The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.
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이 논문에서
요약
초록
세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 있는 세포를 위한 주요 지원으로 작동하는 3차원 비계입니다. 구조적 기능 외에도 ECM은 세포 이동, 증식 및 분화에도 참여합니다. 섬유아세포는 ECM 섬유 배열 및 생산을 변형시키는 세포의 주요 유형이다. 암에서, CAFs (암 관련 섬유아세포)는 영구적인 활성화 상태에, ECM 개조에 참여하고, 종양 세포 이동을 촉진하고, 종양 관련 혈관신생을 자극, 그밖 pro-tumorigenic 역할 중. 이 방법의 목적은 불멸의 섬유아세포 또는 인간 1차 CAF를 사용하여 생체 내 매트릭스와 유사한 섬유 조성물을 가진 3차원 매트릭스를 만드는 것이다. 섬유아세포는 전처리된 세포 배양 판에서 배양되고 아스코르브산 자극 하에 재배된다. 그런 다음 섬유 아세포를 제거하고 행렬은 추가 세포 파종을 위해 차단됩니다. 이 ECM 모델에서 섬유아세포는 활성화되거나 변형되어 세포 배양에서 효과를 연구할 수 있는 다양한 종류의 매트릭스를 생성할 수 있습니다. 3D 행렬은 또한 섬유 분포를 수정할 수 있는 분해 또는 가교 효소와 같은 세포 신호에 의해 형성됩니다. 이 맥락에서, 혈관 신생은 상피 종양 세포와 같은 그밖 세포 모형과 더불어 공부될 수 있습니다.
서론
세포외 매트릭스 (ECM)는 조직의 모든 모형에서 존재하는 동적 구조물입니다. 그것은 세포 부착, 이동 및통신1에중요한 섬유의 그물을 만드는 단백질과 다당류로 구성되어 있습니다. ECM 조성물은 조직에 따라 다릅니다. 타입-I 콜라겐이 가장 널리 퍼진 구조 단백질이지만, 콜라겐 유형 II, III, V 및 XI는 또한 다양한 조직에서 발견될 수 있다2. 섬유아세포에 의해 생성된 섬유넥틴은 세포 부착에 필요하다2. 더욱이, 엘라스틴, 라미닌 및 표면 수용체와 같은 다른 구조 적 분자가 섬유 조립을 중재하고 상이한 ECM 조직에 특이적인 인테그린(integrins)이라고 불린다2. ECM은 세포 스캐폴드로서 중요한 역할을 하며 또한 생리적 및 병리학적 과정 둘 다에 관여할 수있다 1. ECM에 있는 이상은 ECM 조성 및/또는 그것의 조직을 바꾸는 암과 같은 병리에서 관찰됩니다. 종양에서, ECM은 종양 미세환경(TME)의 비세포 성분을 나타내며, 섬유아세포, 면역 세포, 내피 세포, 침구 및 다양한 수용성 인자와 같은 세포 성분의 복잡한 밀리유이다. TME는 암 진행및 전이를 촉진하....
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프로토콜
인간 조직 샘플은 마드리드 라몬 y 카잘 병원의 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 수 득하였다.
1. 솔루션 준비
- 0.2% 젤라틴 용액 을 준비하십시오 : 500 mL의 PBS에 젤라틴 1 g을 추가하십시오. 용액을 오토클레이브하고 4 °C에서 유지하십시오. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.
- 1% 글루타랄데히드 준비: 25% 글루타랄데히드 스톡 용액 1mL을 PBS 24 mL에 추가합니다. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.
- 1 M 에탄놀라민 준비: 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 멸균 H2O. 필터로 에탄올라민 용액을 준비하십시오.
참고: 에탄 올라민에는 보안 캡이 제공되기 때문에 바늘과 주사기가 필요합니다. - 아스코르브산 준비: 배지 100 mL에 0.1 mL의 50 mg/mL 스톡 용액 아스코르브산(빛에 민감한)을 추가합니다.
