방법 논문

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60314

⸱

2020년 2월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

초록

전이성 명확한 세포 신장 세포 암 (ccRCC)는 신장암의 일반적인 특수형입니다. 국한 된 ccRCC는 유리한 수술 결과를 가지고 있습니다. 그러나, ccRCC 환자의 1/3은 환자를 위한 아주 나쁜 결과와 관련있는 폐에 전이를 개발할 것입니다. 불행히도, 전이의 분자 기전이 알려지지 않기 때문에 이 치명적인 단계에는 치료법이 없습니다. 폰 히펠-린다우(VHL) 종양 억제 유전자의 기능 상실이 ccRCC의 병리학적인 것으로 25년 동안 알려져 왔다. 그러나, ccRCC의 임상적으로 관련있는 형질전환 마우스 모델은 생성되지 않았다. 이 프로토콜의 목적은 전이성 ccRCC에 대해 새로 설립된 두 개의 동물 모델을 소개하고 비교하는 것입니다. 첫 번째는 마우스 모델의 신장 이식입니다. 우리의 실험실에서, CRISPR 유전자 편집 시스템은 몇몇 RCC 세포주에서 VHL 유전자를 노크하기 위하여 이용되었습니다. 신장 캡슐에 이질적인 ccRCC 인구의 정형외 이식은 면역 적격 마우스에서 강력한 폐 전이를 개발하는 새로운 ccRCC 모델을 만들었습니다. 두 번째 모델은 닭 융모알구막 (CAM) 시스템입니다. 마우스 모델에 비해 이 모델은 더 많은 시간, 노동 및 비용 효율적입니다. 이 모형은 또한 강력한 종양 대형 및 intravasation를 지원했습니다. CAM에서 종양 성장의 짧은 10 일 기간 으로 인해, 수집 된 배아 조직에서 면역 조직 화학 (IHC)에 의해 더 과도한 전이가 관찰되지 않았다. 그러나, 부화된 닭에서 종양 성장이 2주 연장되었을 때, 미세전이성 ccRCC 병변은 폐에서 IHC에 의해 관찰되었다. 이 2개의 새로운 전임상 모형은 전이성 ccRCC를 위한 새로운 처리의 발달을 향해 새로운, 환자 파생된 이종이식 (PDXs)를 확립하기 위하여 전이의 뒤에 분자 기계장치를 추가연구하기 위하여 유용할 것입니다.

서론

신장 세포 암 (RCC)는 미국에서 7번째로 가장 흔한 암입니다. 매년, 74,000명의 미국인은 14,000명 이상의 죽음을 차지하는 새로 진단될 것으로 추정됩니다 (명확한 세포 조직학 특수형, 또는 ccRCC는, RCC 케이스의 대략 80%를 차지하는 일반적인 특수형입니다. 국소화 된 악성 종양 환자는 신장 절제술로 치료되며 73 %1의유리한 5 년 생존율을 가지고 있습니다. 그러나, 환자의 25%-30%는 폐와 같은 중요한 기관에 먼 전이를 개발하고, 13 개월의 가난한 평균 생존율과 11 %1,2,3의5 년 생존율을 초래합니다. 전이성 ccRCC에 대한 치명적인 결과를 개선하기 위해서는 전이성 메커니즘에 대한 추가 이해가 필요합니다.

VHL 종양 억제유전자의 손실은 대부분의 인간 ccRCC케이스4, 5,6,7에서관찰되는 특징적인 유전병변이다. 그러나, ccRCC에 있는 VHL 손실의 정확한 oncogenic 기계장치는 불명합니다. 또한 VHL 발현 상태는 ccRCC8에서결과를 예측하지 않습니다. 특히, 신장 상피 표적 VHL 녹아웃에 있는 수많은 시도에도 불구하고, 과학자는 PTEN 과 p5310와같은 그밖 종양 억제제의 삭제와 결합되더라도 마우스9에서관찰된 preneoplastic 낭포성 병변을 넘어 신장 이상을 생성하는 것을 실패했습니다. 이 사실 인정은 혼자 VHL 손실이 종양 발생 또는 후속 자발적인 전이를 위해 불충분하다는 아이디어를 지원합니다.

