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방법 논문

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60323

⸱

2019년 10월 31일

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

이 논문에서

요약

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

초록

내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.

이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.

서론

폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF 1,2와 같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3,4,5,6,7,8. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병10에의해 입증됩니다.

구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL11,10의농도로 인간의 혈액 시스템에서 순환합니다. 혈관 손상에 대한 응답으로, 내피 바이벨 팔라드 바디 (WBP)에 의한 VWF의 국소 방출은현저하게 11,12증가된다. 이전 연구는 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 준수 및 공극 형성 독소 폐렴의 생산이 크게 루미날 VWF 분비를 자극한다는 것을 보여준다13. 혈류의 유체역학적 힘은 메카노반응성 VWF 도메인의 구조적 개방을 유도한다. 10dyn/cm2의 유량에서 VWF는 최대 수백 마이크로미터길이의 긴 단백질 문자열로 multimerizes10,12.

내피 표면과 폐렴구균의 상호 작용에서 전단 응력 하에서 생성된 다중화된 VWF 현의 기능을 이해하기 위해 미세 유체 기반 세포 배양 접근법이 확립되었습니다. 소프트웨어 제어 식 공기 압력 펌프 시스템을 갖춘 미세 유체 장치가 사용되었습니다. 이를 통해 정의된 유량으로 세포 배양 배지의 연속적이고 단방향 재순환이 가능했습니다. 따라서 시스템은 내피 세포의 표면에 정의된 전단 응력을 적용하여 특수 채널 슬라이드 내부에 부착된 상태로 유지했습니다. 이 접근법은 정의된 일정한 흐름 조건 하에서 VWF 현이 분화된 내피 세포에서 생성되는 인간 혈관 시스템의 혈류 내 전단력을 시뮬레이션할 수 있게 했습니다. 이를 위해, 내피 세포는 특정 채널 슬라이드(재료 표참조)에서 경작되었고, 이는 유동 동안 현미경 분석을 위해 조정되었다. 미세 유체 펌프 시스템은 동포 내피 세포 층에 확장 된 VWF 문자열의 형성에 필요한 고도로 정의되고 제어 된 전단 응력 상황을 제공했습니다. VWF-분비후 히스타민 보충제에 의해 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)를 동류성장한 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)의 자극 후, 현 형성은 10dyn/cm2의전단 응력(들)을 적용하여 유도되었다. 전단 응력은 세포 층에 작용하는 힘으로 정의됩니다. 그것은 코니쉬 등에 따라 대략 계산됩니다. al.14 와 방정식 1:
figure-introduction-1

여기서 = dyn/cm2의전단 응력, θ =점도(dyn∙s)/cm2, h =채널 높이의 절반, 채널 너비의 절반, Φ=mL/min의 유량.

방정식 1의 결과는 사용되는 다른 슬라이드의 높이와 너비에 따라 달라집니다(재질 표참조). 본 연구에서 0.4 μm의 루어 채널 슬라이드를 사용하여 챔버 슬라이드 계수 131.6을 사용하였다(공식 2 참조).
figure-introduction-2

37°C에서 배지의 점도는 0.0072 dyn∙s/cm²이고 10 dyn/cm²의 전단 응력도 사용하였다. 그 결과 10.5 mL/min의 유량이 발생했습니다(수식 3 참조).
figure-introduction-3

여기서, 숙주 혈관구조에서 세균 감염 메커니즘의 조사 및 시각화를 위한 단방향 층류 시스템을 이용한 미세유체 세포 배양 절차의 적응 및 발전이 상세히 기술된다. 내피 층에 VWF 스트링의 생성은 또한 연속적이고 꾸준한 전단응력(15)을적용할 수 있는 다른 펌프 시스템을 사용하여 자극될 수 있다.

VWF 현 형성의 흐름 및 자극에 합류하는 1차 내피 세포를 배작한 후, 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 폐렴구균을 일정한 현미경 조절하에 내피 세포 층에 첨가하였다. 내피 세포의 표면에 VWF 문자열에 박테리아를 부착하는 것은 VWF 특이적 형광 표지 항체를 사용하여 실시간으로 최대 3 시간 동안 현미경으로 시각화및 모니터링되었습니다. 이러한 접근법으로, 혈관 내피에 세균 부착을 촉진하는 유착 보조인자로서 VWF의 역할을 결정하였고8.

단백질 분비 및 형태 변화의 현미경 시각화 이외에,이 방법은 실시간으로 세균 감염 과정의 단일 단계를 모니터링하고 서로 다른 시점에서 부착 된 박테리아의 양을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 감염. 특정 소프트웨어 제어 펌프 시스템은 또한 최대 며칠 동안 정의된 일정한 유동 조건에서 내피 세포를 배양할 수 있는 가능성을 제공하고 정의된 펄스 매질 유동 배양을 가능하게 합니다. 또한,이 방법은 다른 세포 유형을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 염색 프로토콜을 적응하면 진핵 세포로 내중화된 박테리아를 감지하고 시각화할 수 있습니다.

