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방법 논문

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

10.3K 조회수

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DOI:

10.3791/60315

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2019년 12월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

이 논문에서

요약

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

초록

인간화 된 NOD/SCID/IL-2 수용체 γ-chainnull 마우스는 전염병에 대한 기본 및 전임상 연구에서 악용될 수 있는 인간 면역의 일부 특징을 다시 한번 재현합니다. 여기에 설명된 HIV 감염의 역학을 연구하기 위한 인간화된 면역 결핍 마우스의 3가지 모델입니다. 첫 번째는 신생아 마우스에서 CD34+ 조혈 줄기 세포의 간간 주사에 기초, 이는 여러 혈액과 림프 조직 제한된 세포의 재구성을 허용, 참조 HIV 변형감염 뒤에. 이 모델은 감염 후 최대 36주 동안 모니터링할 수 있으므로 만성 모델이라고 합니다. 두 번째 및 세 번째 모델은 말초 혈액 단핵 세포가 성인 마우스에서 복강 내 주입되는 급성 및 재활성화 모델로 지칭됩니다. 급성 모델에서 건강한 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식되고 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따릅니다. 마지막으로, 재활성화 모델에서, 항레트로바이러스 요법하에 HIV에 감염된 기증자의 세포는 복강 내 경로를 통해 이식된다. 이 경우 마우스의 약물없는 환경은 바이러스 재활성화 및 바이러스 부하의 증가를 허용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 HIV 감염의 인간화되고 면역 결핍 마우스 모델에 대한 기존의 실험 접근법을 설명합니다.

서론

인간화된 NOD/SCID/인터류키친(IL)-2 수용체 γ-chainnull(이하 huNS γ-chainnull로지칭) 마우스 모델은 감염, 자가면역 및 암의 발병기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 약물 및 인간 세포 기반 치료법의 전임상 연구를 위해1,2. 이들 마우스는 비비만 당뇨병(NOD) 배경을 기반으로 하며, IL-2 수용체 γ-사슬 궤적(IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21)에서 의한 좌약 돌연변이 및 표적 돌연변이(NK)의 발달에 심각한 손상을 유발한다. 따라서, 이들은 인간 조직, 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 생착을 지지한다3,4,5. 또한, 줄기세포 인자(SCF), 과립구체/대식세포-콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 IL-3와 같은 인간 조혈계의 형질전환 발현은 인간 골수성 집단의 생착을 촉진한다6,7,8.

HIV 연구를 위해, 몇몇 huNS γ 사슬널 마우스 모형은 마우스 긴장, 사용된 인간 세포의 모형, 생착을 위한 조직의 모형 및 세포의 기원에 다른 기술되었습니다 (즉, 건강한 대. HIV에 감염된 기증자)9,10. 본래의 균주는, 그러나, 참조 HIV 균주11,12,13을가진 감염 다음 인간 세포 생착 및 바이러스 복제의 상부 때문에 널리 사용된다. 인간 조혈 인자의 형질전환 발현을 가진 유사한 면역 결핍 마우스 긴장 (예를 들어, NOG-EXL 또는 NSG-SGM3) 또는 인간 간 및 흉선 조직(골수 간-흉선[BLT] 마우스)의 임플란트와 함께 항 HIV 면역 반응에서 골수성 집단의 역할, 이들 조직에 대한 HIV의 영향, 및 바이러스 성 저수지로서의 그들의 참여에 유용하다14,15. 더욱이, BLT 마우스뿐만 아니라 인간 백혈구 항원(HLA) 분자의 형질전환 발현을 가진 일부 균주는 HIV 감염에 대한 T 세포 반응을 연구하기 위해 사용될 수 있다16,17.

