이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
미생물 간의 상호 작용에 대한 연구는 새로운 항균제에서 미생물 생태학의 통찰력에 이르기까지 수많은 발견으로 이어졌습니다. 미생물 상호 작용의 연구에 사용되는 많은 접근 은 특수 장비를 필요로하고 비싸고 시간 집약적입니다. 이 백서는 저렴하고, 큰 샘플 수로 확장 가능하며, 수많은 실험 설계에 쉽게 적응할 수 있는 공동 배양 상호 작용 분석프로토콜을 제시합니다. 미생물은 함께 배양되며, 각각의 우물은 미생물의 쌍으로 조합을 나타냅니다. 시험 유기체는 각 우물의 한쪽에 배양되고 먼저 단일 배양에서 배양됩니다. 그 후, 표적 유기체는 3D 인쇄 접종 스탬프를 사용하여 각 우물의 반대쪽에 동시에 접종됩니다. 공동 배양 후, 완성된 어소시에이스는 성장 또는 억제와 같은 시각적 표현형에 대해 채점된다. 이 계산은 표현형을 확인하거나 관심의 격리 중 패턴을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 간단하고 효과적인 방법을 사용하여 사용자는 미생물의 조합을 신속하고 효율적으로 분석 할 수 있습니다. 이 공동 배양 접근법은 항생제 발견뿐만 아니라 배양 기반 미생물군유전체 연구에 적용가능하며 이미 두 응용 분야에 성공적으로 적용되었습니다.
서론
자연에서 미생물은 거의 고립되어 존재하지 않습니다. 따라서, 그들은 지속적으로 다른 유기체와 상호 작용하고 있습니다. 따라서 미생물이 서로 상호 작용하는 방식을 연구하는 것은 수많은 미생물 행동을 이해하는 데 필수적입니다1. 미생물 상호 작용은 상호, 공생, 또는 길항제 일 수 있습니다. 이 것들은 미생물 자체뿐만 아니라 미생물이1,2를식민지화하는 환경과 숙주에도 영향을 미칠 수 있습니다.
많은 과학자들은 새로운 항균 분자를 확인하기 위해 미생물 상호 작용을 연구합니다. 첫 번째 임상적으로 중요 한 항균 분자 중 하나는 미생물 상호 작용의 연구를 통해 발견 되었다. 경 알렉산더 플레밍은 오염 페니실륨 종자를 관찰. 황색 포도상 구균 균주의 성장을 억제 분리, 이는 일반적으로 사용되는 항생제 페니실린의 발견을 주도3. 미생물이 경쟁사를 적대하는 데 사용하는 메커니즘의 특성화는 항균 분자의 발견을위한 유익한 자원으로 남아 있습니다. 예를 들어, 최근 스트렙토마이스 스프랭크 Mg1이 항생제 라인아미신을 생산하는 것으로 나타났으며, 이는 바실러스 서브틸리스4에대한 용염및 분해 활성을 갖는다.
또한, 루그두닌이라는 비리보솜 합성 펩티드는 최근 비강 공생황색포도상구균 루그두넨시스가 황색포도상구균5를억제한다는 관찰 을 받은 후발견되었다. 연구는 또한 미생물 간의 상호 상호 상호 작용은 항균 분자의 발견에 대 한 길항 상호 작용으로 동등 하 게 강력한 나타났습니다. 예를 들어, 아티니 항구 공생 박테리아에 있는 많은 곰팡이 농업 개미는 그들의 진균 작물의 의무 병원체를 억제하기 위하여 항진균 분자를 생성하는 그들의 외골격에 슈도노카디아에게 불린6. 미생물 상호 작용의 연구는 항균 분자를 발견에 대 한 도움이 되었습니다., 높은 처리량 스크린의 사용 새로운 항균 분자의 발견귀착될 수 있습니다.
