일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Hilger Jagau; Ina-Kristin Behrens; Michael Steinert; Simone Bergmann

doi:10.3791/60323

방법 논문

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

DOI:

10.3791/60323

⸱

2019년 10월 31일

Hilger Jagau¹^,² , Ina-Kristin Behrens¹^,³ , Michael Steinert¹^,⁴ , Simone Bergmann¹

¹Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, ²Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, ³Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, ⁴Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

이 논문에서

요약

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본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

초록

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내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.

이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.

서론

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폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF ^1,^2와^{같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3}^,⁴,⁵^,⁶^,⁷^,⁸. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다^9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병^10에의해 입증됩니다.

구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL^11,

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프로토콜

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미세유체 세포 배양은 상업적인 일차인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 수행하였다. 회사는 기증자의 통보된 동의를 가진 세포를 고립시되었습니다. 이 연구는 참조 번호 와 연방 주 바덴 - 뷔르템베르크의 의사 상공 회의소의 윤리위원회에 의해 승인되었다 219-04.

참고: 프로토콜 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오.

1. 1 차 내피 세포의 사전 육성

37°C에서 3개의 다른 공여자로부터 1 x 10^515차 HUVEC를 함유하는 냉동 글리세롤 바이알을 해동시키고, 25 cm² 세포 플라스크에서 7 mL의 내피 세포 성장 배지(ECGM, 보충제와 함께 사용할 준비)로 세포를 종자하였다.
참고: 1 차적인 내피 세포는 5 개 이상의 증식 주기 후에 분화 능력을 분실합니다. 따라서 5개 미만의 대지나 높은 등급의 세포 분화가 필요한 경우에만 사용할 수 있습니다.
37°C에서 세포를 5%_CO2 대기에서 60분 동안 배양하여 표면 부착을 허용하고 ECGM 세포 배양 배지를 교환하여 극저온 보존으로부터 잔류물을 제거....

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결과

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일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF^13,^14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.

이 시스템은 소프트웨어가 제어하는 흐름 조건을 정의하여 설정할 수 있습니다. 도 1의 흐름 방식은 1차 내피 세포의 전문화(도1,인셋 1)와 폐렴구균의 전생(그림1,인셋 2)으로 시작하는 주요 워크플로우를 도시한다. 적용된 미세유체 시스템(그림

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토론

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VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양^{모델(17)의}주요 측면을 요약한다.