일반적으로, 이들 마우스에서, 인간화는 세포 기원, 전달 경로(복강내, 간내, 정맥내, 심장내) 및 생착시의 마우스 나이에 따라 달라지며18,19,20. 세포 기원에 관하여, 제대혈, 태아 간, 또는 동원된 말초 혈액으로부터 유래된 인간CD34+ HSC는 신생아 또는 젊은 마우스3,21에주사될 수 있다. 또한, 성인 γ-사슬널 마우스는 PBMC(여기서 hu-PBL-NS γ-chainnull 마우스라고 함)의 주입에 의해 인간화될 수 있으며, 이들 세포의 혈액, 이차 림프기관 및 염증조직(22,23,24)의시간적 순환을 허용한다.

여기서 설명된 것은 HIV 감염의 연구를 위한 huNS γ-chain널 마우스 모델의 확립을 위한 상세한 프로토콜이다. 첫 번째는 만성 모델이며, 건강한 기증자로부터 코드 혈액에서 파생 된 인간 CD34+ HSC가 신생아 마우스에 주입되고, 인간 면역 체계 재구성 14 주 후에 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따릅니다. 이 모형은 감염 후에 최대 ~36 주 동안 마우스의 감시를 허용합니다. 두 번째 모델은 건강한 공여자로부터 유래된 PBMC가 성인 NS γ-chainnull 마우스에 주입되고, 마우스에서 인간 T 세포 확장 3주 후에 참조 HIV 균주를 가진 감염이 뒤따르는 급성 모델이다. 마지막으로, 제3 모델은 억제항레트로바이러스 요법(ART)에 따라 HIV 감염 공여자로부터 유래된 PBMC가 성인 NS γ-chainnull 마우스에 주입되는 재활성화 모델이다. 이 경우 약물이없는 환경은 바이러스 재활성화 및 바이러스 부하 증가를 허용합니다. 두 후자의 모델은 생착 후 ~ 9 주까지 모니터링 할 수 있습니다.

전반적으로, 이 3개의 모형은 바이러스학 연구, 새로운 약의 전임상 연구 및 글로벌 면역 반응에 HIV 감염 효력의 평가를 위해 유용합니다. 또한 HIV에 감염된 인간화 마우스의 사용은 어떤 실험든지 전에 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의하여 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의하여 검토 그리고 승인을 요구한다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 연구가 실험 동물의 위험한 생물학적 물질의 사용과 인도적 취급에 대한 모든 내부 및 외부 기관 규정을 준수할 수 있도록 합니다.

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프로토콜

이 작품에서, 모든 동물 관리 및 절차는 메릴랜드 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었습니다 (프로토콜 번호 1018017, 1018018, 및 0318009).

