여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간화 된 NOD/SCID/IL-2 수용체 γ-chainnull 마우스는 전염병에 대한 기본 및 전임상 연구에서 악용될 수 있는 인간 면역의 일부 특징을 다시 한번 재현합니다. 여기에 설명된 HIV 감염의 역학을 연구하기 위한 인간화된 면역 결핍 마우스의 3가지 모델입니다. 첫 번째는 신생아 마우스에서 CD34+ 조혈 줄기 세포의 간간 주사에 기초, 이는 여러 혈액과 림프 조직 제한된 세포의 재구성을 허용, 참조 HIV 변형감염 뒤에. 이 모델은 감염 후 최대 36주 동안 모니터링할 수 있으므로 만성 모델이라고 합니다. 두 번째 및 세 번째 모델은 말초 혈액 단핵 세포가 성인 마우스에서 복강 내 주입되는 급성 및 재활성화 모델로 지칭됩니다. 급성 모델에서 건강한 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식되고 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따릅니다. 마지막으로, 재활성화 모델에서, 항레트로바이러스 요법하에 HIV에 감염된 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식된다. 이 경우 마우스의 약물없는 환경은 바이러스 재활성화 및 바이러스 부하의 증가를 허용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 HIV 감염의 인간화되고 면역 결핍 마우스 모델에 대한 기존의 실험 접근법을 설명합니다.
서론
인간화된 NOD/SCID/인터류키친(IL)-2 수용체 γ-chainnull(이하 huNS γ-chainnull로지칭) 마우스 모델은 감염, 자가면역 및 암의 발병기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 약물 및 인간 세포 기반 치료법의 전임상 연구를 위해1,2. 이들 마우스는 비비만 당뇨병(NOD) 배경을 기반으로 하며, IL-2 수용체 γ-사슬 궤적(IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21)에서 의한 좌약 돌연변이 및 표적 돌연변이(NK)의 발달에 심각한 손상을 유발한다. 따라서, 이들은 인간 조직, 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 생착을 지지한다3,4,5. 또한, 줄기세포 인자(SCF), 과립구체/대식세포-콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 IL-3와 같은 인간 조혈계의 형질전환 발현은 인간 골수성 집단의 생착을 촉진한다
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프로토콜
이 작품에서, 모든 동물 관리 및 절차는 메릴랜드 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었습니다 (프로토콜 번호 1018017, 1018018, 및 0318009).
1. 신생아 생쥐의 인간 CD34+ HSC 생착
- 멸균 스크럽, 장갑, 전용 신발, 신발 커버, 마스크, 고글, 머리/수염 보닛 및 멸균 실험실 코트를 포함하여 일회용 개인 보호 장비(PPE)를 항상 사용하십시오.
- 인증된 생체 안전 성 캐비닛에서 RPMI 1640 미디어 10% FBS의 10 mL에서 냉동 CD34+ HSC (재료 표참조)의 1 x 106을 다시 일시 중단하고 멸균 상태를 유지하십시오.
- 10 μL의 현탁액을 사용하여 계산하고 (예상 된 세포 수의 존재를 보장하기 위해) 혈세포계에서 trypan 파란색 배제 염색에 의해 세포 생존 가능성을 확인하십시오.
- 실온(RT)에서 15분 동안 400 x g의 원심분리기. 상급을 버리고 필요한 농도로 차가운 1x PBS에서 다시 일시 중단하십시오 (CD34+ HSC의 1.....
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결과
전술한 바와 같이, HSC 주사 후 14주(만성 모델) 또는 3주 후 PBMC 주사(급성 및 재활성화 모델)에서, 마우스는 유동 세포측정에 의한 인간 세포 생착의 수준을 스크리닝하기 위해 피를 흘린다. 1) 인간 CD45+ 세포 재구성 및 2)CD4+ 및CD8+ T 세포의 백분율의 평가를 위한 대표적인 게이팅 전략은 도 1A에도시되어 있다. 전형적으로, 생착의 수준(인간CD45+ 세포의 백분율)은 CD34+ HSC 주입 후 10%-80%의 범위이며, 다른 앞에서 설명한 요인 들 중에서도 주사 및 마우스 변형의 경로에 의존한다(도1B). PBMC 주사 후, 생착의 수준 (인간 CD45+ 또는 CD3+ 세포의 백분율)은 5 %-65.......