최근, 우리 연구소는 뮤린 VHL+ ccRCC 세포주(RENCA, 또는 VHL-WT)에서 VHL 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 결실을 이용한 새로운 VHL 녹아웃(VHL-KO) 세포주11,12를생성하였다. 우리는 VHL-KO가 중간엽일 뿐만 아니라 VHL-WT세포(12)의중간엽 전이(EMT)에 상피를 촉진한다는 것을 보여주었다. EMT는 전이성프로세스(13)에서중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 우리의 일은 더 멀리 폐 전이는 신장에 있는 VHL-KO 와 VHL-WT 세포의 공동 이식으로만 발생한다는 것을 보여주었습니다, 전이의 협력 기계장치를 지원하. 중요한 것은, 우리의 정형 간 이식 VHL-KO 및 VHL-WT 모델은 강력한 폐 전이를 유도, 임상 ccRCC 케이스를 재입증. 이러한 자발적전이성 전이성 ccRCC 모델은 특히 새로운 항 전이약물의 개발에서 형질전환마우스 모델의 부족을 보상한다. 이 프로토콜은 유전자 조작 RENCA 세포의 이기종 세포 집단의 신장 캡슐 이식을 보여줍니다.

치킨 CAM 모델은표 114, 15,16,17,18에요약된 바와 같이 그들의 수많은 이점으로 인해 혈관신생 및 종양 생물학에 대한 연구에서 오랜 역사를 가지고 있다. 간략하게, CAM 종양 성장을 위한 시간 창은 짧고,닭(16)의부화 시 CAM이 파괴될 때까지 최대 11일을 허용한다. 짧은 성장 시간에도 불구하고, 닭 배아의 풍부한 영양 공급 및 면역 결핍 상태는 매우 효율적인 종양 생착16,19,20,21을가능하게 한다. 마지막으로, 각 수정란의 비용은 SCID 마우스의 경우 $100 이상과 비교하여 ~$1입니다. 함께, CAM 모델은 마우스에 비해 시간과 비용을 크게 절약에 새로운 PDX를 확립에 가치있는 대체 동물 모델역할을 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 모델이 마우스 정형외 모델에서 관찰된 전이성 ccRCC의 생물학을 재현할 수 있었는지 여부를 평가했다.

(SCID) 마우스캠참고
비용>$100 각~ $ 1 각50-75%에 이르는 생존율
배리어 하우징의 필요성예아니요추가 비용 절감 및 종양의 직렬 모니터링 단순화
직접 보이는 종양아니요예그림 3A
첫 번째 생착에 시간 (RENCA)2주일2-4 일참조 14, 15
성장의 종점 (RENCA)3-6주일10일참조 14, 15
전이 (RENCA) 관찰예예 에 병아리그림 3D
직렬 구절예예참조 16-18
마우스로 통로 (RENCA)예예Hu, J., 외. 검토 중 (2019)
종양 이질성 유지예예Hu, J., 외. 검토 중 (2019)

표 1: 마우스 및 CAM 모델의 장점과 제한 사항. 이 표는 필요한 시간, 비용, 노동 및 생물학의 측면에서 장점과 한계에 대한 두 모델을 비교합니다. CAM 모델은 효율성에 장점이 있지만 조류와 포유류 간의 다른 형태로 인해 고유 한 한계가 있습니다. 따라서 모델이 이종이식의 생물학을 유지할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 UCLA 총리의 동물 연구 위원회(ARC)(ARC 2002-049-53 및 ARC 2017-102-01A)로 지정된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다. 2002-049-53 프로토콜은 누드 또는 BALB/c 마우스의 신장 캡슐내로 ccRCC 종양 세포를 이식하는 데 최적화되어 있다. 부화하기 전에 수정된 닭 알에서종양 이식 실험은 IACUC 승인을 필요로 하지 않는다. 폐 전이의 설립 시간을 연장하기 위해 CAM 종양이있는 배아는 부화하고 닭으로 자랄 수 있습니다. 2017-102-01A 프로토콜은 이러한 동물 실험을 다룹니다.

1. 마우스에 있는 정형외 종양 연구 결과

참고: 이 실험의 타임라인은 그림 1A에표시됩니다. 이러한 절차는 이전 간행물11,12에서적용되었습니다.