1. 신생아 생쥐의 인간 CD34+ HSC 생착

  1. 멸균 스크럽, 장갑, 전용 신발, 신발 커버, 마스크, 고글, 머리/수염 보닛 및 멸균 실험실 코트를 포함하여 일회용 개인 보호 장비(PPE)를 항상 사용하십시오.
  2. 인증된 생체 안전 성 캐비닛에서 RPMI 1640 미디어 10% FBS의 10 mL에서 냉동 CD34+ HSC (재료 표참조)의 1 x 106을 다시 일시 중단하고 멸균 상태를 유지하십시오.
  3. 10 μL의 현탁액을 사용하여 계산하고 (예상 된 세포 수의 존재를 보장하기 위해) 혈세포계에서 trypan 파란색 배제 염색에 의해 세포 생존 가능성을 확인하십시오.
  4. 실온(RT)에서 15분 동안 400 x g의 원심분리기. 상급을 버리고 필요한 농도로 차가운 1x PBS에서 다시 일시 중단하십시오 (CD34+ HSC의 1.4 x 105 5 50 μL). 주입 될 때까지 얼음에 세포를 유지합니다.
  5. 새끼 (NS γ 체인null 새끼 를 1-4 일 된 남녀 모두의 null 새끼)와 멸균 된 100mm2 페트리 접시에 넣고 브리더 케이지에서 소량의 침구 재료를 넣습니다. 또한, 깨끗한 침구를 손 사이에 문지르면 받는 새끼의 이물질 냄새를 더 가릴 수 있습니다.
    참고 : 이것은 새끼에 함침되는 외국 냄새를 최소화하여 시술 후 새끼를 다시 우리에 넣을 수있는 기회를 향상시입니다.
  6. 페트리 접시를 깨끗한 수송 케이지에 넣고 깨끗한 마우스 마이크로솔레이터 케이지에 케이지를 놓아 환경으로부터 새끼를 보호하십시오. 조사실로 이동하는 동안 외부 빛에 동물이 노출되지 않도록 커버 패드로 운송 케이지를 덮습니다.
  7. 137 Cs 소스에 노출하여 100 cGy 전신 조사 (WBI)로 새끼를 조사하십시오. 소독제로 조사기의 내부를 청소하고, 조사기에 마우스를 놓고, 턴테이블을 켜서 모든 새끼가 균일하게 조사되도록하십시오. 조사기를 닫고 전원 스위치를 눌러 조사 프로세스를 시작합니다. 조사 시간이 완료될 때까지 기다렸다가 마우스를 즉시 제거합니다.
    참고: 조사는 마우스에 있는 응력생성하지 않기 때문에, 이전 마취는 필요하지 않습니다.
  8. 2-4 시간 조사 절차 후, 얼음에 멸균 거즈로 덮인 차가운 멸균 페트리 접시 안에 생물 안전 성 캐비닛에 새끼를 놓고 마취 될 때까지 (~ 5-10 분). 총 운동이 중단될 때 충분한 마취가 달성됩니다.
  9. 주사기를 부착된 바늘(29G, 0.5")으로 50 μL의 셀 서스펜션과 1.4 x 105의 CD34+ HSC를 인증된 생체 안전 성 캐비닛 아래에 적재하십시오.
  10. 간 주사를 통한 생착의 경우 엄지손가락과 검지 손가락으로 새끼를 제지하십시오. 마우스 구속을 최소화하기 위해(~30-45초), 한 조사자가 새끼를 잡고 주사를 투여하게 하고, 두 번째 조사자가 HSC 현탁액으로 주사기를 로드하게 한다. 70% 알코올로 주사 부위를 청소하고 50 μL의 세포를 간으로 직접 전달하십시오. 간을 완전히 관통하지 않도록 주입 할 때 얕은 바늘 각도를 사용하십시오. 대조군으로, 50 μL의 1x PBS를 가진 마우스를 간으로 주입하십시오.
  11. 새끼를 멸균 거즈로 덮인 미리 데운 멸균 페트리 접시에 1-5분 간 올려 놓아 회복이 허용됩니다. 20°C의 설치류용 적외선 온난화 패드를 사용하여 요리를 예온하여 새끼가 과도하게 따뜻해지지 않도록 합니다.
  12. 새끼를 부모에게 돌려주기 직전에 엄지 손가락과 검지 손가락을 사용하여 소량의 멘톨 및 유칼립투스 기반 연고를 양 부모의 주둥이에 적용하여 식인 풍습이나 새끼의 거부를 피하십시오.
  13. 건조한 피부, 수유, 발진 및 탈모증과 같은 새끼에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 징후를 매일 확인하십시오. 이러한 징후가 관찰되면 동물을 안락사시.
  14. 생쥐를 생후 3주경에 성별별로 그룹화하였다. 케이지 당 5 마리 이상의 동물을 넣지 마십시오. 생후 14주에 유세포분석으로 말초 혈액에 생착이식을 확인합니다.
    참고 : 생착의 성공률은 80 %-100 %입니다.

