방법 논문

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

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DOI:

10.3791/60304

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2019년 12월 26일

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1Medical Oncology Department, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), CIBERONC, 2Department of Medical Oncology, Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Universidad Autónoma de Madrid, CIBERONC, 4Department of Oncology & Pathology, Karolinska Institutet

이 논문에서

요약

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

초록

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 있는 세포를 위한 주요 지원으로 작동하는 3차원 비계입니다. 구조적 기능 외에도 ECM은 세포 이동, 증식 및 분화에도 참여합니다. 섬유아세포는 ECM 섬유 배열 및 생산을 변형시키는 세포의 주요 유형이다. 암에서, CAFs (암 관련 섬유아세포)는 영구적인 활성화 상태에, ECM 개조에 참여하고, 종양 세포 이동을 촉진하고, 종양 관련 혈관신생을 자극, 그밖 pro-tumorigenic 역할 중. 이 방법의 목적은 불멸의 섬유아세포 또는 인간 1차 CAF를 사용하여 생체 내 매트릭스와 유사한 섬유 조성물을 가진 3차원 매트릭스를 만드는 것이다. 섬유아세포는 전처리된 세포 배양 판에서 배양되고 아스코르브산 자극 하에 재배된다. 그런 다음 섬유 아세포를 제거하고 행렬은 추가 세포 파종을 위해 차단됩니다. 이 ECM 모델에서 섬유아세포는 활성화되거나 변형되어 세포 배양에서 효과를 연구할 수 있는 다양한 종류의 매트릭스를 생성할 수 있습니다. 3D 행렬은 또한 섬유 분포를 수정할 수 있는 분해 또는 가교 효소와 같은 세포 신호에 의해 형성됩니다. 이 맥락에서, 혈관 신생은 상피 종양 세포와 같은 그밖 세포 모형과 더불어 공부될 수 있습니다.

서론

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직의 모든 모형에서 존재하는 동적 구조물입니다. 그것은 세포 부착, 이동 및통신1에중요한 섬유의 그물을 만드는 단백질과 다당류로 구성되어 있습니다. ECM 조성물은 조직에 따라 다릅니다. 타입-I 콜라겐이 가장 널리 퍼진 구조 단백질이지만, 콜라겐 유형 II, III, V 및 XI는 또한 다양한 조직에서 발견될 수 있다2. 섬유아세포에 의해 생성된 섬유넥틴은 세포 부착에 필요하다2. 더욱이, 엘라스틴, 라미닌 및 표면 수용체와 같은 다른 구조 적 분자가 섬유 조립을 중재하고 상이한 ECM 조직에 특이적인 인테그린(integrins)이라고 불린다2. ECM은 세포 스캐폴드로서 중요한 역할을 하며 또한 생리적 및 병리학적 과정 둘 다에 관여할 수있다 1. ECM에 있는 이상은 ECM 조성 및/또는 그것의 조직을 바꾸는 암과 같은 병리에서 관찰됩니다. 종양에서, ECM은 종양 미세환경(TME)의 비세포 성분을 나타내며, 섬유아세포, 면역 세포, 내피 세포, 침구 및 다양한 수용성 인자와 같은 세포 성분의 복잡한 밀리유이다. TME는 암 진행및 전이를 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 암 관련 섬유아세포는, 종양 기질에 있는 우세한 세포 모형으로, 이프로세스3에서참여합니다. 정상 섬유아세포와 달리, CAF는 영구적으로 활성화되어 ECM 단백질 및 성장 인자(예를 들어, 성장 인자-β, TGF-β 변형)의 증가된 분비를 나타내고, α-평활근 액틴(α-SMA) 및섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 같은 일부 마커의 더 높은 발현을 나타낸다. 그러나, CAF는 이기종 세포 집단이며, 활성화 또는 마커 발현의 상이한 수준을 나타내는5. 섬유아세포 유래 행렬의 조성 및 구조가 섬유아세포 상태 및 특성에 따라 달라질 것이라고 가정할 수 있다.

