이 프로토콜은 다중 섬유 광도 측정 기록을 구현하고 수행하는 방법, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 이중 색상 광도계 이미징에 대한 중요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자유롭게 움직이는 동물에서 뉴런 그룹의 활동을 기록하는 것은 어려운 일입니다. 더욱이, 두뇌는 더 작고 더 작은 기능 적인 하위 그룹으로 해부되기 때문에, 뉴런의 투영 및/또는 유전적으로 정의된 하위 집단에서 기록하는 것이 가장 중요하게 됩니다. 섬유 광도 측정은 이러한 문제를 극복할 수 있는 접근가능하고 강력한 접근 방식입니다. 광학 및 유전 적 방법론을 결합하여, 신경 활동은 쉽게 측정 할 수있는 광학 신호로 신경 활동을 변환 유전자 부호 칼슘 지표를 표현하여 깊은 뇌 구조에서 측정 할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 다중 섬유 광도 계열 시스템의 구성 요소, 빛을 전달하고 수집하는 깊은 뇌 구조에 액세스하는 방법, 모션 아티팩트를 설명하는 방법, 형광 신호를 처리하고 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 단일 또는 다중 이식된 광섬유에서 단일 및 이중 컬러 이미징을 수행할 때 실험적 고려 사항을 자세히 설명합니다.
서론
동물의 행동의 특정 측면과 신경 반응을 상관 시키는 능력은 특정 신경 세포 의 특정 그룹 지시 또는 행동 또는 자극에 응답에 재생 하는 역할을 이해 하는 데 중요 하다. 동물 행동의 복잡성을 감안할 때, 가장 간단한 행동에도 영향을 미칠 수있는 수많은 내부 상태와 외부 자극을 감안할 때, 단일 시험 해상도로 신호를 기록하면 연구원이 이를 극복하는 데 필요한 도구를 갖추게됩니다. 제한.
섬유 광도계는 다른 생체 내 기록 기술과 비교하여 상대적으로 단순성, 높은 신호 대 잡음 비율 및 다양한 기록 능력 으로 인해 시스템 신경 과학 분야의 많은 연구자들이 선택하는 기술이 되었습니다. 행동 패러다임1,2,3,4,5,6,7,8. 기존의 전기 생리학적 방법과 는 달리, 광도측정은 ....
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프로토콜
모든 실험은 캘리포니아 대학, 샌디에고, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 캐나다 가이드의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었으며 라발 대학 동물 보호대학의 승인을 받았습니다. 위원회.
1. CMOS (보완 금속 산화물 반도체) 카메라와 개별 또는 분기 패치 코드 사이의 광학 경로 정렬
- 5축 변환기의 모든 나사를 느슨하게 합니다(11, 그림 2B).
- 5축 변환기에 부착된 어댑터[SMA(서브 미니어처 A) 또는 FC(광섬유 커넥터)]에 패치 코드(12, 도 2B)의나사.
- 저전력(100 μW)에서 470 nm 여기 등(1, 그림 2B)을켜고 패치코드 끝을 오토형광 플라스틱 슬라이드를 가리킵니다. 이것은 향후 레코딩에 아무런 영향을 미치지 않지만 정렬 프로세스를 시각화하기 위한 것입니다.
- 라이브 모드에서 CMOS 카메라(13, 그림 2B)에서녹화합니다. 이미지가 완전히 검은색이 아닐 때까지 게인....
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결과
행동 반응의 신경 상관 관계는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이 예에서는, 우리는 외측 하베눌라(LHb)에서 종결되는 측면 시상하부 영역(LHA)으로부터 축삭 말단의 활성을 측정하기 위해 생체 내 섬유 광측측정을 사용했다. 야생형 마우스는 LHA에서 GCaMP6s(AAV-hSyn-GCaMP6s)를 인코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 주입하고 광섬유를 LHb 바로 위에 팁으로 이식하였다(도4A). GCaMP6s 발현은 칼슘 신호가 기록될 수 있는 LHb에 투사되는 LHA 및 그들의 축세포 말단의 세포체에서 발견됩니다. LHA-LHb 경로의 활성화는 실시간 선호도 테스트에서 수동 회피를 촉진하여 이러한 경로가비역신호(16)를전송한다는 것을 시사한다. 마우스는 섬유 광도 계량 계에 연결하여 6분 동안 열린 경기장에 놓고 60초마다 1초의 에어퍼프에 노출시켰다. 측정된 형광은 에어퍼프의 투여와.......