2. 청소년 마우스의 인간 PBMC 생착

  1. 급성 및 재활성화 모델의 경우, 6-8주 령 NS γ-chainnull 마우스를 각각 ART 하에 있던 건강한 공여자 또는 HIV 감염 환자로부터 유래한 인간 PBMC와 함께 복강 내 주사한다. 두 모델 에서, 대조군으로 HIV 감염 없이 건강 한 기증자에서 PBMC주입 쥐를 포함 (sham).
  2. 50 mL 원엽 튜브에 멸균 밀도 그라데이션 배지의 5 mL에 전혈의 15 mL를 층.
  3. 400 x g의 원심분리기RT에서 브레이크 없이 30분 동안 버피 코트가 밀도 그라데이션 매체와 혼합되는 것을 방지합니다.
  4. 단핵 세포의 분획 (밀도 구배 배지와 상수체 사이)을 조심스럽게 수집하고 버피 코트를 1x PBS의 10 mL를 포함하는 15 mL 원심 분리관으로 옮니다. RT에서 10 분 동안 300 x g의 원심 분리기.
  5. 상급체를 버리고 펠릿 세포에 첨가된 ACK 완충액 5 mL로 매물로 채압하여 나머지 적혈구를 제거한다. RT에서 4 분 동안 인큐베이션하십시오.
  6. RT에서 10 분 동안 300 x g의 원심 분리기를 폐기하고 1x PBS 또는 RPMI 1640 매체의 10 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
  7. 셀 서스펜션의 10 μL을 사용하여 세포를 계산하고 혈세포계에서 트리판 블루 배제 염색에 의해 생존가능성을 확인하십시오. 전형적으로, 1-2 x 106 세포는 혈액의 각 1 mL를 위해 장악됩니다, 95% 이상 생존율.
  8. RT에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기를 폐기하고 필요한 농도로 세포 수를 조정합니다 (이 경우, 1 x PBS의 200 μL에서 3.5 x 106 세포).
  9. 부착된 바늘(28G, 0.5")으로 주사기를 3.5 x 106의 PBMC를 인증된 생체 안전 성 캐비닛 아래에 1x PBS의 200 μL에 적재하십시오.
  10. 케이지에서 마우스를 제거하고 꼬리를 잡고 메쉬를 잡을 수 있도록 뒤로 부드러운 견인력을 적용합니다. 그런 다음, 검지와 엄지 손가락을 동물의 어깨에 놓고 목의 느슨한 피부를 잡고 가운데 손가락을 사용하여 허리를 안정시게합니다.
  11. 마우스 헤드를 뒤로 밀어 머리 위에 있습니다. 이것은 복강의 내장이 뒤로 변위될 수 있게 하고 주입 도중 내부 기관을 뚫는 의 리스크를 감소시킵니다.
  12. 70 % 알코올로 주사 부위를 청소하십시오.
  13. 2.9 단계에서 사용되는 주사기를 복벽을 통해 침투하고 세포를 주입하기 전에 흡인, 어떤 물질이 흡인되면, 주사기를 제거하고 폐기. 그렇지 않으면 복강 내 구멍에 세포를 천천히 주입하고 주사기를 제거하고 폐기하십시오. 마우스를 제어하기 위해 1x PBS를 주입합니다.
  14. 동물을 케이지로 되돌려 놓습니다.
  15. 주입 후 3주 동안 유세포분석으로 말초 혈액에 생착이식을 확인합니다.

3. 생착 후 관리

  1. 귀 태그로 마우스를 식별합니다.
  2. 고민의 임상 징후를 위해 각 절차 후 이 실험에 사용된 마우스를 하루에 2배 밀접하게 관찰하십시오.
  3. 인간 세포 이식 후, GVHD에 대한 마우스를 모니터링. 신생아, 청소년 및 성인 마우스의 GVHD 증상을 모니터링하려면 체중 측정 외에도 피부 질환 (즉, 색, 건조, 발진, 탈모증)의 출현에 대해 동물을 평가하십시오. 수의사가 이러한 징후를 보이는 동물을 평가하여 조기 안락사를 고려합니다.

4. HIV 감염 절차 및 가짜 감염 절차

참고: 만성 및 급성 모델의 경우, 마우스는 각각 14주차및 3주차에 HIV BaL 기준 균주에 감염된다. HIV를 가진 주사는 하복부 사분면으로 복강 내로 관리됩니다.