이러한 맥락에서, 이러한 방법론의 목적은 생체 내 ECM 설정에 상응하는 섬유아세포에 의해 ECM 생성을 위한 적절한 시험관내 모델을 확립하는 것이다. 우리는 ECM에 의해 중재된 화학 저항 또는 이동 같이 종양 세포 기능의 추가 연구 결과를 위한 시험관 내 번역 방법론으로 이 접근을 제안합니다. 우리 그룹이 다른 곳에서 발표했듯이, CAF는 신선한 조직 샘플로부터 얻을 수 있지만, 배양에서의 CAF의 생존이 제한적이며 세포 통로 수가6으로감소한다는 점에 유의해야 한다. 또한, 환자의 샘플로부터 확립된 CAF 1차 배양은 매트릭스 생성을 위해 사용될 수 있다. 섬유아세포에서 유전자 발현의 조작은 또한 매트릭스 조성, 섬유 배향 등에 대한 가능한 효과를 평가하기 위해 다양한 시험관내 행렬을 생성하는 흥미로운 방법이다. 이러한 라인을 따라, 우리 그룹은 최근 다양한 유래 행렬의 조성 및 섬유 배향에서 달팽이 발현 섬유아세포의 역할을 보고했다7.

더욱이, CAF 및 ECM은 혈관 생성 및 꽃병 외층8의일부로서 모두 혈관 시스템에 관여한다. ECM 리모델링은 혈관 신생을 유도; 매트릭스 금속 단백질화효소(MmPs)는 이 과정에 기여하는 가장 중요한 효소 유형인 것 같다9,10. ECM, ECM 거대분자, ECM에 포함된 잔류 성장 인자, 매트릭스 탄성, 및 매트릭스 두께를 생성하는 1차 세포의 조직 혈관화는 내피 세포 활성화에 관여하는 인자로 설명된다11. 종양에서 저산소증은 ECM 강성과 내피 새싹 생성 을 증가시킵니다12. 더욱이, CAFs는 종양기질에서혈관신생을 자극하는 혈관내피성장인자(VEGF) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 분비한다. 이 분야에서, 시험관내 매트릭스 생성은 상이한 실험 조건 하에서 혈관신생 과정 또는 MMP 작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 따라서, 생체외 에서 가장 유사한 생체외 재생은 혈관신생 또는 미세 환경 세포 상호작용에서 ECM의 역할을 조사하는 귀중한 도구가 될 수 있다.

매트릭스 증착을 강화하고 ECM을 생성하기 위해 아스코르브산을 가진 배양 된 섬유 아세포의 자극은 생체 내 매트릭스에서 유사한 생산 방법. 불멸화된 섬유아세포는 쉽게 배양되고 PDGF-BB, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 또는 TGF-β14와같은 다양한 성장 인자에 의해 활성화된다. TME 내에서, CAFs는 ECM4의주요 성분으로 타입-I 콜라겐과 피브로넥틴을 합성합니다. 유사하게, 이들 성분은 시험관내에서 생성된 섬유아세포 유래 행렬의 주요 성분으로서 발견된다(도1).

생체 외 내 방법론은 생체 내 ECM에서 시뮬레이션하기 위해 상이한 생체 내 방법론이 있다. ECM 섬유의 혼합물을 가진 코팅된 배양 요리의 사용은 지난 몇 년 동안 연장되었지만, 이러한 2D 접근법은 가교 겔(예를 들어, 마트리겔)과 같은 3D 구조에 대한 개선이필요했다 1. Matrigel과 같은 설정은 3D 행렬을 시뮬레이션하는 표준 방법이 되었습니다. 피브린은 또한 행렬을 생성할 때 대안이지만 ECM1의강도와 내구성면에서 실패합니다. 다른 ECM 성분과 함께 사용되는 콜라겐은 전술한 문제 중 일부를 수정한다. 그러나, 이러한 콜라겐 겔은 지향될 수 있는 섬유와 강한 네트워크를 형성하지만, 매우 이질적이며, 이는 실험 반복에 문제가 될 수 있다1. 그럼에도 불구하고, 실험의 목적에 따라, Matrigel 또는 다른 하이드로겔의 사용이 더 적절하다고 가정해야 한다(예를 들어, 겔 수축이 쉽게 검출될 수 있는 매트릭스 수축 연구에서).