- 라시스 버퍼 준비: NH4OH의 20 nM으로 PBS 0.5% 트리톤 100X를 준비한다. 사용하기 직전에 NH4OH를 추가하십시오.
- PBS 펜/스트렙 준비: 펜/스트렙 스톡 용액을 100 U/mL ....
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결과
PDGF-BB 자극 섬유아세포는 두꺼운 ECM을 생성한다. 헤레라 외. PDGF 자극 섬유 아세포는 두꺼운 매트릭스뿐만 아니라 높은 섬유 방향을 생성하는 방법을 보여주었다 7. BJ-hTERT 섬유아세포는 PDGF 유무에 관계없이 배양되었고 관찰된 대표적인 영역은 PDGF 자극 섬유아세포에 의해 생성된 매트릭스에서 보다 정렬된 세포 분포를보였다(도 1a). 콜라겐 I 및 피브로넥틴 단백질 발현은 PDGF 자극 섬유아세포로부터 유래된 매트릭스에서 증가하였고(도1b)및, 결과적으로, 매트릭스 두께가 증가하였다(도1c). 더욱이, 콜라겐 I 및 피브로넥틴은 방향성 히스토그램(도
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토론
매트릭스는 불멸의 섬유아세포 또는 1차 섬유아세포 배양물로 생성될 수 있다. 섬유아세포는 높은 성장속도 및 응력 저항을 가진 시험관 내 배양에서 유지하기 쉽다. 그(것)들은 또한 사후 조직3에서격리될 수 있습니다, 오염은 조직 기원에 따라서 제한될 수 있더라도.
여기서 3D 매트릭스 모델은 ECM 조성 및 섬유 배향을 성공적으로 연구할 수 있는 참신하고 효과적인 시스템을 제공합니다. 또한 섬유아세포 활성화 상태, 유전자/단백질 발현, 다른 세포 유형과의 상호 작용 등의 분석에적합합니다. 환자에게서 섬유아세포로 생성된 행렬이 종양에 있는 기질 관련 기계장치의 개인화한 연구 결과 가능하게 한다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 이 접근은 ECM가 중요한 역할이 있는 화학 저항의 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이 유형의 연구의 번역은 임상 실습에서 환자의 치료를위한 의사 결정에 도움이 될 수 있으며 개인화 된 의학을 구현할 수.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로토콜의 개발은 PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 및 Rd12/0036/0041에 의해 지원되었다. 폰도 유럽 데 사롤로 지역 (FEDER); 에 의해 "CIBER 드 칸서", CB16/12/00273 및 CB16/12/00446, 인스티투토 드 살루드 카를로스 III-FEDER에서; 그리고 Fundación Científica AECC에 의해 (췌장암을 표적으로 하는 다각적인 접근). 크리스티나 페냐는 살루드 카를로스 III의 미겔 서브트 계약을 수령한 사람입니다. M. Eaude는 영어 텍스트를 도왔습니다. 우리는이 연구를 통해 도움과 조언을 실험실 회원에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수산화암모늄(NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| 암포테리신-B | 코닝 | 30-003-CF | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마 | A7906-50G | |
| 둘베코의 변성 이글 배지(DMEM) | 코닝 | 10-014-CVR | |
| 내피 기저 배지(EBM) | Lonza | CC-3121 | 사용 전 보충제 추가 |
| 피 세포 기초 배지 보충제 (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| 에탄올아민 | 시그마 | 411000-100ML | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Biowest | S181B-500 | 사용 전 열 비활성화 |
| 섬유아세포 성장 기초 배지 (FBM) | Lonza | CC-3131 | 사용 |
| 전 보충제 추가섬유아세포 성장 매체 보충제 및 성장 인자(FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| 소 껍질의 젤라틴 | Sigma | G9391-100G | |
| 글루타르알데히드 | Sigma | g5882 | |
| L-아스코르브산 | Sigma | A92902-100G | 감광성 |
| L-글루타민 | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| 재조합 텔로머라제 형질 주입 불멸화 인간 포피 섬유아세포(BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) | ATCC | PCS-100-013 |
참고문헌
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, comp....
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재인쇄 및 허가