이 원고는 병리학 적 과정의 효율적이고 다양한 특성화를 위해 정의되고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 접근 법으로 사용할 수있는이 고급 실험 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

미세유체 세포 배양은 상업적인 일차인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 수행하였다. 회사는 기증자의 통보된 동의를 가진 세포를 고립시되었습니다. 이 연구는 참조 번호 와 연방 주 바덴 - 뷔르템베르크의 의사 상공 회의소의 윤리위원회에 의해 승인되었다 219-04.

참고: 프로토콜 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오.

1. 1 차 내피 세포의 사전 육성

  1. 37°C에서 3개의 다른 공여자로부터 1 x 10515차 HUVEC를 함유하는 냉동 글리세롤 바이알을 해동시키고, 25 cm2 세포 플라스크에서 7 mL의 내피 세포 성장 배지(ECGM, 보충제와 함께 사용할 준비)로 세포를 종자하였다.
    참고: 1 차적인 내피 세포는 5 개 이상의 증식 주기 후에 분화 능력을 분실합니다. 따라서 5개 미만의 대지나 높은 등급의 세포 분화가 필요한 경우에만 사용할 수 있습니다.
  2. 37°C에서 세포를 5%CO2 대기에서 60분 동안 배양하여 표면 부착을 허용하고 ECGM 세포 배양 배지를 교환하여 극저온 보존으로부터 잔류물을 제거합니다.
  3. 5%CO2 대기에서 37°C에서 세포를 계속 배양하여 하위 구성 세포층을 형성한다.
    참고: HUVEC는 단단한 세포 세포 접촉이 나중에 흐름에서 안정된 세포 층의 형성을 방지하기 때문에 동류 층으로 성장해서는 안됩니다.

2. 연쇄상 구균 폐렴의 사전 육성

주의: 연쇄상 구균 폐렴은 생물 안전 성 수준 2 에이전트이며 생물 안전 수준 2 실험실에서 만 배양 할 수 있습니다. 모든 세균 치료에 대해 안전 수준 2로 분류 된 깨끗한 벤치를 사용하고 에어로졸 형성을 엄격히 피하고 박테리아 침전을위해 에어로졸 보호 기능이있는 원심 분리기를 사용하십시오.

  1. -80°C에서 지속적으로 보관되는 글리세롤 스톡으로부터 유래된 연쇄상 구균 폐렴구균 임상 분리물 ATCC11733으로 컬럼비아 혈액 한천 플레이트를 접종하고 37°C 및 5%CO2에서하룻밤 동안 한천 플레이트를 배양하였다.
  2. 세균 재배 및 세척 단계를 위해 1% 효모 추출물(THY)과 멸균 인산완충식염수(PBS) pH 7.4 15mL로 보충된 토드 휴이트 액체 국물 40 mL를 준비합니다.
  3. 세균 재배를 위해 멸균 튜브를 사용하고 액체 배양 액을 세균 덩어리로 접종하십시오. 600 nm에서 1 mL aliquots의 광측정에 의한 접종량을 비접종액 액액에 대해 참고자료로 제어합니다. 0.15의 600 nm (OD600)에서광학 밀도에 도달 할 때까지 액체 국물에 세균 덩어리를 채웁니다.
  4. 37°C 및 5%CO2에서 흔들리지 않고 접종된 액체 국물을 배양하고 플라스틱 큐벳을 사용하여 1 mL aliquots를 측정하여 30분마다 OD600을 결정합니다.
  5. 세균 배양이 지수 성장 기에 해당하는 0.4의 OD600에 도달하자마자, 실온(RT)에서 1,000 x g에서 10분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리한다.
    참고: 폐렴구균 배양액이 1.0 이상인 OD600에 도달하는 것을 허용하지 않는데, 이는 높은 폐렴구균 배양 밀도가 세균성 자가매를 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 전반적인 세균 적정성에도 영향을 미칠 수 있다.
  6. 10 mL PBS로 세균 퇴적물을 부드럽게 다시 중단하고 RT에서 1,000 x g에서 10 분 동안 다시 퇴적물을 다시 하십시오.
  7. 세척된 세균 퇴적물을 1 mL PBS에서 부드럽게 중단하고 1mL의 PBS를 이용하여 세균 현탁액의 10 μL의 OD600을 기준으로 결정한다.
  8. PBS내의 박테리아 양을 2.0의 OD600으로 조정합니다. 이전에 결정된 세균 계수에 따르면, 2.0의 OD600은 2 x 109 콜로니 형성 단위(CFU)에 해당한다. 즉시 세균 성 자동 해를 방지하기 위해 감염 절차를 진행합니다.