생성된 매트릭스의 잠재적면역원성은 일부 세포 유형의 실험에서 문제가 될 수 있다. 따라서, 우리의 방법을 사용할 때 ECM 생성 세포에 의한 면역 반응의 가능성을 줄이기 위해, 세포 단편 제거는 총15일수 없었지만, 행렬은 탈세포화 및 세척된다. 이상적인 ECM은 세포 배양과 호환되고 세포 신호를 통신하고 반응할 수 있어야 합니다. 우리의 절차는 ECM 생산 동안 어려움없이 변화의 도입을 허용 (예를 들어, 섬유 아세포 자극 성장 인자를 추가).

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프로토콜

인간 조직 샘플은 마드리드 라몬 y 카잘 병원의 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 수 득하였다.

1. 솔루션 준비

  1. 0.2% 젤라틴 용액 을 준비하십시오 : 500 mL의 PBS에 젤라틴 1 g을 추가하십시오. 용액을 오토클레이브하고 4 °C에서 유지하십시오. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.
  2. 1% 글루타랄데히드 준비: 25% 글루타랄데히드 스톡 용액 1mL을 PBS 24 mL에 추가합니다. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.
  3. 1 M 에탄놀라민 준비: 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 멸균 H2O. 필터로 에탄올라민 용액을 준비하십시오.
    참고: 에탄 올라민에는 보안 캡이 제공되기 때문에 바늘과 주사기가 필요합니다.
  4. 아스코르브산 준비: 배지 100 mL에 0.1 mL의 50 mg/mL 스톡 용액 아스코르브산(빛에 민감한)을 추가합니다.
  5. 라시스 버퍼 준비: NH4OH의 20 nM으로 PBS 0.5% 트리톤 100X를 준비한다. 사용하기 직전에 NH4OH를 추가하십시오.
  6. PBS 펜/스트렙 준비: 펜/스트렙 스톡 용액을 100 U/mL 펜과 100 μg/mL 스트렙에 희석하십시오.
  7. 10% FBS로 DMEM 준비: DMEM 500mL에 10% FBS를 추가합니다. 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.1 mg/mL 노르모신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B를 보충제.
  8. 준비 2% BSA 열 변성: 멸균 수의 100 mL에 BSA의 2 g을 추가합니다. 끓는 물에 7분간 데우면 됩니다.
  9. 항생제로 FBS를 준비하십시오 : 200 U / mL 페니실린, 200 μg / mL 스트렙토 마이신, 100 μg / mL 젠타미신 및 2.5 g / mL 암포테리신 B로 FBS를 보충하십시오.

2. 세포 배양 준비

  1. 불멸의 섬유아세포 세포주
    1. 배양 재조합 텔로머라아제는 10% FBS로 DMEM에서 불멸화된 인간 포피 섬유아세포(BJ-hTERT, ATCC CRL-4001)를 형질화하고 37°C 및 5%CO2에서유지한다.
  2. 내피 세포
    1. 배양 인간 배양 정맥 내피 세포 (HUVECs, ATCC PCS-100-013)는 2% FBS를 함유하고 37°C 및 5%CO2에서유지한다.
  3. 섬유 아세포 기본 배양
    참고: CAF 설립 및 문화의 경우, 우리 그룹이 이전에 게시 한 프로토콜은6.
    1. 간단히, 약의 작은 조각으로 조직 샘플을 잘라 2-3 mm3 항생제의 높은 농도와 FBS에 씨앗.
    2. 첫 번째 섬유아세포가 나타났을 때, 세포 유지를 위한 FBM 배지로 배지를 대체하십시오.
      참고: 조직 기원에 따라 세포 배양이 쉽게 오염 될 수 있습니다. 오염이 높은 조직(예: 결장6)으로항생제로 보충된 PBS에서 샘플을 세척하고 30-45분 동안 흔들어 주세요.