  1. ABSL2 절차에 따라 BSL2 캐비닛에서 28 G 0.5" 바늘을 사용하여 바이러스/PBS를 주사기로 로딩하는 과정을 수행합니다. 주입된 바이러스의 총량은 멸균 RPMI 1640의 200 μL에서 15,000개의 중앙조직 배양 감염성 용량(TCID50)이다.
  2. 케이지에서 마우스를 제거하고 꼬리를 잡고 메쉬를 잡을 수 있도록 뒤로 부드러운 견인력을 적용합니다. 그런 다음 검지 손가락과 엄지 손가락을 동물의 어깨에 놓고 목의 느슨한 피부를 잡고 가운데 손가락을 사용하여 허리를 안정시게합니다.
  3. 마우스 헤드를 뒤로 밀어 머리 위에 있도록 합니다. 이것은 복강의 내장이 뒤로 변위될 수 있게 하고 주입 도중 내부 기관을 뚫는 의 리스크를 감소시킵니다.
  4. 복부의 왼쪽 / 오른쪽 사분면에 미리 젖은 알코올 패드로 마우스를 청소합니다. 멸균 RPMI1640의 200 μL에 포함된 HIV BaL 바이러스 의 15,000 TCID 50을 주입한다.
  5. 주입 후 마우스를 홈 케이지로 되돌리시고.

5. 레트로궤도 천자에 의한 혈액 채취

참고 : 회역 출혈은 혈액의 빠른 수집을 허용하여 전체 수집 시간을 줄이고 인간 림프구 마커의 안정성을 증가시킵니다. EDTA 튜브를 사용하여 마우스 혈액을 수집하십시오.

  1. 만성 모델에서, 에서 14 주 후 HSC 주입, 레트로 궤도 정맥을 통해 혈액을 수집. 급성 및 재활성화 모델에서 PBMC 주입 후 3주 후이 절차를 수행하십시오.
  2. 외부로 덕트되는 생체 안전 후드 클래스 B2에서 혈액 수집 전에 250 μL의 이소플루란 흡입을 사용하여 동물을 마취시금.
  3. 건물 외부에서 배출되는 생체 안전 캐비닛에 투명한 1L 병에 와이어 메쉬 아래 면 패드에 Isoflurane을 분배하십시오. 메쉬를 사용하면 동물이 이소플루란에 젖은 패드에 접촉하지 않도록 하여 이소플루란이 피부를 통해 흡수되기 때문에 피부 자극과 잠재적과다스손상을 유발할 수 있습니다. 또한, 사지 부상을 방지하기 위해 메쉬와 동물 사이에 부드러운 종이 타월을 넣어.
  4. 항아리가 이소플루란 (추가 후 약 1 분)으로 포화되면 동물을 소개하고 호흡 속도를 관찰하면 감소합니다. 오른쪽 반사의 부족을 포함 마취의 깊은 평면의 임상 표시를 확인 (부드럽게 항아리를 팁에) 및 총 운동의 부족. 동물이 완전히 이완되고 발가락 핀치 반사가 결여되는 즉시 출혈 절차를 시작합니다.
    참고 : 이소플루란이 증발하기 때문에 마취의 징후가 관찰되지 않으면 더 많은 약물을 분배하십시오.
  5. 회고 출혈을 위해 마우스 외부 경정맥을 엄지 손가락으로 하악골에 누르고 같은 손으로 검지 손가락으로 위 눈꺼풀을 부드럽게 들어 오릅니다.
  6. hematocrit 튜브를 내측 캔에 삽입눈의 따라서 혈액이 플럭스 시작 될 때까지 혈관 측방향으로 지시하십시오.
  7. 적어도 100 μL의 혈액을 수집합니다. 원하는 양의 혈액이 얻어지면 (동물의 체중의 1 % 이하의 부피), 외부 경정맥 압력을 중단하고 헤마토크릿 튜브를 제거하십시오.
  8. 최소 30s의 멸균 거즈를 사용하여 눈에 직접 압력을 가하여 지혈이 완료되었는지 확인하십시오.
  9. 눈에 테트라카인 방울을 적용합니다. 동물이 마취에서 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링하고 케이지에 다시 놓습니다.
    참고: 수집된 혈액의 100 μL은 인간 CD45+및 그밖 혈액 세포 인구의 생착의 수준의 평가및 혈장 바이러스성 짐의 평가를 위해 이용됩니다.