3. 미세 유체 조건하에서 HUVEC의 내피 세포 재배

  1. 제어 된 proteolysis에 의해 세포 배양 플라스크에서 기본 내피 세포를 분리. 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 다음 단계를 수행합니다. 세척 단계를 위해 멸균 PBS 15 mL의 부피를 준비합니다.
    1. 지하 성장HUVEC 층으로부터 ECGM을 제거하고 혈청학적 피펫을 사용하여 10 mL PBS로 세포층을 세척하여 세포 배양 배지를 제거한다.
    2. 세척된 HUVEC를 37°C의 3 mL로 배양하여 37°C에서 5분 동안 세포 분리를 위한 미리 warmed된 세포 해리액을 배양하였다. 매 분마다 현미경 모니터링을 통해 프로테오리틱 셀 분리를 관찰합니다.
    3. 분리된 세포 현탁액을 ECGM 7 mL을 함유하는 튜브내로 피펫하여 2% 태아 송아지 혈청(FCS)을 보충하여 프로테오라시스를 멈추고 세포를 RT에서 220 x g에서 3분 동안 퇴적시하였다.
    4. 상급체를 제거하고 5% FCS 및 1 mM MgSO4로보충된 ECGM의 250 μL에서 HUVEC를 다시 중단한다. Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 계수용 셀 현탁액의 10 μL을 사용하고 5% FCS 및 1 mM MgSO4로보충된 세포 수를 4 x 106 셀/mL ECGM으로 조정합니다.
      참고: 각 유동 실험에 대해 5% FCS로 보충된 ECGM 배지의 30 mL및 1 mM MgSO4가 필요합니다. 여기에서 이 매체 조성물은 ECGMS-매체로 명명된다. 배양 배지에서 FCS 농도의 증가는 채널 슬라이드에서 HUVEC 시드의 세포 부착 및 세포 생존성을 2%에서 5%로 뒷받침한다. 배지 보충제 FCS 및 MgSO4는 전단 응력 조건 하에서 HUVEC의 세포 부착을 실질적으로 안정화시다.
  2. 채널 슬라이드에서 HUVEC를 시드하고 배양합니다. 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 작업하십시오. 세포는 다른 2 시간 동안 박테리아와 현미경 모니터링감염에 이어 2 일 동안 전단 스트레스하에서 경배될 것이다.
    1. 채널 슬라이드, 관류 세트 직경 1.6 mm 및 길이 50cm, ECGMS-매체의 aliquot, 및 루어 채널 슬라이드 0.4 μm 높이, 37°C에서 5%CO2 대기를 가진 인큐베이터에서 24시간 동안 기포 수를 감소시킴.
      참고: 이 절차는 플라스틱 장비를 탈기하고 매체, 관류 튜브 및 저수지를 미리 데우는 것이 좋습니다. 재료 나 액체가 RT 또는 냉장고에 저장된 경우, 플라스틱및 액체에 용해 된 기체는 실험 중에 인큐베이터에서 가열 될 때 방출됩니다. 그러면 기포가 나타납니다. 실험 전에 모든 플라스틱 부품을 탈기하면 이 효과가 제거됩니다. 시스템이 인큐베이터에서 꺼날 때마다 가스 흡수 과정이 다시 시작됩니다. 따라서 RT에서 신속하게 작업하고 더 긴 기간 동안 인큐베이터 외부에 유체 단위를 두지 마십시오.
    2. 피펫을 사용하여 2% 멸균 여과된 돼지 젤라틴 용액100 μL을 PBS 용액에 온도 평형 채널 슬라이드의 저장소 중 하나에 주입합니다. 젤라틴 용액을 37°C에서 1시간 동안 배양하고 1 mL 루어 주사기를 사용하여 멸균 조건하에서 1 mL PBS로 슬라이드의 채널을 헹구십시오.
    3. 얇은 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트에 젤라틴 코팅 채널 슬라이드를 놓아 슬라이드 온도가 떨어지는 것을 방지합니다. 1mL 루어 주사기를 슬라이드에넣고 4 x 10 6/mL HUVEC 서스펜션 100 μL을 추가합니다.
      참고: 깨끗한 벤치의 차가운 금속 표면에 채널 슬라이드를 배치하면 슬라이드 바닥의 온도를 감소시켜 내피 세포에 차가운 스트레스를 발생시킬 수 있습니다. 셀 파이펫팅 중에 슬라이드를 약간 위쪽으로 잡고 기포가 상승하고 슬라이드 내부에서 사라지게합니다.
    4. 37°C 및 5%CO2에서 HUVEC로 60분 동안 채널 슬라이드를 인큐베이션하고 채널 슬라이드의 양 단부에서 배지 저장소를 각각 60 μL ECGMS-medium로 채웁니다. 37 °C및 5%CO2에서1시간 동안 배양합니다.
  3. 미세 유체 펌프와 소프트웨어 설정을 조정합니다.
    1. 평형 관류 세트를 펌프 장치에 연결하고 ECGMS-medium 의 13.6 mL로 채우고 펌프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 유체 단위 설정 메뉴에서 창을 아래로 스크롤하여 적절한 관류 세트와 챔버 슬라이드 유형을 선택합니다. 중간 점도에 대한 소프트웨어에서 0.007 (dyn∙s/cm2)을 선택합니다. (보조 그림 1에서빨간색 화살표로 표시된 압력 펌프 소프트웨어 설정을 참조하십시오.)