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토론
인간화를 위한 면역결핍 마우스 균주의 발달에서 중요한 진전이 이루어졌으며, 연구 관심사1에따라 사용될 수 있는 다양한 옵션들이 있다. 여기에 제공된 NS γ-chainnull 마우스 및 유전적으로 유사한 균주의 인간화를 위한 일반적인 프로토콜은 HIV 감염을 연구하기 위한 3개의 상이한 모델에서 채택될 것이다. 제1 실험 접근법에서, 조사된 신생아 마우스는 인간CD34+ HSC를 주입하며, 이는 제대혈, 태아 간, 또는 동원된 말초 혈액3,21에서유래될 수 있다. NS γ-chainnull 마우스의 적절한 조사는 마우스 골수 및 기타 전구 세포를 제거하여 인간 세포 집단의 효율적인 재구성을 허용하기 때문에 중요한 단계입니다. 그러나, 몇몇 보고는 조사27없이 다른 마우스 긴장에 있는.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 JCZ에 IHV 임상 부문 내부 자금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0. 5ml 마이크로 원심 분리기 튜브 | Neptune | 3735.S.X1 | |
| . 5ml 마이크로 원심 분리기 튜브 | Neptune | 3745.S.X | |
| 10ml 혈청학 피펫 | 스텔라 스크린 | VL-4090-0010 | |
| 15ml 원추형 튜브 | 스텔라 사이언티픽 | T15-600 | |
| 25ml 혈청학 피펫 | 스텔라 시네마틱 | VL-4090-0025 | |
| 5 ml 혈청 학적 피펫 | 스텔라 sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml 원뿔 튜브 | 스텔라 사이언티픽 | T50-600 | |
| ACK 용해 완충액 | 품질 생물학적 | 118-156-101 | |
| 알코올 준비 패드 | Fisher scientific | 06-669-62 | 멸균 |
| 안티 휴먼 CD3 클론 UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC 공액 |
| 항-인간 CD4 클론 OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 공액 |
| 항-인간 CD45 클론 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 공액 |
| 항-인간 CD8 클론 SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 공액 |
| Biosafaty 캐비닛 레벨 2 | 가능한 경우 Isoflurane | ||
| 을 처리할 때 exauste chimeny에 연결Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | 기본 보호를 위한 일회용 캡 |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | 표면 소독제 |
| CD34+ 세포 | Lonza | 2C-101 | 단일 기증자에서 사용 가능한 가능한 한 많은 바이알 |
| 원심분리기 | Beckman | 65-6KR | |
| 투명 항아리 | Amazon | 77977 | |
| 면 거즈 패드 | Fisher scientific | 22-415-468 | 멸균 |
| 일회용 실험실 코트 | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA 마이크로 튜브 | Greiner bio-one | 450480 | |
| 페이스 마스크 | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS 용해 용액 | BD | 340202 | |
| FBS 프리미엄 HI | 애틀랜타 생물학적 제제 | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
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| 유세포 분석 튜브 | Falcon | 352054 | 5ml 폴리스티렌 및 둥근 바닥 |
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| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I 방사선 분석기 | 대학에 속한 장비 메릴랜드 | ||
| 마이크로 피펫 | |||
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & 태그 회사 | : 1005-1L1 | |
| Natelson 혈액 수집 튜브 | : 피셔 사이언티픽 | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG 마우스 | Jackson | 5557 | 시간 임산부 : CD34 생착 및 청소년 PBMC 생착 |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| 파라 포름 알데히드 16 % | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| 페트리 접시 | Fisher Scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR 기계 | Thermo | QS3 | |
| 시약 저장 탱크 | Costar | 4870 | |
| RPMI 매체 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| 신발 Fisher | scientific | 17-100-911 | |
| 멸균 일회용 장갑 | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA 합성 |
| 주사기 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| 주사기 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine 및 Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -Nicleoside 아날로그 전사 효소 억제제 치료를 위한 항레트로바이러스 약물 |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | 세포 수 및 생존력 |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | 멘톨 및 유칼립투스 기반 연고 |
| 물 분자 생물학 등급 | 품질 생물학 | 351-029-131 |
참고문헌
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory....
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재인쇄 및 허가