6. 생착 수준 및 유세포 분석의 스크리닝

  1. 불소 표지된 항인간 항체의 배양을 포함하는 전혈에 대한 종래의 유세포분석 염색 프로토콜을 따르고(제안된 유동 패널, 물질 표참조), 적혈구의 용해 및 세척 단계13,15.
    참고: 생착 의 수준의 스크리닝을 위해, 항인간 CD45 항체를 포함한다. 비교를 위해, 항마우스 CD45 항체도 사용될 수 있다. 동일한 항체 혼합으로 염색된 인간 혈액 샘플, 얼룩지지 않은 마우스 및 인간 혈액 샘플, 및 비인간화된 대조군뿐만 아니라 보정 대조군을 포함하여 시약의 교차 반응성을 시험한다. 염색 후, 항상 몇 가지 배경 신호가있다; 그러나 모든 긍정적인 신호는 음수 및 교차 반응성 제어와 명확하게 구별됩니다.
  2. 적절한 유량 세포계에서 림프구 게이트에서 적어도 10,000 개의 이벤트를 획득하십시오 (FSC-A 대 SSC-A). 유세포분석의 경우, 중복 배제 후, 인간CD45+ 세포의 백분율과 관심 있는 다른 세포 집단을 결정한다.

7. 플라즈마 바이러스 부하의 평가

  1. 감염 후 일주일에 1회 HIV 감염 동물의 바이러스 부하를 평가합니다.
  2. 회귀출혈 후(약 100 μL), 항응고화된 혈액의 원심분리 후 상구액을 3,500 x g에서 3분 동안 미세원심분리기에서 3분 동안 수집하여 혈장을 얻었다. 펠릿은 혈액 세포 자형질에 사용됩니다.
  3. 상용 바이러스 RNA 추출 키트(재료 표참조)를 사용하여 혈장의 40 μL에서 RNA를 얻습니다.
  4. RNA를 제1 스트레인 합성 믹스(재료 표참조)와 HIV 개그 프라이머 SK431을 사용하여 cDNA로 변환합니다.
  5. 이전 연구13,25에기재된 바와 같이 HIV 개그 프라이머 SK38/SK39 및 형광 녹색 염료(예를 들어, SYBR 녹색)를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행한다.

8. 항레트로바이러스 요법의 관리

  1. 만성, 급성 및 재활성화 모델에서 감염 후 적어도 3주 동안 구강 ART를 투여한다.
  2. 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF), 엠트리시타빈(FTC), 랄테그라비르(RAL)의 투여량을 계산하며, 인간과 마우스에 대해 각각 37 및 3의 Km 값에따라, 26. 일반적으로, TDF의 인간 동등한 복용량, FTC, 그리고 RAL는 61.7 mg/kg/일, 40.7 mg/kg/일, 그리고 164 mg/kg/일, 각각.
  3. 식수 투여를 위해 약물 정제를 분쇄하고 물병에 각각의 양을 추가하여 케이지의 각 마우스가 일일 복용량을 획득하도록 합니다. 약물 분말은 병에 침전물을 형성 할 수 있기 때문에, 주기적으로 균일 한 현탁액을 달성하기 위해 물 병을 흔들어.
  4. 갓 녹인 약물로 매주 물병을 바꾸하십시오.
  5. 바이러스 부하 및 CD4:CD8 비율의 변화를 평가하기 위해 ART 개시 후 매주 또는 2주마다 레트로궤도 정맥을 통해 혈액을 수집합니다.