    2. 인큐베이터 외부에서 건조 실리카 비드로 채워진 유리 병을 공기 압관에 연결합니다(그림 1, 인세트 3참조). 압력 펌프의 공기는 관류 저장소와 펌프 사이에서 순환하며 펌프 장치에 다시 들어가기 전에 건조되어야 합니다. 소프트웨어 메뉴에서 흐름 매개변수를 선택하고 압력을 40mbar로 설정하고 연속 중간 흐름을 시작하여 액체 매체로 펌프 튜브를 플러시합니다. (이러한 설정은 추가 그림 1의빨간색 화살표로도 표시됩니다.)
    3. 흐름 재배의 원하는 전단 응력 주기를 프로그래밍합니다. 5 dyn/cm2로시작하여 균형 잡힌 저수지 pumpinng을 제어하고 펌프 시스템에서 기포가 순환하지 않도록하십시오.
      참고: 채널 슬라이드의 벽 전단 응력은 관류 매체의 유량 및 점도에 따라 달라집니다. 다른 펌프 시스템을 사용하는 경우, 원하는 전단 응력 레벨을 생성하는 유량을 설정하기 위해 소개에 설명된 방정식을 참조하십시오. 설명된 설정은 5.42 mL/min.의 유량에 해당합니다(압력 펌프 소프트웨어에서 적절한 유동 파라미터 설정을 보여주는 예시적인 스크린 샷은 보충 도 2에나와 있습니다).
    4. 펌프 제어 소프트웨어의 흐름 순환을 중지하고 Luer 연결 부근의 튜브를 클램핑하여 관류 튜브의 중간 흐름을 유지합니다. 채널 슬라이드를 연결하여 기포를 피하고, 연결된 채널 슬라이드를 37°C 및 5%CO2에서CO2 인큐베이터에 놓습니다. 전단 응력 레벨을 가속화하기 전에 전단 응력에 의해 생성된 힘에 세포를 원활하게 적응시키기 위해 30분 동안 5dyn/cm2에서 전단 응력을 시작합니다(보충 그림 3참조).
      참고: 흐름에 기포의 움직임이 세포 분리로 이어질 수 있기 때문에 튜브 시스템 또는 튜브 시스템에 연결 한 후 슬라이드에 기포가 남아 있지 않습니다주의하십시오.
    5. 전단 응력10 dyn/cm2(이 흐름 설정에서 10.86 mL/min에 해당)로 가속하고 37°C에서 작은CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 연속 전단 응력으로 채널 슬라이드를 배양하여 세포 분화를 허용합니다( 각 소프트웨어 세팅은 보조 그림 4)에서빨간색 화살표로 표시됩니다.
      참고: HUVEC 세포는 흐름 재배가 직접 10 dyn/cm2에서시작되는 경우 채널 표면에서 분리되는 경향이 있습니다. 유동 재배가 최소 30분 동안 5dyn/cm2를 사용하여 적은 전단 응력으로 시작되고 원하는 10 dyn/cm2까지 천천히 전단응력증가를 증가시키면 세포는 챔버 표면에 부착된 상태로 유지된다. VWF 스트링 형성에 필요한 이 관류 설정에서 10dyn/cm2의 전단 응력은 최소 값입니다.
    6. 24시간 동안 미세유체 세포 재배를 한 후, 두 중간 저수지에서 균형 잡힌 중간 수준에 도달하면 펌프 제어 소프트웨어로 중간 흐름을 중지하십시오. 유체 단위를 깨끗한 벤치에 놓고 10 mL의 혈청학적 파이펫을 사용하여 관류 저장소의 순환 재배 매체의 10 mL를 제거합니다. 10 mL의 ECGMS-medium을 저장소에 추가하여 매질을 갱신하고, 유체 단위를 37°C 및 5%CO2에서CO2 인큐베이터에 다시 넣고, 펌프 제어 소프트웨어를 사용하여 유체 재배를 다시 시작합니다.
      참고: 압력 펌프의 기능은 큰 원심분리기와 같은 실험실 기계에 의해 갑자기 중단될 수 있으며, 이로 인해 강한 자기장 교란이 발생할 수 있습니다. 이 급격한 중단은 세포 분리로 이끌어 낼 수 있습니다. 실험 중에 압력 펌프 근처에서 이러한 기계가 활성화되지 않도록 주의하십시오.
    7. 현미경 시각화 전에 온도 평형을 위해 37°C로 형광 현미경의 단계를 덮는 온도 인큐베이션 챔버의 사전 온난화를 시작한다. 현미경이 미리 웜화된 후, 현미경 소프트웨어 제어를 시작하고 적절한 필터 설정(RFP 발현 박테리아의 검출을 위한 540 nm/590 nm)을 선택하여 형광 현미경 모니터링을 위한 주요 설정을 조정하고 FITC 컨쥬게이트 VWF 특이적 항체의 플루오레세인 방출 검출을 위한 470 nm/515 nm). 37°C에서 유체 단위의 인큐베이션을 위해 추가가열 챔버를 미리 따뜻하게 한다.
      참고: 감염 분석 및 현미경 모니터링 동안 채널 슬라이드와 순환 매체의 온도는 실질적으로 감소하지 않아야, 이 세포에 차가운 스트레스를 생성하기 때문에. 일반적으로, 현미경 스테이지를 덮는 온도 챔버의 크기는 전체 유체 단위를 커버하기에 충분하지 않다. 따라서 37°C로 미리 가열된 추가 가열 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.
    8. 현미경 시각화를 위해 유체 단위를 37°C 미리 가열 된 가열 챔버에 놓고 채널 슬라이드를 37 °C 미리 온난화 된 현미경의 단계에 놓습니다.
      참고: 현미경 시각화를 위해, 유체 단위 및 채널 슬라이드는 관류 튜브의 제한된 길이로 인해CO2 인큐베이터에서 제거될 필요가 있었다. pH 완충을 위해 5%CO2 대기 밖에서 감염 시간 및 180분 이상의 현미경 모니터링이 필요한 경우, pH 버퍼링 배지를 미세 유체 재배에 사용해야 합니다.
    9. 히스타민과 박테리아를 주입하기 전에 HUVEC 층의 세포 형태및 무결성을 현미경의 밝은 필드 모드를 사용하여 유동 실험을 마친 후 유동 순환을 제어한다.