비용과 성능의 용이성에 관하여, 미생물 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 방법론은 간단한에서 복잡한 범위. 예를 들어, 한천 플러그 분석법은 여러 미생물 사이의 적대감을 조사하는 데 사용할 수있는 저렴하고 간단한 방법입니다7. 그러나, 한천 플러그 분석은 효율적인 절차가 아니며 많은 쌍으로 조합에 대한 노동 집약적 일 수있다. 미생물로 생산된 제품이 높은 처리량 방식으로 관심 있는 표적 분리에 미치는 영향을 평가하기 위해 많은 실험실에서 디스크 확산 검정 을 사용합니다8. 이러한 검사는 쉽고 저렴하며 샘플7의더 많은 수로 확장 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 분석법은 미생물 추출물의 생성을 필요로 하며 살모넬라 및 세팔로스포린스9와같은 표적 유기체 및 항생제의 특정 조합에 대해 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있다.
선행 접근법은 미생물이 서로 상호 작용하는 대신, 표적 유기체에 있는 반응을 이끌어 내는 격리된 분대에 의존합니다. 이것은 미생물 간의 상호 작용이 단일 배양에서 생산되지 않는 "비밀스러운"항균 분자의 생산을 유도 할 수 있기 때문에 주의입니다. 예를 들어, 최근에는 항균 키이신이 동일한 스폰지 미생물군유전체10으로부터분리되는 로도코쿠스 스프로도코쿠스와 병용배할 때 에 의해서만 마이크로모노스포라 스프로 생산되는 것으로 나타났다. 더 복잡한 상호 작용 방법론은 이러한 잠재적단일 문화 장애를 우회합니다. 예를 들어, iChip은 환경 샘플로부터 박테리아를 배양하기 어렵고 희귀하고 어려운 분리에 유용하며,11번소자에서의 성장을 통한 미생물 상호작용의 관찰을 가능하게 한다. 상호 작용을 자세히 조사하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 시간(MALDI-TOF-IMS)을 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 높은 공간 분해능으로 미생물 식민지를 상호 작용하여 생성된 소분자 및 펩타이드의 조성 및 분포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. MALDI-TOF-IMS는 또한 경쟁12,13,14,15의메커니즘을 특성화하기 위해 세균 상호 작용의 다중 연구에서 사용되어 왔다. 그러나 MALDI-TOF-IMS는 종종 까다로운 시료 준비, 장비를 작동하기 위한 전문 지식, 고가의 특수 질량 분석기를 필요로 합니다. 이러한 이유로 높은 처리량 연구에 사용하기가 어렵습니다. 따라서, 상기 접근법의 많은 한계를 극복하는 미생물 상호작용에 대한 간단하고 확장 가능하며 높은 처리량의 공동 배양 분석이 유익할 것이다.
여기서, 높은 처리량 미생물 공동 배양에 대한 프로토콜이 제시된다. 이 분석법은 간단하고 쉽게 미생물 상호 작용의 기존 연구에 통합. 미생물 상호 작용의 연구를 위해 일반적으로 사용되는 많은 방법과는 달리, 우리의 방법은 간단하고 저렴하며 많은 수의 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이러한 어설미는 수행하기 쉬울 뿐만 아니라 대부분의 실험실 공급업체 또는 공공 자원(예: 라이브러리 및 메이커스페이스)에서 널리 사용할 수 있습니다. 따라서, 이 분석은 미생물의 많은 쌍으로 조합 중 흥미로운 패턴을 확인하고 구문 분석하는 조사의 첫 번째 라인으로 유리하다, 이는 미생물 생태학의 조사에 특히 유용 할 수있다.
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프로토콜
통보 된 동의는 기증자의 부모로부터 얻은, 위스콘신 - 매디슨 대학의 인간 과목위원회는 연구를 승인 (기관 검토 위원회 [IRB] 승인 번호 H-2013-1044).
1. 견본 문화
참고: 이 절차는 인간 비강에서 분리 된 박테리아 간의 상호 작용 연구를 위해 여기에 사용됩니다. 원칙적으로 다음 방법은 모든 문화 조건에 적용할 수 있습니다. 뇌-심장 주입 국물 (BHI) 비 강 박테리아의 일반적인 전파에 사용 됩니다. 모든 플레이트는 1.5% 한천을 사용하여 응고됩니다. 이 연구를 위해, 샘플은 기증자의 코 (비강 세척)로 플러시 된 식염수 용액에서 채취되어 미세 원심 분리튜브로 옮겨지고 -80 °C에서 냉동됩니다.