3. 섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 (카스텔로 크로스와 쿠키에르만16에서적응)

  1. 6웰 플레이트의 각 웰에 0.2% 젤라틴 용액 2 mL를 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 젤라틴을 흡인하고 PBS의 2 mL로 씻습니다.
  3. 2 mL의 1% 글루타랄데히드를 넣고 RT. 글루타랄데히드에서 30분 동안 배양하여 젤라틴을 가교합니다.
  4. 글루타랄데히드를 흡인하고 2 mL의 PBS로 5 분 동안 우물을 씻습니다.
  5. 1 M 에탄올아민 2 mL를 추가하고 RT. 에탄올라민에서 30 분 동안 배양하여 나머지 글루타랄데히드를 차단하는 역할을 합니다.
  6. 에탄올아민을 흡인하고 2 mL의 PBS로 5 분 동안 우물을 씻습니다.
  7. 10% FBS로 1mL의 DMEM을 추가합니다. 배지가 즉시 분홍색으로 변하면 배지를 제거하고 PBS 2 mL로 씻고 10 % FBS로 DMEM 1 mL을 다시 추가하십시오.
  8. 섬유아세포 현탁액의 종자 1 mL, 각 우물에 5 x 105 세포. 각 우물의 총 부피는 2 mL가 될 것입니다.
  9. 100% 합류까지 배양 세포가 도달한다. 그런 다음 배지를 제거하고 50 μg/mL 아스코르브산으로 10% FBS로 DMEM으로 교체하고 사용 시 추가 처리를 하십시오.
  10. 6일 동안 매 2일마다 10% FBS 및 50 μg/mL 아스코르브산으로 배지를 신선한 DMEM으로 대체하십시오.
    참고: 추가 치료가 사용되는 경우 (예를 들어, PDGF-BB, TGF-β 및 / 또는 기타 성장 인자), 아스코르브 산 처리가 추가되는 것과 같은 날을 추가하십시오.
  11. 마지막 아스코르브산 처리 후 2일 후, 배지를 제거하고 PBS의 2 mL로 세척하였다.
  12. 37°C에서 예열된 용해 완충액 1mL를 각 우물에 천천히 추가합니다. 섬유아세포가 용해될 때까지 RT에서 5-10분 동안 배양하십시오(현미경으로 관찰 가능).
  13. 조심스럽게 lysis 버퍼를 제거하지 않고 2 mL의 PBS를 추가하십시오. 그런 다음 약 2.5 mL의 PBS를 흡인합니다. 총 3번의 세번을 두 번 반복합니다.
  14. 결국, PBS의 2.5 mL을 제거하고 펜 / 스트렙 (각각 100 U / mL 및 100 μg / mL)으로 PBS 2 mL을 추가합니다. 필름으로 밀봉하고 최대 3 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.
    참고: 실험에 따라 생성된 행렬의 장기 저장이 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 가능한 한 빨리 매트릭스를 사용하는 것이 좋습니다, 그리고 실험이 세포 파종을 포함하는 경우, 가능한 단백질 저하로 인해. 행렬이 콜라겐 관찰과 같은 구조 적 검사에 사용되는 경우 행렬을 고정하고 더 긴 기간 동안 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 6웰 배양 플레이트에 대해 지시된다. 다른 플레이트를 사용할 수 있지만 반응성 부량과 세포 현탁액 농도는 웰 영역에 따라 재계산되어야 합니다.

4. 튜브 형성 분석

  1. 최대 합류까지 EBM-2 2% FBS에서 HUVEC 세포를 성장.
  2. 8시간 동안 FBS없이 매체를 EBM-2로 교체하십시오.
  3. 셀을 파종하기 전에 행렬을 준비합니다.
    1. 냉장고에서 매트릭스를 제거하고 RT에서 1 시간 동안 놓습니다.
    2. 2 mL의 열 변성 2% BSA를 추가하여 행렬을 차단합니다. 37 °C에서 1 시간 배양.
    3. 흡인 BSA및 PBS의 2 mL에서 세척.
  4. 종자 2 x 105 HUVEC 세포를 FBS 고갈 배지에서 이전에 3D 섬유아세포 유래 매트릭스로 코팅한 6웰 플레이트의 각 웰에.
  5. 16 시간 동안 37 °C에서 내피 세포를 배양하십시오.
  6. 20-40x 배율로 표준 밝은 필드 현미경하에서 튜브 와 같은 구조 형성을 검사합니다.