4. VWF 릴리스 유도 및 멀티머드 VWF 현의 시각화

  1. VWF의 다중화를 최대 200MDa의 긴 스트링으로 트리거하려면 10dyn/cm2의 전단 응력이 필요하기 때문에 흐름 설정을 유지합니다. 내피 WPB로부터 VWF의 방출을 유도하여 100 mM 히스타민 스톡 용액의 136 μL을 주입 포트를 사용하여 관류 튜브에서 순환하는 ECGMS-배지에 주입한다. 유량 배지에서 히스타민의 최종 농도는 1 mM이 될 것이다. 사출 포트를 사용할 수 없는 경우, 히스타민은 펌프 저장소의 매질로 파이펫팅하여 대체로 첨가될 수 있습니다.
  2. 다중 증폭 VWF 현의 면역형 광 검출을 위해, 저수지의 균형 잡힌 중간 수준에 도달하면 흐름을 중지하고, 200 μL PBS (pH 7.4)의 부피에서 VWF 특이적 FITC 컨쥬게이트 항체의 20 μg을 순환 13.6 mL에 주입하십시오. 주입 포트를 사용하는 ECGMS-매체. 사출 포트를 사용할 수 없는 경우, 항체는 펌프 저장소의 매질로 파이펫팅하여 대안적으로 첨가될 수 있다. 이것은 1.3 μg/mL의 최종 항체 농도 귀착됩니다.
  3. 짧은 시간에 여러 시야각을 현미경으로 스캔하는 경우 30%의 전력으로 제논 형광 장치와 에피플루시션 카메라를 사용하여 현미경의 형광 장치를 사용하십시오. 밝은 필드 모드로 HUVEC 레이어의 모양과 형태를 모니터링하여 VWF 문자열 시각화에 적합한 대표 셀을 선택합니다.
  4. 녹색 형광 VWF 문자열의 시각화를 위해 현미경 소프트웨어(LasX)의 형광 단위 메뉴에서 63x/1.40 오일 대물렌즈와 470nm 검출 필터를 선택하십시오. 50개 이상의 대표 필드 뷰의 Z 스택스냅샷을 생성하며, 각 뷰에는 약 10개의 형태학적으로 손상되지 않은 HUVEC가 포함되어 있습니다. 서로 다른 시점에서 녹색 형광 VWF 문자열의 정량화를 위해 여러 시야를 스캔합니다.

5. 실시간으로 흐름에서 VWF 문자열에 세균 부착의 현미경 평가

  1. 면역형광 검출을 통해 HUVEC 세포 표면에서 생성된 VWF 현에 대한 폐렴구균 부착을 정량화합니다.
    1. 유동을 잡고 사출 포트를 사용하여 ECGMS 매체에 최대 부피 1 mL의 1 mL에서 1.35 x 108 CFU/mL RFP 발현 폐렴구균을 주입합니다. 대안적으로, 박테리아를 펌프 저장소 내의 배지 내로 피펫한다. 10 dyn/cm2에서 전단 응력재를 다시 시작하여 박테리아가 펌프 시스템 내에서 순환하도록 합니다.
    2. 현미경 배율을 위한 63x 오일 침지 목표를 선택하고 RFP 발현 폐렴구균 검출을 위해 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널(540 nm 검출 필터)으로 조정합니다.
    3. VWF 문자열에 대한 세균 부착의 정량화를 위해 흐름을 중지하고 최소 30개의 대표 필드 뷰의 Z 스택스냅샷을 생성하며, 각각 약 10개의 형태학적으로 손상되지 않은 HUVEC를 포함하고 폐렴구균의 양을 계산합니다.
    4. ANOVA 1인자 통계 알고리즘을 사용하여 데이터를 평가한 다음 자세한 통계 비교를 위해 포스트 혹 두 꼬리 의 쌍을 이루지 않은 샘플 테스트를 수행합니다. <0.05의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