- 표준 배양 기술을 사용하여 해동된 각 세척 샘플의 100 μL을 BHI 플레이트위에 플레이트합니다.
- 1 주동안 37 °C에서 공기중으로 플레이트를 배양합니다.
- 배양 후, 플레이트당 각 뚜렷한 형태형의 ≥2 콜로니를 선택하고 초기 플레이트로부터 콜로니를 새로운 BHI 플레이트상에 줄무늬를 두르고 37°C에서 플레이트를 배양하여 BHI 플레이트상에 에어로적으로 분리합니다. 세균 배양이 순수할 때까지 반복합니다.
참고: 세균 분리는 콜로니 형태, 그람 염색, 16S rRNA 유전자 시퀀싱, 또는 다른 방법을 통해 확인될 수 있다. 그러나 격리의 ID를 아는 것은 프로토콜을 계속 하기 위해 필요하지 않습니다. - 모든 세균은 50% 글리세롤 1 mL과 1 mL의 세균 밤새 배양 (섹션 3 참조)을 결합 한 후 -80 °C에서 모든 박테리아 분리를 냉동 보존합니다.
2. 3D 프린팅 스탬프
참고: 폴리카보네이트는 표준 오토클레이브 온도(121°C)를 초과하는 높은 유리 전이 온도(147°C)로 인해 스탬핑 재료로 선택되었으며, 이는 반복사용 후 변형 가능성을 최소화합니다.
- 폴리카보네이트 필라멘트로 3D 프린터를 로드합니다.
- 흰색 학교 접착제 (폴리 비닐 아세테이트)를 인쇄 침대에 적용하여 접착을 돕고 인쇄 중에 접종 스탬프의 뒤틀림을 최소화하십시오.
- 을 로드합니다. 3D 프린터 소프트웨어에 접종 스탬프(그림 1)에대한 STL 모델 파일(보충 데이터 파일).
- 접종 스탬프를 290 °C 노즐 온도, 60 °C 침대 온도 및 층 높이 0.38mm로 인쇄합니다.
- 알루미늄 호일에 스탬프를 감싸고 15 분 동안 건조된 중력 사이클에서 1.5 시간 동안 오토 클레이브하여 살균하십시오.
참고: 폴리카보네이트는 흡습성이지만, 오토클레이브 후 물 무게는 약 0.5%에 불과합니다.
3. 하룻밤 문화의 준비
- 혈청학적 파이펫을 사용하여, 14 mL 배양 튜브에 멸균 BHI 국물의 파이펫 3 mL.
- 멸균 1 μL 접종 루프를 사용하여, 국물에 세균성 콜로니를 접종. 루프를 소용돌이치면 덩어리가 국물에 분산되도록 합니다. 배양 튜브를 배양 전에 잠시 소용돌이.
- 배양튜브를 37°C에서 밤새 (~16시간) 250 rpm에서 셰이커에 배양한다.
- 소용돌이는 세균 배양이 충분한 탁도에 도달하면 세포의 덩어리를 분해한다 (OD600 ≥ 1).
4. 바이오 분석 판의 준비
참고: 바이오 분석 플레이트는 멸균을 유지하기 위해 층류 후드에 제조된다.
- 1.5% 한천으로 BHI 매체를 준비하고 제조업체의 지침에 따라 오토클레이브를 사용하여 살균하십시오.
- 오토클레이브 후, 온도 조절 수조에서 BHI 매체를 55°C로 냉각시.
- 혈청학적 파이펫을 사용하여, 용융 BHI 매질의 3 mL를 12웰 플레이트 상에 각각 12개의 웰로. 우물이 가능한 한 정확하고 균일한지 확인하십시오. 1 리터의 매체는 ~ 27 개의 바이오 분석 판을 산출합니다.