미세 유체 기술은 1990 년대 초에 마이크로 미터와 심지어 나노 미터 규모^18에서제어, 재현 성 및 투과 성 미세 환경의 개발로 시작된 매우 젊은 기술입니다. 제시된 미세 유체 접근법은 또한 광범위한 세균 접착 메커니즘 및 관련 단백질을 연구하기 위해 적용될 수 있다. VWF와 같은 메카노 반응 접착 성분을 포함하는 모든 상호 작용에 가장 적합하며, 일반적으로 표준 세포 배양 기술을 사용하여 접근할 수 없습니다. 예를 들어.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 프로젝트는 DFG (BE 4570/4-1)에 의해 S.B에 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 루어-시린	Fisher Scientific	10303002	슬라이드의 루어 연결을 사용한 젤라틴 주입용 1 mL
mL 루어-주사기	Sarstedt	9077136	채널 챔버 슬라이드의 루어 연결부에 유체를 피켤팅/주입하기 위해
Accutase	eBioscience now Thermo Fisher	00-4555-56	프로테아제 믹스 내피 세포의 부드러운 분리에 사용
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	제조업체에서 사용할 수 있는 농도 없음, 재고 용액은 300 tets에 충분하며 회사는 100 µ를 사용하는 것이 좋습니다. L 1:1,000 희석, 청색 형광(DAPI 필터 설정)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse anti-body	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	스톡 농도: pFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 폐렴구균의 면역 염색을 위한 2mg/mL, 적색 형광
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	복합 박테리아 배양 배지
소 혈청 알부민(BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	가용, 차단 완충액
필터가 있는 세포 배양 플라스크	TPP	90026	25 cm² 표면의 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 HUVEC subcultivation
원심분리기 Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	박테리아 방사(>2mL 부피)
원심분리기 Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	진핵 세포 방사
원심분리기 Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	박테리아의 회전 감소 (2 mL 미만의 부피)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	색 형광 단백질과 클로람페니콜 내성 카세트를 운반하는 유전자 구조로 변형 된 폐렴 구균의 배양을 위해 0.2 mg / mL의 농도로 사용
류 튜브 용 클램프	ibidi	10821	슬라이드를 펌프 시스템에 연결하기 전에 튜브에 액체를 보관
CO₂-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	인큐베이터 크기는 연결된 채널 슬라이드가 있는 유체 장치의 크기에 완벽하게 맞게 조정되었으며 37°C에서 흐름 배양에 사용되었습니다. C 및 5 % CO_{2< / sub>}
CO_{2< / sub>-Incubator}	Sanyo	MCO-18 AIC	5 % CO_{2< / sub> 및 37 °에서 정의 된 대기에서 박테리아 및 세포의 배양; C}
콜롬비아 혈액 한천 플레이트	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	S. 폐렴용 한천 기반 복합 배양 배지에 7% 양 혈액
보충 압력	Dell	Latitude 3440	Comuter
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)	Leica	DMi8	가열 가능한 챔버로 덮인 스테이지와 형광 필터, 제논 광원(SP8, DMi8) 및 DFC 365 FX 카메라(1392 x 1040, 1.4 메가픽셀)
Di 인산수소칼륨(KH₂PO₄)	Carl Roth GmbH + Co. KG, 칼스루에	3904.1	PBS 완충액에 사용
건조 재료	Merck	101969	오렌지 실리카 비드 건조용 튜브 어댑터와 함께 유리병에 사용
ECGM 보충제 믹스	ECGM 매체용 Promocell	C-39215	보충제 믹스: 0.02mL/mL 태아 송아지 혈청, 0.004mL/mL 내피 세포 성장 보충제, 0.1ng/mL 표피 성장 인자, 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자, 90 &마이크로; g/mL 헤파린, 1 &마이크로; g/mL 하이드로코르티손
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM 세포 접착력을 증가시키기 위해 5 % [w/w] FCS 및 1 mM MgSO₄ 보충
피 세포 성장 배지(ECGM, 즉시 사용 가능)	HUVEC의 Promocell	C-22010	배양 배지, 이미 보충제 믹스의 모든 구성 요소가 보충됨
태아 송아지 혈청(FCS)	바이오크롬 현재 Merck	S 0415	감염 분석에 사용되는 세포 배양을 위한 보충제
FITC-conjugated goat anti-human VWF 항체	Abcam	ab8822	스톡 농도: 10 mg/mL, 유동 중 구형 및 다중합체 VWF의 면역검출용
유체 단위	ibidi	10903	유동 배양을 위한 유체 장치
젤라틴(돼지)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	마이크로슬라이드 채널 표면의 사전 코팅용
히스타민 디하이드로클로라이드	시그마 알드리치	H-7250-10MG	내피 내에서 VWF 분비 유도 Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	1 차 내피 세포 풀링 된 기증자에서 액체 질소에 보관
인간 VWF 특이 항체 (단클론)	Santa Cruz	sc73268	재고 농도 : 200 µ PFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 VWF의 면역 염색을 위한 g/mL
주입 Port	ibidi	10820	흐름 순환 중 저장소 튜브에 히스타민 또는 박테리아 주입
광학 현미경	Zeiss	Axiovert 35M	반광 현미경: 40x 물 대물렌즈를 사용하여 진핵 세포 분리 및 세포 계수 제어, 400배 배율 허용
Luer-slides I_0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	fludic 재배를 위한 물리적으로 변형된 슬라이드 (μ – 채널 높이가 0.4mm이고 채널 볼륨이 100>인 슬라이드 I^0.42) 모든 종류의 유동 분석에 적합, 물리 처리는 친수성 및 접착성 표면을 생성합니다.
황산마그네슘(MgSO₄, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	ECGMS 매체
미세유체 펌프	제조용 ibidi	10905	기압 펌프
Neubauer 세포 계수 챔버	Karl Hecht GmbH& Co KG	40442002	HUVECs
Paraformaldehyde 16 % (PFA)	샘플의 교차 연결을위한	전자 현미경 검사 과학	15710-S
관류 세트	ibidi	10964	관류 세트 황색 / 녹색은 튜브 직경 1.6mm, 튜브 길이 50cm, 총 작업 부피 13.6mL, 데드 튜브 부피 2.8mL 및 저장소 크기 10mL. µ-slide L0.4Luer와 결합, 37 °에서; C 및 점도 0.0072 dyn x s/cm² 3.8mL/min의 유속 범위 최대 33.9mL/min, 3.5dyn/cm² 및 31.2dyn/cm² 사이의 전단 응력에 도달할 수 있습니다. microfluidic
인산염 완충 식염수 (PBS)			로 해결책은 뒤에 오는 화학물질을 사용하여 준비되었다: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na₂HPO₄, 0.24 g/L KH₂PO₄, pH 7.4
플라스틱 큐벳	Sarstedt	67,741	(2 x 광학) 600nm
폐렴구균 특이적 항혈청	Pineda		열 비활성화 연쇄상구균 폐렴균 NCTC10319 및 D39, proteinA-sepharose 컬럼을 사용하여 IgG 정제.
폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트			이것은 채널 슬라이드에 파종된 세포에 대한 차가운 스트레스를 피하기 위한 예방 조치입니다. 포장 상자 재료와 같은 모든 유형의 스티로폼을 사용할 수 있습니다. 접시의 두께는 0.5cm일 수 있으며 크기는 20cm²이어야 합니다.
염화칼륨 (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	PBS 버퍼에 사용
펌프 제어 소프트웨어 (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	압력 펌프 제어, 흐름 조건 설정 및 흐름 시작 / 종료를위한 컴퓨터 소프트웨어
튜브 1.5 / 2.0 mL	Sarstedt	72.706 / 72.695.500	항체 희석에 필요
50 mL의 반응 튜브 volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	게놈에 통합된 히스톤과 같은 단백질에 융합된 RFP를 발현하는 연쇄상구
청형 47 혈청학적 피펫 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	대용량
파이핑용탄산나트륨 (Na₂CO₃, 물 없음)	Sigma Aldrich	451614-25G	100 mM 탄산나트륨 완충
인산이수소나트륨 (NaH₂PO₄)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	PBS 버퍼에 사용
스펙트럼 광도계 Libra S22	Biochrom	80-2115-20	600nm에서 박테리아 현탁액의 광학 밀도(OD) 측정
차단 완충액 준비를 위한	Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	PFA 고정 후 진핵 세포 투과화를 위해 dH₂0으로 희석된 0.1% 말단 농도에 사용
효모 추출물	옥소이드	LP0021	박테리아는 1 % [w / w] 효모 추출물 = 완전한 박테리아 배양 배지 THY를 함유 한 THB 보충제에서 배양됩니다

지 용량의 2 준비용 적관하기위한 ibidi 10821 펌프 소프트웨어가 있는 컴퓨터 내피 세포의 배양에 필요한 내 된 : 용 현미경 계수 챔버 를 위한 50 cm 길이에서 OD 측정을 위한 : 반응 균 폐렴균 혈액 제조용 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152

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서론

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