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결과

PDGF-BB 자극 섬유아세포는 두꺼운 ECM을 생성한다. 헤레라 외. PDGF 자극 섬유 아세포는 두꺼운 매트릭스뿐만 아니라 높은 섬유 방향을 생성하는 방법을 보여주었다 7. BJ-hTERT 섬유아세포는 PDGF 유무에 관계없이 배양되었고 관찰된 대표적인 영역은 PDGF 자극 섬유아세포에 의해 생성된 매트릭스에서 보다 정렬된 세포 분포를보였다(도 1a). 콜라겐 I 및 피브로넥틴 단백질 발현은 PDGF 자극 섬유아세포로부터 유래된 매트릭스에서 증가하였고(도1b)및, 결과적으로, 매트릭스 두께가 증가하였다(도1c). 더욱이, 콜라겐 I 및 피브로넥틴은 방향성 히스토그램(도

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토론

매트릭스는 불멸의 섬유아세포 또는 1차 섬유아세포 배양물로 생성될 수 있다. 섬유아세포는 높은 성장속도 및 응력 저항을 가진 시험관 내 배양에서 유지하기 쉽다. 그(것)들은 또한 사후 조직3에서격리될 수 있습니다, 오염은 조직 기원에 따라서 제한될 수 있더라도.

여기서 3D 매트릭스 모델은 ECM 조성 및 섬유 배향을 성공적으로 연구할 수 있는 참신하고 효과적인 시스템을 제공합니다. 또한 섬유아세포 활성화 상태, 유전자/단백질 발현, 다른 세포 유형과의 상호 작용 등의 분석에적합합니다. 환자에게서 섬유아세포로 생성된 행렬이 종양에 있는 기질 관련 기계장치의 개인화한 연구 결과 가능하게 한다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 이 접근은 ECM가 중요한 역할이 있는 화학 저항의 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이 유형의 연구의 번역은 임상 실습에서 환자의 치료를위한 의사 결정에 도움이 될 수 있으며 개인화 된 의학을 구현할 수...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 프로토콜의 개발은 PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 및 Rd12/0036/0041에 의해 지원되었다. 폰도 유럽 데 사롤로 지역 (FEDER); 에 의해 "CIBER 드 칸서", CB16/12/00273 및 CB16/12/00446, 인스티투토 드 살루드 카를로스 III-FEDER에서; 그리고 Fundación Científica AECC에 의해 (췌장암을 표적으로 하는 다각적인 접근). 크리스티나 페냐는 살루드 카를로스 III의 미겔 서브트 계약을 수령한 사람입니다. M. Eaude는 영어 텍스트를 도왔습니다. 우리는이 연구를 통해 도움과 조언을 실험실 회원에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
수산화암모늄(NH4OH)RothA990.1
암포테리신-B코닝30-003-CF
소 혈청 알부민(BSA)시그마A7906-50G
둘베코의 변성 이글 배지(DMEM)코닝10-014-CVR
내피 기저 배지(EBM)LonzaCC-3121사용 전 보충제 추가
피 세포 기초 배지 보충제 (EGM-2)LonzaCC-4176
에탄올아민시그마411000-100ML
소 태아 혈청 (FBS)BiowestS181B-500사용 전 열 비활성화
섬유아세포 성장 기초 배지 (FBM)LonzaCC-3131사용
전 보충제 추가섬유아세포 성장 매체 보충제 및 성장 인자(FGM-2)LonzaCC-4126
소 껍질의 젤라틴SigmaG9391-100G
글루타르알데히드Sigmag5882
L-아스코르브산SigmaA92902-100G감광성
L-글루타민LonzaBE17-605E
NormocinInvivogen3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CVR
Triton X100Roth3051
재조합 텔로머라제 형질 주입 불멸화 인간 포피 섬유아세포(BJ-hTERT)ATCCATCC CRL-4001
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)ATCCPCS-100-013
내

참고문헌

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