- 한천을 하룻밤 사이에 놓습니다.
5. 시험 유기체와 생물 분석 판을 접종
참고: 시험 유기체는 억제 활성(예를 들어, 항생제 생산)의 생산이 공동 배양 상호작용 분석실험을 사용하여 결정되는 유기체를 지칭한다. 이 실험을 위해, 시험 유기체는 비강 세척 샘플로부터 분리된 액티노박테리아이다.
- 멸균 된 10 μL 접종 루프를 밤새 배양에 삽입하고 플레이트의 왼쪽 3 분의 1에 배양 액적을 잘 줄무늬하여 생물 분석 판상에 시험 유기체를 접종합니다.
참고: 우물의 과성장이 나중에 표적 유기체의 접종을 금지하기 때문에 우물의 3 분의 1만 줄무늬하는 것이 좋습니다. - 플레이트의 모든 12개의 웰이 시험 유기체로 접종될 때까지 반복합니다.
- 접시를 7 일 동안 적절한 온도에서 거꾸로 배양하십시오. 더 높은 온도(≥37°C) 또는 건조한 기후에서 플레이트가 건조하지 않도록 습한 용기에 보관하십시오.
6. 대상 생물의 준비
참고: 표적 유기체는 그의 억제 상태가 공동 배양 상호 작용 분석기를 사용하여 결정되는 유기체를 지칭한다. 본 실험을 위해, 표적 유기체는 황색포도상구균 종자이다.
- 6 일 동안 생물 분석 판을 배양 한 후, 위에서 수행 한 바와 같이 지정된 대상 유기체의 하룻밤 배양을 준비하십시오 (섹션 3 참조).
7. 대상 유기체 접종
참고: 하룻밤 배양 후, 배양이 혼탁되었는지 확인한다(OD600 ≥ 1). 몇몇 세균성 배양은 배양 관의 바닥에 응집할 수 있습니다. 배양 튜브를 소용돌이하여 덩어리를 분산시키고 배양 탁도를 평가한다.
- 빈 12웰 플레이트의 각 웰을 BHI 1.8 mL 및 200 μL의 표적 하룻밤 배양물로 채우서 타겟 플레이트를 준비한다.
- 포장을 풀고 멸균 접종 스탬프를 대상 플레이트에 넣습니다. 부드럽게 문화가 이웃 우물을 오염 교차하지 않도록주의를, 우물 주위의 문화를 소용돌이.
- 접종 스탬프를 들어 올리고 각 스탬프 팁에 희석 된 대상 배양액이 있는지 확인하십시오.
-
접종 스탬프를 단균 된 생물 분석 판에 배치하여 단일 배양 제어 플레이트를 준비하고 배양 방울이 각 우물을 접종할 수 있도록 스탬프를 부드럽게 흔들어 보냅니다. 접종 스탬프가 제거되면, 배양 액적은 생물 분석 판의 우물에서 볼 수 있어야합니다.
- 고르지 않은 수준의 매체로 인해 접종 스탬프를 접종하지 않은 우물의 경우, 피펫을 사용하여 우물의 오른쪽에 희석 된 하룻밤 배양물 3 μL을 발견하십시오.
- 위에서 수행한 바와 같이 바이오 분석 플레이트를 접종하지만(단계 7.4.1 참조), 팁이 12웰 플레이트의 오른쪽에 정렬되도록 스탬프를 정렬합니다. 우물을 접종 할 때 스탬프가 기존 세균 식민지에 접촉하지 않도록하십시오.
- 조심스럽게 스탬프를 제거하고 대상 플레이트에 다시 놓습니다.
- 모든 플레이트가 접종될 때까지 각 바이오분석판에 대한 접종을 반복합니다.
- 7일 동안 적절한 온도에서 거꾸로 인큐베이팅 된 바이오 아세이 플레이트.
8. 득점
-
1 주 동안 시험 및 표적 유기체를 공동 배양 한 후, 다음 시각적 평가에 따라 상호 작용을 채점하십시오.