6. 샘플 고정 후 VWF 문자열에 대한 세균 부착의 현미경 평가

  1. 면역형광 염색 전에 고정을 샘플링합니다.
    1. 흐름을 멈추고 펌프 저장소에서 ECGMS-매체 10 mL를 제거하고 5 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 보충 된 PBS 10 mL을 추가하십시오. PFA 용액이 10 dyn/cm2의전단 응력에서 10 분 동안 순환시키십시오.
    2. 펌프 장치에서 채널 슬라이드를 분리합니다.
  2. 세포 표면에 비특이적 결합 부위를 차단하고 VWF 문자열 및 부착 된 박테리아의 면역 검출을 수행합니다.
    1. 모든 세척 단계에 대해 4% 자당으로 보충된 100 mM Na2CO3(pH 9.2)를 함유하는 세척 용액 4 mL을 준비합니다. 100 mMNa2CO3 (pH 9.2)를 함유하는 차단 용액의 1 mL을 4 % 자당및 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 보충하여 비특이적 결합 부위의 차단을 준비하십시오.
    2. 1 mL 루어 주사기를 사용하여 PFA 배양 채널 슬라이드를 3x 세척하여 세척 용액의 200 μL을 주입하고 200 μL 차단 용액으로 RT에서 120 분 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다.
    3. 항체의 희석을 위해 4% 자당 및 0.5% BSA로 보충된 100 mMNa2CO3,(pH 9.2)를 함유하는 또 다른 차단 용액의 4 mL를 준비한다. 이 차단 용액의 200 μL을 사용하여 폐렴구균 특이적 토끼 항혈전을 희석1:100. VWF 특이적 마우스 항체를 1:50 희석하여 VWF 특이적 항체 농도가 4 μg/mL로 만들기 위해 이 차단 용액의 200 μL을 사용하십시오. 2 mg/mL 스톡 용액에서 AlexaFluor488-컨쥬게이트 이차 항체를 200 μL(pH 7.4)에서 1:100으로 희석하여 최종 농도를 20 μg/mL로 생성합니다.
      참고: 기재된 면역형광 설정에서, 항체 검출은 전술한 알칼리성 탄산염 완충액에서 항체가 희석되었을 때 최적의 결과를 전달한다. 이전 결과에 기초하여, 권장 차단 용액 및 항체의 양은 많은 응용 분야에 적합합니다. 그러나, 상이한 실험은 차단 완충제의 항체 조합, 항체 농도, 배양 시간 및 체화의 개별적인 최적화를 요구할 수 있다. 대안으로서, 중성 pH 범위를 가진 인산염 버퍼링 시스템은 인큐베이션 버퍼로서 적합하거나 심지어 바람직할 수 있다. 형광 신호가 약한 경우 이차 항체의 농도를 증가시켜야합니다. 너무 많은 비특이적 형광 배경 잡음이 감지되면 차단 물질의 양을 늘려야합니다.
    4. VWF-면역형 광형 염색의 경우, 세탁용액의 200 μL을 3x 주입하여 1mL 루어 주사기를 사용하여 채널 슬라이드를 세척하고 RT에서 30분 동안 1:50 희석된 VWF 특이적 항체로 슬라이드를 인큐베이션한 후, 채널 슬라이드를 200으로 다시 3배 세척합니다. μL 세척액을 RT에서 30분 동안 1:100 희석된 AlexaFluor488-컨쥬게이션된 마우스 특이적 항체로 슬라이드를 인큐베이션한다. 마지막으로, 200 μL의 세척 용액으로 채널 슬라이드를 다시 3배 세척합니다.
      참고: 알렉사플루오르형광은 표백에 민감합니다. 따라서, 슬라이드는 형광 공형 항체와 인큐베이션 단계 동안 어두운 챔버에 유지하여 보호되어야한다.
    5. 폐렴구균의 면역 검출을 위해 RT에서 30 분 동안 1 :100 희석 된 폐렴 구균 특이적 토끼 항체로 슬라이드를 배양한 후, 채널 슬라이드를 3x로 세척 용액200 μL로 세척하고 1 :100 희석된 슬라이드를 배양하십시오. AlexaFluor568-컨쥬게이트 토끼 특이적 항체를 RT에서 30분 동안 세척용액의 200 μL로 다시 3x 세척한다.
    6. 형광 성 파할로이드로 세포 세포 골격을 염색하려면 RT에서 5 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100의 120 μL로 배양하여 HUVEC를 투과시켜 세척 용액의 200 μL로 채널 슬라이드를 3x 씻고 120 μL의 120 μL로 슬라이드를 배양하십시오. 알렉사플루오르350-컨쥬게이드 팔로이드. 이 배양 단계는 중합된 세포골격을 시각화하고 세포 모양및 가능한 스트레스 유발 형태학적 변화의 모니터링을 허용한다.
    7. 세척 용액의 200 μL로 채널 슬라이드를 3x 세척하십시오. 마지막으로, 슬라이드를 200 μL ddH2O로 4x 세척하고 형광 현미경에 적절한 필터 설정을 사용하여 녹색 형광 VWF 현, 적색 형광 박테리아 및 청색 형광 액틴 세포 골격을 시각화합니다.