  1. 접목을 위한 단일 셀 현탁액 준비
    1. 트립신/EDTA를 사용하여 배양 요리에서 RENCA VHL-WT 및 VHL-KO 세포를 분리합니다.
    2. 혈세포계로 세포를 계산하고 1 x 105 세포 / μL의 농도에서 PBS 및 세포 외 매트릭스 용액의 미리 냉각 된 1 : 1 혼합물에서 다시 중단하십시오.
      참고: 이질적인 임플란트에는 VHL-WT:VHL-KO 세포의 1:4 비율을 사용하고 균일한 임플란트에는 VHL-WT만 사용하십시오.
    3. 다시 매달린 세포를 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 이식될 때까지 얼음을 유지합니다.
  2. 신장 캡슐에 이식
    1. 마취: 따뜻한 패드를 37°C로 예열하고 두꺼운 멸균 드레이프로 덮습니다. 유도 챔버 또는 복강 내 (IP) 1% 펜토바르비탈 나트륨을 10 mL/kg의 투여량으로 주입하여 마우스를 마취시.
    2. 수술 부위에서 머리카락을 면도하십시오. 이 단계는 누드 마우스에 대해 건너뛸 수 있습니다.
    3. 소독 및 수술 드레이프: 마우스 뒷면을 포비동 요오드 3x로 완전히 소독한 다음 70% 에탄올 1x를 소독하고 멸균 면봉으로 건조시닦습니다. 그런 다음 세 개의 멸균 의료 용 드레싱을 순차적으로 적용하여 수술 장을 만들고 마우스를 고정시키기 위해 뒤쪽 전체를 덮습니다.
    4. 절개 및 신장 외장: 수술 전에 작업자의 손가락을 포비도 요오드로 소독하거나 멸균 장갑을 사용하십시오. 마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 손가락을 사용하여 왼쪽 측면 바로 아래 왼쪽 신장을 찾습니다. 무딘 집게와 가위를 사용하여 피부를 열고 지정된 위치 아래근육 층을 잘라냅니다. 멸균 면봉과 집게를 사용하여 왼쪽 신장을 복부에서 부분적으로 외부화하십시오.
    5. 종양 세포 이식: 인슐린 주사기 또는 맞춤형 해밀턴 주사기에서 1.1단계에서 제조된 세포 현탁액을 로드합니다(사양에 대한 재료 표 참조). 신장 캡슐 아래에 20 μL의 재부유 세포를 주입하십시오.
      참고 : 성공적인 주사는 신장 표면에 반투명 한 팽창의 형성에 의해 결정됩니다. 신장 실치종에 우발적인 주사는 주사 부위에 치명적인 출혈로 인해 출혈과 수술 후 사망률이 90 %로 높아지습니다.
    6. 세포외 매트릭스 용액이 고형화되고 출혈이나 종양 세포 누출을 예방하기 위해 바늘을 천천히 당깁니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 신장을 복부로 다시 밀어 넣습니다.
    7. 상처 스티치: 5-0 코팅 된 VICTRYL 봉합사를 사용하여 근육 층을 스티치하십시오. 포비돈 요오드로 피부를 한 번 소독하고 상처 가까스로 피부를 닫습니다.
    8. 복구: 마우스가 깨어날 때까지 따뜻한 패드에 놓습니다. 마우스가 흡입에 의해 마취된 경우, 이소플루란을 철회하고 깨어날 때까지 따뜻한 패드에 마우스를 보관하십시오.
  3. 생물 발광 이미징 (BLI) 및 조직 수집
    1. 종양 이식 후 6 주, 반딧불 - 루시 퍼라제 기반의 BLI 이미지를 가져 가라. 그런 다음 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
    2. 순환 종양 세포 (CTC) 유세포 측정에 의해 검출을위한 혈액을 수집합니다.
    3. 멸균 조직 채취 기술22를이용하여 종양 및 관심 기관(신장, 폐, 간, 내장 및 비장)을 수확한다. 파라핀 왁스 를 포함하기 위해 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.

2. CAM 종양 이종이식 모델

참고: 이러한 절차는 이전에 게시된 프로토콜23,24에서조정 및 수정되었습니다. 이 절차의 타임라인은 그림 1B에표시됩니다. 이 문서에서는 간소화된 프로토콜만 제공합니다. 자세한 프로토콜은 그룹25에의해 게시 된 다른 JoVE 기사를 참조하십시오.