9. 마우스 안락사, 이차 림프 기관의 수집, 단핵 세포의 격리

  1. 안락사는 3개의 인간화된 마우스 모형에서, 감염 시간을 따라 주기적으로, 또는 실험의 끝에 수행된다.
  2. CO2 질식에 의해 성인 마우스의 안락사를 수행하고, 이어서 자궁 경부 탈구를 수행한다. 질식의 경우, 2013 AVMA 지침을 준수하기 위해, 비 사전 충전 된 챔버를 사용하여, 고정 압력 레귤레이터와 챔버 볼륨 / 분의 20 %-30 % 이내에 가스 흐름을 제어하는 라인 제한기와 상업 용 실린더에서CO2를 분배.
  3. CO2 흐름을 유지 >60 의 모니터링 호흡 정지 (최대 5 분 걸릴 수 있음), 자궁 경부 탈구가 안락사를 보장합니다.
  4. 육체적 인 방법 (즉, 날카로운 가위를 사용하여)에 의해 신생아 및 7 일 된 안락사.
  5. 차축, 종격동 및 장간막 림프절 (일반적으로 관찰됨)을 시각화하고 핀셋과 날카로운 가위로 추출하십시오. 또한 복강 왼쪽 상단에위치한 비장을 추출하십시오.
  6. 멸균 RPMI 1640 배지를 포함하는 1.5 mL 원심분리기 튜브에 림프성 조직을 증착한다.
  7. 즉시 70mm 공극 크기의 나일론 세포 여과기에서 림프 조직을 처리하고 50 mL 튜브에서 세포를 수집합니다. 조직을 흡인하지 마십시오.
  8. 세포 필터링을 용이하게 하기 위해 1% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지 의 5 mL로 세포를 세척합니다.
  9. 조직 분해 후, 세포 현탁액을 3,500 x g에서 미세 원심 분리기에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
  10. 상급체를 버리고 1x PBS의 500 μL로 세포를 다시 일시 중단합니다.
  11. 세포 현탁액을 멸균 밀도 그라데이션 배지의 500 μL을 함유하는 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김을 전달한다.
  12. 3,500 x g의 원심분리기는 브레이크없이 미세 원심 분리기에서 3 분 동안 밀도 그라데이션 매체와 혼합되는 버피 코트를 방지합니다.
  13. 단핵 세포의 분획 (밀도 구배 배지와 상수체 사이)을 조심스럽게 수집하고 버피 코트를 1x PBS의 500 μL을 함유한 1.5 mL 원심 분리튜브로 옮니다. 3,000 x g의 원심분리기3분.
  14. ACK 완충액 500 μL로 용해하여 나머지 적혈구를 제거하고 RT에서 4 분 동안 배양하십시오.
  15. 3,000 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 1 x PBS 또는 매체의 1 mL에서 재중단하십시오.

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결과

전술한 바와 같이, HSC 주사 후 14주(만성 모델) 또는 3주 후 PBMC 주사(급성 및 재활성화 모델)에서, 마우스는 유동 세포측정에 의한 인간 세포 생착의 수준을 스크리닝하기 위해 피를 흘린다. 1) 인간 CD45+ 세포 재구성 및 2)CD4+ 및CD8+ T 세포의 백분율의 평가를 위한 대표적인 게이팅 전략은 도 1A에도시되어 있다. 전형적으로, 생착의 수준(인간CD45+ 세포의 백분율)은 CD34+ HSC 주입 후 10%-80%의 범위이며, 다른 앞에서 설명한 요인 들 중에서도 주사 및 마우스 변형의 경로에 의존한다(도1B). PBMC 주사 후, 생착의 수준 (인간 CD45+ 또는 CD3+ 세포의 백분율)은 5 %-65...