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결과

일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF13,14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.

이 시스템은 소프트웨어가 제어하는 흐름 조건을 정의하여 설정할 수 있습니다. 도 1의 흐름 방식은 1차 내피 세포의 전문화(도1,인셋 1)와 폐렴구균의 전생(그림1,인셋 2)으로 시작하는 주요 워크플로우를 도시한다. 적용된 미세유체 시스템(그림

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토론

VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양모델(17)의주요 측면을 요약한다.

미세 유체 기술은 1990 년대 초에 마이크로 미터와 심지어 나노 미터 규모18에서제어, 재현 성 및 투과 성 미세 환경의 개발로 시작된 매우 젊은 기술입니다. 제시된 미세 유체 접근법은 또한 광범위한 세균 접착 메커니즘 및 관련 단백질을 연구하기 위해 적용될 수 있다. VWF와 같은 메카노 반응 접착 성분을 포함하는 모든 상호 작용에 가장 적합하며, 일반적으로 표준 세포 배양 기술을 사용하여 접근할 수 없습니다. 예를 들어...

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공개 사항

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감사의 글

이 프로젝트는 DFG (BE 4570/4-1)에 의해 S.B에 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL 루어-시린Fisher Scientific10303002슬라이드의 루어 연결을 사용한 젤라틴 주입용 1 mL
mL 루어-주사기Sarstedt9077136채널 챔버 슬라이드의 루어 연결부에 유체를 피켤팅/주입하기 위해
AccutaseeBioscience now Thermo Fisher00-4555-56프로테아제 믹스 내피 세포의 부드러운 분리에 사용
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751제조업체에서 사용할 수 있는 농도 없음, 재고 용액은 300 tets에 충분하며 회사는 100 µ를 사용하는 것이 좋습니다. L 1:1,000 희석, 청색 형광(DAPI 필터 설정)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse anti-bodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011스톡 농도: pFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 폐렴구균의 면역 염색을 위한 2mg/mL, 적색 형광
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210복합 박테리아 배양 배지
소 혈청 알부민(BSA)Sigma AldrichA2153-25G가용, 차단 완충액
필터가 있는 세포 배양 플라스크TPP9002625 cm2 표면의 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 HUVEC subcultivation
원심분리기 Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304박테리아 방사(>2mL 부피)
원심분리기 Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314진핵 세포 방사
원심분리기 Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 M박테리아의 회전 감소 (2 mL 미만의 부피)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2색 형광 단백질과 클로람페니콜 내성 카세트를 운반하는 유전자 구조로 변형 된 폐렴 구균의 배양을 위해 0.2 mg / mL의 농도로 사용
류 튜브 용 클램프ibidi10821슬라이드를 펌프 시스템에 연결하기 전에 튜브에 액체를 보관
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40인큐베이터 크기는 연결된 채널 슬라이드가 있는 유체 장치의 크기에 완벽하게 맞게 조정되었으며 37°C에서 흐름 배양에 사용되었습니다. C 및 5 % CO2< / sub>
CO2< / sub>-IncubatorSanyoMCO-18 AIC5 % CO2< / sub> 및 37 °에서 정의 된 대기에서 박테리아 및 세포의 배양; C
콜롬비아 혈액 한천 플레이트Becton Dickinson GmbHPA-254005.06S. 폐렴용 한천 기반 복합 배양 배지에 7% 양 혈액
보충 압력DellLatitude 3440Comuter
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)LeicaDMi8가열 가능한 챔버로 덮인 스테이지와 형광 필터, 제논 광원(SP8, DMi8) 및 DFC 365 FX 카메라(1392 x 1040, 1.4 메가픽셀)
Di 인산수소칼륨(KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, 칼스루에3904.1PBS 완충액에 사용
건조 재료Merck101969오렌지 실리카 비드 건조용 튜브 어댑터와 함께 유리병에 사용
ECGM 보충제 믹스ECGM 매체용 PromocellC-39215보충제 믹스: 0.02mL/mL 태아 송아지 혈청, 0.004mL/mL 내피 세포 성장 보충제, 0.1ng/mL 표피 성장 인자, 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자, 90 &마이크로; g/mL 헤파린, 1 &마이크로; g/mL 하이드로코르티손