  1. 미리 인큐베이션: 37°C에서 회전하는 계란 인큐베이터에 갓 낳은 수정된 닭고기 계란을 7일 동안 55-65% 습도로 배양합니다.
  2. CAM을 놓고 창을 엽니다 (발달 일 7):
    1. 공기 주머니와 정맥을 찾아 표시합니다.
      참고 : 일반적으로 계란의 10-15 %는 수정되지 않거나 수정 후 7 일 이내에 죽기 때문에 제거됩니다.
    2. 표시된 정맥 위에 새 공기 주머니를 만듭니다.
    3. 새로운 공기 주머니를 묘사하고, 포장 테이프를 적용하고, 계란을 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      참고: 절차는 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 공기 주머니가 움직일 수 있기 때문에 같은 날 에 절차를 재개하는 것이 좋습니다.
    4. 창 열기: 구부러진 미세 제해 가위 한 쌍과 바늘 코 집게 한 쌍을 사용하여 껍질에 1.5 x 1.5 cm 원형 창을 자른다.
      참고 : CAM의 중단은 절단 쉘 조각에 존재하는 혈액과 CAM 조각으로 표시됩니다.
    5. 투명한 의료 용 드레싱으로 구멍을 밀봉하고 37 °C와 55 % - 65 % 습도에서 고정 인큐베이터에 계란을 놓습니다.
      참고: 2.1단계에서와 동일한 계란 인큐베이터를 사용하십시오. 회전을 끄면 고정되도록 합니다.
  3. 건강 검사 (발달 일 9): 죽은 계란을 제거 하 고 종양 세포 이식에 대 한 계란의 나머지 를 무작위로 그룹화.
    참고: 이상적으로, 이 시점에서 생존율은 발달 일 0의 대략 80%입니다.
  4. 종양 세포를 새로 노출된 CAM에 이식(발달일 10일)
    1. 세포외 매트릭스 용액을 미리 냉각된 RPMI 1640의 부피의 두 배로 희석합니다(L-글루타민 사용). RENCA 세포를 분리하고 위의 용액에 다시 일시 중단하여 2 x 104 세포/μL의 농도에 도달합니다.
      참고: 이질적인 임플란트에는 VHL-WT:VHL-KO 세포의 1:1 비율을 사용하고 균일한 이식에는 VHL-WT만 사용하십시오.
    2. 세포 현탁액을 고형화하기 위해 각 세포 혼합물의 100 μL을 200 μL 파이펫 팁에 채우고 15 분 동안 세포 인큐베이터에 놓습니다.
    3. 창을 통해 CAM 표면에 각 계란에 대한 세포 현탁액의 100 μL을 임플란트.
      참고 : 일부 프로토콜은 이식23전에 CAM을 긁는 것이 필요합니다. 이것은 RENCA 세포에 필요하지 않습니다, 그들은 매우 빠르게 성장하기 때문에.
  5. CAM에서 세포를 10 일 동안 성장시키고 2 일마다 사진을 찍습니다.
  6. 종양, 혈액 및 장기를 안락사시키고 수확하십시오.
    1. 발달일 20일(종양의 날 10일)에, 10 mL 주사기로 융모알란토충정맥을 통해 혈액을 채취한다.
    2. 배아를 15분 동안 얼음위에 올려 놓음으로써 안락사시한다.
    3. 종양을 수확하고 계량합니다. 마우스(22)에사용되는 것과 유사한 멸균 조직 채취 기술을 사용하여 폐 및 간을 해부한다.
      참고 : 닭 간은 복강에서 본 첫 번째 장기인 두 개의 엽을 가지고 있습니다. 폐와 혼동하지 마십시오. 닭 폐는 심장과 중격(26)아래에 위치하고 있습니다. 폐의 성공적인 수집은 노출 된 갈비뼈로 확인할 수 있습니다.
    4. 파라핀 왁스 임베딩을 위해 종양과 해부 된 장기를 4 % 파라 포름 알데히드에서 하룻밤 동안 고정하십시오.
  7. 닭을 부화.
    1. 종양 성장의 연장된 기간을 허용하기 위하여는, 21일까지 배양을 계속하고 닭이 37°C 및 적어도 60% 습도에서 부화하게 하십시오.
      참고: 닭은 24시간 동안 21일 이후에 자연스럽게 부화하지만 때로는 스스로 부화하는 데 어려움을 겪습니다. 이 경우, 달걀 껍질을 깨는 것은 몇 가지 도움이됩니다. 닭은 그 후 영양분의 부족으로 죽을 것이기 때문에 24 시간 이내에 부화 과정을 완료하는 것이 중요합니다.
    2. 2 주 동안 동물 시설 (2017-102-01A)에서 닭을 키입니다.
    3. 발달 일 34 (종양 일 24)에, 자궁 경부 탈구 에 이어 이소플루란 흡입으로 병아리를 안락사시.
    4. 마우스(22)에사용되는 것과 유사한 멸균 조직 수확 기술을 사용하여 폐를 해부한다. 그런 다음 파라핀 왁스 임베딩을 위해 밤새 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.