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토론

인간화를 위한 면역결핍 마우스 균주의 발달에서 중요한 진전이 이루어졌으며, 연구 관심사1에따라 사용될 수 있는 다양한 옵션들이 있다. 여기에 제공된 NS γ-chainnull 마우스 및 유전적으로 유사한 균주의 인간화를 위한 일반적인 프로토콜은 HIV 감염을 연구하기 위한 3개의 상이한 모델에서 채택될 것이다. 제1 실험 접근법에서, 조사된 신생아 마우스는 인간CD34+ HSC를 주입하며, 이는 제대혈, 태아 간, 또는 동원된 말초 혈액3,21에서유래될 수 있다. NS γ-chainnull 마우스의 적절한 조사는 마우스 골수 및 기타 전구 세포를 제거하여 인간 세포 집단의 효율적인 재구성을 허용하기 때문에 중요한 단계입니다. 그러나, 몇몇 보고는 조사27없이 다른 마우스 긴장에 있는...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 JCZ에 IHV 임상 부문 내부 자금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0. 5ml 마이크로 원심 분리기 튜브Neptune3735.S.X1
. 5ml 마이크로 원심 분리기 튜브Neptune3745.S.X
10ml 혈청학 피펫스텔라 스크린VL-4090-0010
15ml 원추형 튜브스텔라 사이언티픽T15-600
25ml 혈청학 피펫스텔라 시네마틱VL-4090-0025
5 ml 혈청 학적 피펫스텔라 sceintificVL-4090-0005
50 ml 원뿔 튜브스텔라 사이언티픽T50-600
ACK 용해 완충액품질 생물학적118-156-101
알코올 준비 패드Fisher scientific06-669-62멸균
안티 휴먼 CD3 클론 UCHT1Biolegend300439APC 공액
항-인간 CD4 클론 OKT4Biolegend317420AF488 공액
항-인간 CD45 클론 2D1Biolegend368522BV421 공액
항-인간 CD8 클론 SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 공액
Biosafaty 캐비닛 레벨 2가능한 경우 Isoflurane
을 처리할 때 exauste chimeny에 연결BonnetFisher scientific17-100-900기본 보호를 위한 일회용 캡
CavicideMetrex13-1000표면 소독제
CD34+ 세포Lonza2C-101단일 기증자에서 사용 가능한 가능한 한 많은 바이알
원심분리기Beckman65-6KR
투명 항아리Amazon77977
면 거즈 패드Fisher scientific22-415-468멸균
일회용 실험실 코트Fisher scientific19-472-422
EDTA 마이크로 튜브Greiner bio-one450480
페이스 마스크Fisher scientific17-100-897
FACS 용해 용액BD340202
FBS 프리미엄 HI애틀랜타 생물학적 제제S1115OH
FicollGE health one17-1440-02
유세포 분석기우리는 FACS Aria II
유세포 분석 튜브Falcon3520545ml 폴리스티렌 및 둥근 바닥
HIV BaLuQUANT 핵심 시설에서 준비
Human PBMCHIV 양성 및 음성 지원자
적외선 온난화 패드Venet ScientificDCT-25소동물을위한 임시 치료 온난화 패드
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 치료를위한 항 레트로 바이러스 약물 - Integrase 억제제
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I 방사선 분석기대학에 속한 장비 메릴랜드
마이크로 피펫
마이크로 원심분리기Eppendorf
Mouse ear tagsNational Band & 태그 회사: 1005-1L1
Natelson 혈액 수집 튜브: 피셔 사이언티픽02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG 마우스Jackson5557시간 임산부 : CD34 생착 및 청소년 PBMC 생착
NSG-SGM3Jackson13062
파라 포름 알데히드 16 %전자 현미경 과학15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
페트리 접시Fisher Scientific08-757-28
Quantistudio qPCR 기계ThermoQS3
시약 저장 탱크Costar4870
RPMI 매체 1640 1XGibco11875-093
신발 Fisherscientific17-100-911
멸균 일회용 장갑MicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA 합성
주사기 28-G x 1/2BD329-461
주사기 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine 및 TenofovirGileadNDC 61958-0701-1인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -Nicleoside 아날로그 전사 효소 억제제 치료를 위한 항레트로바이러스 약물
Trypan blueSigmaT8154세포 수 및 생존력
Vick VaporubSchool health43214멘톨 및 유칼립투스 기반 연고
물 분자 생물학 등급품질 생물학351-029-131
을 사용했습니다.

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