ECGMSPromocellC-22010ECGM 세포 접착력을 증가시키기 위해 5 % [w/w] FCS 및 1 mM MgSO4 보충
피 세포 성장 배지(ECGM, 즉시 사용 가능)HUVEC의 PromocellC-22010배양 배지, 이미 보충제 믹스의 모든 구성 요소가 보충됨
태아 송아지 혈청(FCS)바이오크롬 현재 MerckS 0415감염 분석에 사용되는 세포 배양을 위한 보충제
FITC-conjugated goat anti-human VWF 항체Abcamab8822스톡 농도: 10 mg/mL, 유동 중 구형 및 다중합체 VWF의 면역검출용
유체 단위ibidi10903유동 배양을 위한 유체 장치
젤라틴(돼지)Sigma AldrichG-1890-100g마이크로슬라이드 채널 표면의 사전 코팅용
히스타민 디하이드로클로라이드시그마 알드리치H-7250-10MG내피 내에서 VWF 분비 유도 Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z0421 차 내피 세포 풀링 된 기증자에서 액체 질소에 보관
인간 VWF 특이 항체 (단클론)Santa Cruzsc73268재고 농도 : 200 µ PFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 VWF의 면역 염색을 위한 g/mL
주입 Portibidi10820흐름 순환 중 저장소 튜브에 히스타민 또는 박테리아 주입
광학 현미경ZeissAxiovert 35M반광 현미경: 40x 물 대물렌즈를 사용하여 진핵 세포 분리 및 세포 계수 제어, 400배 배율 허용
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176fludic 재배를 위한 물리적으로 변형된 슬라이드 (μ – 채널 높이가 0.4mm이고 채널 볼륨이 100>인 슬라이드 I0.42) 모든 종류의 유동 분석에 적합, 물리 처리는 친수성 및 접착성 표면을 생성합니다.
황산마그네슘(MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GECGMS 매체
미세유체 펌프제조용 ibidi10905기압 펌프
Neubauer 세포 계수 챔버Karl Hecht GmbH& Co KG40442002HUVECs
Paraformaldehyde 16 % (PFA)샘플의 교차 연결을위한전자 현미경 검사 과학15710-S
관류 세트ibidi10964관류 세트 황색 / 녹색은 튜브 직경 1.6mm, 튜브 길이 50cm, 총 작업 부피 13.6mL, 데드 튜브 부피 2.8mL 및 저장소 크기 10mL. µ-slide L0.4Luer와 결합, 37 °에서; C 및 점도 0.0072 dyn x s/cm2 3.8mL/min의 유속 범위 최대 33.9mL/min, 3.5dyn/cm2 및 31.2dyn/cm2 사이의 전단 응력에 도달할 수 있습니다. microfluidic
인산염 완충 식염수 (PBS)로 해결책은 뒤에 오는 화학물질을 사용하여 준비되었다: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4, pH 7.4
플라스틱 큐벳Sarstedt67,741(2 x 광학) 600nm
폐렴구균 특이적 항혈청Pineda열 비활성화 연쇄상구균 폐렴균 NCTC10319 및 D39, proteinA-sepharose 컬럼을 사용하여 IgG 정제.
폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트이것은 채널 슬라이드에 파종된 세포에 대한 차가운 스트레스를 피하기 위한 예방 조치입니다. 포장 상자 재료와 같은 모든 유형의 스티로폼을 사용할 수 있습니다. 접시의 두께는 0.5cm일 수 있으며 크기는 20cm2이어야 합니다.
염화칼륨 (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1PBS 버퍼에 사용
펌프 제어 소프트웨어 (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4압력 펌프 제어, 흐름 조건 설정 및 흐름 시작 / 종료를위한 컴퓨터 소프트웨어
튜브 1.5 / 2.0 mLSarstedt72.706 / 72.695.500항체 희석에 필요
50 mL의 반응 튜브 volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319게놈에 통합된 히스톤과 같은 단백질에 융합된 RFP를 발현하는 연쇄상구
청형 47 혈청학적 피펫 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025대용량
파이핑용탄산나트륨 (Na2CO3, 물 없음)Sigma Aldrich451614-25G100 mM 탄산나트륨 완충
인산이수소나트륨 (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2PBS 버퍼에 사용
스펙트럼 광도계 Libra S22Biochrom80-2115-20600nm에서 박테리아 현탁액의 광학 밀도(OD) 측정
차단 완충액 준비를 위한SucroseSigma AldrichS0389-500G
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLPFA 고정 후 진핵 세포 투과화를 위해 dH20으로 희석된 0.1% 말단 농도에 사용
효모 추출물옥소이드LP0021박테리아는 1 % [w / w] 효모 추출물 = 완전한 박테리아 배양 배지 THY를 함유 한 THB 보충제에서 배양됩니다
지 용량의 2 준비용 적관하기위한 ibidi 10821 펌프 소프트웨어가 있는 컴퓨터 내피 세포의 배양에 필요한 내 된 : 용 현미경 계수 챔버 를 위한 50 cm 길이에서 OD 측정을 위한 : 반응 균 폐렴균 혈액 제조용 .

참고문헌

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