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토론
섬유 광도계는 연구원이 자유롭게 움직이는 동물에 있는 정의된 신경 인구에서 벌크 칼슘 역학을 기록할 수 있는 접근접근접근입니다. 이 방법은 강제 수영 테스트2,공포 조절18,사회적 상호 작용1,4및 기타7과같은 "운동 무거운"작업을 포함하여 다양한 행동 테스트와 결합 될 수있습니다. 8,19,20. 이것은 연구원이 특정 신경 인구에 있는 어떤 행동 또는 자극 드라이브 활동을 관찰하는 것을 허용합니다 또는 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
그것의 프리마 fac.......
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공개 사항
세이지 아론슨은 멀티 파이버 광도 계량 시스템을 판매하는 Neurophotometrics Ltd.의 CEO 겸 설립자입니다.
감사의 글
이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC : RGPIN-2017-06131)에서 C.P. C. C. P.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 FRSQ 체르쉐르 부르시에입니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 사용된 바이러스 성 벡터의 생산을 위한 Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom)에게 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 1" 길이 | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 1/2" 길이 | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 3/8" 길이 | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µ m, 0.50 NA, SMA-SMA 파이버 패치 케이블 | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm 광학 포스트 | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm 받침대 포스트 홀더 | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A 전원 공급 장치(3.5mm 잭 커넥터 포함) | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x 대물렌즈 | Thorlabs | RMS20X | #10(그림 2), #11(그림 5) |
| 이색성 필터가 있는 30mm 케이지 큐브 그림 | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9, 그림 5의 #8-10 |
| 405nm LED | Doric 렌즈 | CLED_405 | #2(그림 2) |
| 410nm 대역통과 필터 | Thorlabs | FB410-10 | #5(그림 2), #7(그림 5 |
| 465nm) LED | Doric 렌즈 | CLED_465 | #1(그림 2) |
| 470nm 대역통과 필터 | Thorlabs | FB470-10 | #4(그림 2), #6(그림 5 |
| 560nm 대역통과 필터 | Semrock | FF01-560/14-25 | #5(그림 5) |
| 560nm LED | Doric Lenses | CLED_560#1(그림 3), | |
| 5축 kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11(그림 2), #12(그림 5 |
| 무채색 이중선 | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7(그림 2) |
| 405 콜리메이터용 어댑터 | Thorlabs | AD11F | #3(그림 2), #4(그림 5 |
| 조정 가능한 콜리메이터용 어댑터 | Thorlabs | AD127-F | #3(그림 2), #4(그림 5 |
| 알루미늄 브레드보드 | , Thorlabs | MB1824 | |
| 클램핑 포크 | Thorlabs | CF125 | |
| 큐브 커넥터 | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in |
| 그림 5 GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 |
| 검은색 하드보드 패널이 있는 인클로저 | Thorlabs | XE25C9 | |
| 외부 SM1 스레드 엔드 캡 | Thorlabs 가공용 | ||
| 빠르게 변경되는 SM1 렌즈 튜브 필터 홀더 | Thorlabs | SM1QP | #4-6(그림 2), #5-7 in |
| 405 nm 광용 고정 콜리메이터 | Thorlabs | F671SMA-405 | #3(그림 2); #4 in 그림 5 |
| 470 및 560 nm 광용 고정 콜리메이터 | Thorlabs | F240SMA-532 | #3(그림 2); #4 in 그림 5 |
| 녹색 방출 필터 | Semrock | FF01-520/ 35-25 | In 광 빔 스플리터 |
| 고해상도 USB 3.0 CMOS 카메라 | Thorlabs | DCC3260M | #13(그림 2), #15(그림 5) |
| 광선 분배기 | Neurophotometrics | SPLIT# | 14(그림 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8(그림 2), #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | 그림 2의 FF495-Di03 | #9, 그림 5의 #8 |
| Metabond 치과용 시멘트 | C& B | ||
| M8 - M8 케이블 | Doric 렌즈 | Cable_M8-M8 | |
| 광섬유 캐뉼러 | Doric 렌즈 | 낮은 자가 형광이 필요한 측광 실험에 사용된다는 것을 지정해야 | |
| . 광섬유 패치코드 | Doric 렌즈 | 낮은 자가형광을 필요로 하는 측광 실험에 사용된다는 것을 지정해야 합니다. 적색 방출 필터를 필요로 하는 측광 실험에 사용되도록 지정해야 합니다. | |
| Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter | |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED 드라이버 | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O 케이블, Hirose 25, DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
참고문헌
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of th....
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재인쇄 및 허가