- 단일 배양 대조군과 구별할 수 없는 성장을 나타내는 표적 유기체 성장을 "0"(억제 없음)으로 점수매기고(도2A, B).
- 대조군과 비교하여 성장이 감소하는 표적 유기체로 웰을 점수매기면 "1"(약한 억제)(그림2C).
- 표적 유기체가 "2"(강한 억제)로 성장하지 않은 우물을점수(도 2D).
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결과
공동 배양 상호 작용 검사는 미생물 상호 작용을 이해하고, 관심있는 패턴을 식별하고, 흥미로운 활동으로 미생물 격리를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 실험에서, 시험 유기체는 12개의 잘 한천 판의 한쪽면에 단양되고 7일 동안 배양된다. 이어서, 표적 유기체는 시험 유기체 옆에 발견되고 2개의 미생물은 표적 유기체의 성장 표현형을 위해 채점하기 전에 7일 동안 공동 배양되었다. 분석은 표적 유기체의 성장 또는 억제의 시각적 분석에 근거하여 득점됩니다.
이러한 공동 배양 분석은 최근 인간의 비강으로부터 분리된 황색포도상구균(표적 생물)을 향한 액티노박테리아(test organisms)의 억제 활성을 평가하기 위해 사용되었다(도2)16.
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토론
미생물 상호 작용을 중재하는 항생제 및 기타 이차 대사 산물은 약물 발견을 포함한 다양한 응용 분야에 유용합니다. 본 명세서에서, 많은 수의 미생물 상호작용을 평가하기 위한 공동 배양 분석에 대한 프로토콜이 제시된다. 이러한 공동 배양 상호 작용 검사는 간단하고 저렴하며 확장 가능하며 처리량이 높은 미생물의 많은 쌍조합을 나란히 조사하는 것을 의미합니다. 표적 유기체는 접종 스탬프를 사용하여 12웰 플레이트의 우물에서 시험 유기체 옆에 발견되고, 표적 유기체의 억제는 표적 유기체의 표현형의 육안 검사에 기초하여 득점된다. 이 계산서에 사용된 물자의 대다수는 대부분의 실험실 공급자를 통해 또는 공공 자원을 통해 쉽게 유효합니다. 따라서, 이 검사는 많은 실험실 환경에 쉽게 맞출 수 있다. 실험실에서, 이 공동 문화 시험은 다양한 환경에서 많은 호스트와 관련되었던 미생물의 상호 작용을 조사하는 데 성공했습니다.
이 기술에는 많은 이점이 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫 번째...
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 원고의 비판적 독서에 대한 다니엘 월, 마크 체브렛, 돈 호앙 감사합니다. 카메론 R. 커리의 노력을 포함하여이 작품은 위스콘신 - 매디슨 대학, 위스콘신 동창 연구 재단의 자금으로 연구 및 대학원 교육 부총장 사무실의 지원, 또한 에 의해 제공 된 자금 번역 연구를위한 우수성에 대한 보건 센터의 국립 연구소 (U19-AI109673-01). 리드 M. Stubbendieck 는 생물학 및 의학 교육 프로그램의 전산 및 정보학에 대한 국립 의학 교육 보조금 (NLM 5T15LM007359)에 의해 지원되었습니다. 기금 모금자는 연구 디자인, 데이터 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작품을 제출하기로 결정에 아무런 역할이 없었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 &뮤; L 일회용 폴리스티렌 접종 루프, 파란색 | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L 일회용 폴리스티렌 접종 루프, 노란색 | VWR | 12000-810 | |
| 12웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑이 있는 멸균 | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브, 17 x 100mm 2style, 비발열성, 멸균 | Falcon | 352057 | |
| 2.0 자체 스탠딩 스크류 캡 튜브(캡 포함), 멸균 | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL 혈청학 피펫 | 세포 치료 | 229225B | |
| 한천, 세균학 | VWR | J637 | |
| 뇌 심장 주입 국물 | 점 과학 | DSB11000-5000 | |
| 폴리카보네이트 필라멘트, 흰색, 3 mm 직경 | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| 학교 접착제 | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D 프린터 | Lulzbot |
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