3. 면역화학

참고: 모든 조직 절제 및 H&E 염색은 로스앤젤레스 캘리포니아 대학의 번역 병리학 코어 연구소(TPCL)에 의해 이루어졌습니다.

  1. 65°C에서 20분간 슬라이드를 굽고 자일렌을 사용하여 3배의 탈파를 하고 100% 에탄올에서 물로 연속적으로 수분을 공급합니다.
  2. 25 분 동안 야채 증기선에서 삶은 구연산염 완충액에서 항원을 검색합니다.
  3. 차단을 위해 1% BSA를 적용합니다. 이어서 PBS에서 1:200 희석비로 제조된 1차 항체(anti-VHL, anti-HA, anti-flag)를 적용한다. 4 °C에서 밤새 배양.
  4. TBST (각각 7 분)로 3 x를 세척 한 후, 1 :200 희석에서 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. TBST(각 7분)로 3x세척하고 DAB 시약을 적용한 다음 헤마톡실린 카운터스테인을 적용합니다.

4. 유세포분석

  1. 적혈구 (RBC) 리시온 완충제와 마우스 또는 닭 혈액을 처리 제조 업체의 프로토콜에 따라.
    참고: 닭 RBC는 핵화되고 전방 및 측 산란을 사용하여 유세포 측정에서 쉽게 구별될 수 없기 때문에 CAM 혈액을 분석할 때 충분한 RBC 용해가 특히 중요합니다.
  2. 혈액 용해에 유동 세포 분석을 실행하고 mStrawberry 및 EGFP 발현에 대한 데이터를 분석합니다.
  3. 파편, 죽은 셀 및 비풀린 RBC를 제외한 전방 및 측면 분산을 기반으로 기본 게이트를 설정합니다.
  4. 스테인드되지 않은 샘플과 단일 스테인드 컨트롤을 기반으로 형광 게이트를 설정합니다. VHL-WT, VHL-KO 또는 라벨이 부착되지 않은 RENCA 세포를 단일 염색 대조군 및 얼룩지지 않은 대조군으로 각각 프라이밍된 혈액 용해액을 사용하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

각 실험은 달리 명시되지 않는 한 적어도 3회 이상 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유의는 두 그룹이 있을 때 또는 3개 이상의 그룹이 있을 때 단방향 ANOVA에 의해 쌍을 이루는 학생의 T-시험에 의해 결정되었다. 0.05의 p-값 컷오프는 유의를 확립하는 데 사용되었다.

직교 이식 RENCA 세포는 성공적으로 쥐 신장에 성장, BLI와 H&E 염색에 의해 확인(그림 2A-B). 1차 성장에는 차이가 없었지만, H&E 염색에서 매우 강한 BLI 신호 및 전이성 결절에 의해 나타난 바와 같이, 이질성, 전이성 종양만이 폐에 강력한 전이를 가졌다. 한편, 균일성, 비전이성 종양은 먼 장기로 전이되지 않았다. CTC 카운트는 전이성 종양을...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

