물의 예상 형태(G.......
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토론
여기에서, 우리는 고순도 1 차적인 마우스 피질 MD 성상 세포에 있는 시간 경과 비디오 현미경 검사법을 사용하여 관심있는 형광성 으로 표를 붙인 세포기관 및 막 단백질을 표현하고, 구상하고, 추적하는 실험적인 접근을 기술합니다. 또한 입자 역학을 측정하는 방법론도 간략하게 설명합니다. 1 차 적인 성상 세포에 있는 단백질과 세포기관 역학의 직접적인 시각화는 시험관내 이 세포에 있는 세포내 수송의 규정을 공부하는 강력한 공구를 제공합니다.
위에서 설명한 마우스 MD 성상 세포 배양법을 확립하는 방법은 다른 출판 된 프로토콜13,14,15의단계를 결합하여 더 간단한 방법과 더 높은 순도 및 품질을 제공합니다. 문화. AraC15 처리 및 동요계 정제
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
DNL은 채플 힐 (UNC) 의학 대학에서 시몬스 학자로 노스 캐롤라이나 대학에 의해 지원되었다. TWR은 UNC 준비 그랜트 R25 GM089569에 의해 지원되었다. UNC 신경과학 센터 현미경 코어 시설을 이용한 작업은 NIH-NINDS 신경과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. HD079124.
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재료
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| 2.5% 트립신(10x) | Gibco | 15090-046 | |
| 벤치탑 원심분리기 | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 원심분리기 |
| 세포 배양 등급 수 | 성 클론 | 25-511 | |
| 세포 배양 현미경 | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 도립 스코프, 형광 기능이 |
| 있는 도립 조직 배양 현미경시토신 아라비노사이드 | 시그마 | C1768-100MG( | AraC) 동결건조된 분말을 멸균 세포 배양 등급의 물에 용해시켜 10mM 스톡을 만들고 장기 보관을 위해 분취 및 동결 |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | 동결건조된 분말을 탈이온수에 최대 농도 20mg/ml로 용해하고 필요에 따라 가열하거나 초음파 처리합니다. 카운터 스테인을 위해 300nM에서 사용하십시오. |
| 해부 현미경 | Zeiss | Stemi 305 | |
| 해부 가위 | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | 버전 1.52i | |
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| 형광 광원 | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
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| 조직 배양 플라스크 | Olympus Plastics | 25-209 | 75cm^2. 100% 앵글 넥 접근, 0.22um 소수성 벤티드 필터 캡 |
| 조직 배양 인큐베이터 | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, 온도, 습도 및 CO2 제어 |
| 기능이 있는 조직 배양 인큐베이터Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402g을 4.829g Tris HCl과 함께 물 1리터에 용해시켜 0.1M Tris 완충액, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829g를 물에 1리터에 용해하고 8.402g Tris Base를 만들어 0.1M Tris 완충액, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA(0.25%), 페놀 레드 | Gibco | 25200072 | |
| 진공 구동 필터 시스템 | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES 멤브레인, 0.22 &마이크로; m |
| バンナス 시저 스트레이트 | ロハクス | RS-5620 |
참고문헌
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
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