상피 악성 종양을 가진 많은 환자를 위해, 중요한 기관에 전이는 사망의 주요 원인입니다. 그러므로, 전이성 질병을 위한 근본적인 기계장치 그리고 치료의 새로운 길을 찾아내기 위하여 필수적입니다. 불행히도, 관련 전이성 ccRCC 동물 모델의 부족이 있다. 큰 부분에서 도전은 수많은 형질전환 신장 상피 표적 VHL 녹아웃 마우스 모델9,10의생성에도 불구하고 마우스에서 ccRCC를 재현할 수 없기 때문이다. 여기서, 우리는 두 동물 시스템에서 이식형 전이성 ccRCC 종양을 확립하는 방법, 즉 마우스와 닭 CAM을 입증한다. 이 사실 인정은 2개의 이질적인 환경에서 종양의 전이성 행동을 유효하게 하고, 따라서 전이의 분자 기계장치를 추가조사하기 위하여 유일한 기회를 제공합니다. 첫 번째 모델에서, 이기종 RENCA 집단은 그들의 신장 캡슐에 정형학적으로 면역 적격 마우스에 이식되었다. 6주 후, 이들 마우스는 만연한 폐 전이를...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 UCLA JCCC 종자 교부금, UCLA 3R 교부금, UCLA CTSI 및 UC TRDRP (LW)에 의해 지원되었습니다. 우리는 크럼프 연구소의 전임상 이미징 시설, TPCL 및 UCLA의 실험실 동물 의학부 (DLAM)에게 실험 방법에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 유세포 측정은 UCLA 존슨 종합 암 센터 (JCCC) 및 에이즈 연구 유동 세포 측정 코어 시설에서 수행되었으며, 국립 보건원에서 지원하는 P30 CA016042 및 5P30 AI028697, JCCC, UCLA 에이즈 연구소, UCLA 의과 대학, UCLA 의학부, UCLA 장관 의학과 UCLA 의학부, UCLA 장관 의학부 통계 컨설팅 및 데이터 분석 서비스는 UCLA CTSI 생물 통계학, 역학 및 연구 디자인 (BERD) 프로그램에 의해 제공되었으며, 이는 NIH / 국립 번역 과학 UCLA CTSI 교부금 번호 UL1TR001881에 의해 지원됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨이 없는 HBSS의 0.25% 트립신, 0.1% EDTACorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max 도구 키트Dremel8050-N/18
항 VHL 항체Abcamab135576
BD Lo-Dose U-100 인슐린 주사기BD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic NeedlesFisher Scientific14-826-5D
DAB 발색 키트Biocare MedicalDB801R
D-Luciferin 반딧불이, 칼륨 염GoldbioLUCK-1G
DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음GibcoLS14190250
DYKDDDDK 태그 단클론 항체(FG4R)eBioscience14-6681-82
에탄올 200 프루프실린더 관리43196-11물에 70% 준비
Fetal Bovine Serum, 적격, USDA 승인 지역Fisher Scientific10-437-028
Fisherbrand 날카로운 해부 가위Fisher Scientific08-940
Fisherbrand 멸균 면봉Fisher Scientific22-456-885
Fisherbrand고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/집게Fisher Scientific12-000-122
FisherbrandPremium 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mLFisher Scientific05-408-129
포름알데히드 졸., 4%, 버퍼링, pH 6.9 (약 10% 포르말린 졸.), 조직학MilliporeSigma1.00496.5000
Hamilton 맞춤형 주사기Hamilton8040825 µ L, 모델 702 SN, 게이지: 30, 포인트 스타일: 4, 각도: 30, 바늘 길이: 17 mm
HA-probe 항체 (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HemocytometerHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitIncubator WarehouseHB1588D
Isothesia (Isoflurane) 솔루션Henry Schein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II In Vivo 이미징 시스템Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane MatrixCorningC354230
Medline 수술 기구 드레이프, 투명 접착제, 24" x 18"Medex 공급MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [소 혈청 알부민] 열 충격 절연MilliporeSigma2910-25GM
페니실린-스트렙토마이신 용해, 100X, 10,000IU 페니실린, 10,000ug/mL 스트렙토마이신Fisher ScientificMT-30-002-CI
펜토바르비탈 나트륨시그마 알드리치57-33-0식염수
과산화효소 아피니에 1% 준비 순수 염소 안티 마우스 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
퍼록시다제 아피니순수 염소 안티 래빗 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
포비돈-요오드 용액 USP, 10%(w/v), 1%(w/v) 사용 가능한 요오드, 실험실용Ricca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 미디엄 (Mod.) 1X, L-글루타민Corning10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted 플레이트, 로우 프로파일Fisher ScientificAB-0700
SHARP 정밀 배리어 팁, P-200, 200 &마이크로용; l, 960 (96개들이 10랙)Thomas Scientific1159M40
배송 테이프, 다목적, 1.89" x 109.4 Yd., 탄색, 6롤 팩Office Depot220717
SutureEthiconJ385H
Tegaderm 투명 드레싱 오리지널 프레임 스타일 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Thermo-Chicken 가열 패드K& H manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 벽(50피트)TygonAACUN017
VHL의 VHL-KOCRISPR/Cas9 매개 녹아웃, 그 후 플래그 태그가 지정된 EGFP 및 반딧불이 루시퍼라제로 렌티비로 라벨링
VHL-WTHA 태그 mStrawberry 형광 단백질 및 반딧불이 루시페라제로
렌티바이러스 라벨링세계 정밀 기기 겸자 IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
상처 자동 클립 키트Braintree scientific, inc.ACS KIT
자일렌(조직학적), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 된

참고문헌

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

VHLCRISPR

관련 논문