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방법 논문

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

5.3K 조회수

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DOI:

10.3791/60324

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2020년 8월 19일

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1Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Department of Pathology, Radboud University Medical Center, 2Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Amalia Children's Hospital, Department of Paediatric Nephrology, Radboud University Medical Center, 3Radboud Institute for Health Sciences, Department of Nephrology, Radboud University Medical Center, 4Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Department of Nephrology, Radboud University Medical Center

이 논문에서

요약

이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

정수리 상피 세포 (PEC) 활성화는 글로메룰로오스 경화증의 개발 및 진행에 관여하는 주요 요인 중 하나입니다. 따라서 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로의 억제는 구엽 질병의 진행을 감쇠하는 도구가 될 수 있습니다. 이 문서에서는 마우스 신장으로부터 분리된 캡슐화된 사구류의 정수리 상피 세포 내 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 고립 된 마우스 신장을 해부 한 후, 조직은 다진, 그리고 사구는 체질에 의해 격리된다. 캡슐화된 사구는 수집되고, 단일 사구는 정수리 상피 세포의 구체 배설물 성장을 얻기 위해 6 일 동안 배양된다. 이 기간 동안, 정수리 상피 세포 증식 및 이동은 세포 수 또는 성장하는 세포의 표면적을 결정함으로써 분석될 수 있다. 이 분석은 그러므로 형질 전환기 또는 녹아웃 마우스에 있는 변경한 유전자 발현의 효력 또는 정수리 상피 세포 성장 특성 및 신호에 배양 조건의 효력을 연구하기 위하여 공구로 이용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 정수리 상피 세포 활성화 과정에 관여 하고 결과적으로 구체 로메로클로증에서 관련 된 중요 한 경로 연구 될 수 있다.

서론

구체 질환은 신장 질환의 중요한 그룹이며 말기 신장 질환 (ESRD)의 주요 원인을 나타냅니다. 불행히도, 특정 치료 옵션은 제한적이며 ESRD로의 진행은 불가피합니다. 구체 질환은 사구체 손상의 존재에 의해 정의되며 염증 성 및 비 염증 성 질환으로 그룹화 될 수 있습니다. 초기 모욕은 다르지만, 최근 연구에 따르면 일반적인 세포 메커니즘은 사구성 상피 세포 증식으로 이어지며 궁극적으로 모든 사구형 질환에서 사구체 경화증으로 이어지며 근본 원인11,2,,3,,4에관계없이.

구체적으로, 구체류경화성 병변은 주로 활성화된 정수리 성 상피 세포5,,6로구성된 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서, 정수리 상피 세포는 구체의 Bowman의 캡슐을 줄 이는 평평한 정지 상피 세포입니다. 그러나, 유전적 돌연변이(예를 들어, 포도세포 특이적 또는 미토콘드리아 세포병리학), 염증 또는 과여과(예를 들어, 신장 질량 감소, 고혈압, 비만 또는 당뇨병 성 멜리터스)으로 인한 모든 구체 손상은 정수리 세포의 활성화를 시작할 수 있다. 활성화된 정수리 상피 세포는 세포 초승달 또는 경화 병변의 형성을 초래하는 세포외 매트릭스를 증식하고 증착하고예금5,,7,,8. 이러한 프로세스의 진행은 신장 기능9의손실을 초래한다. 따라서, 정수리 상피 세포 활성화는 염증성 및 비염증성 구엽기 질환1,,2,,3,,4,,10모두에서 사구체 경화증의 발달 및 진행에 중요한 요소입니다.

정수리 상피 세포 활성화를 중재하는 분자 과정은 여전히 크게 알려지지 않았습니다. 최근 연구에 따르면 활성화된 정수리 상피 세포 드 노보 익스프레스 CD44, 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 다른 경로의 활성화에 중요한 수용체. 더욱이, CD44의 억제는 정수리 상피 세포 활성화를 억제하고 염증성 뿐만 아니라 비염증성 구엽기질환(11,,12)의동물 모델에서 초승달 형성 및 구종증의 진행을 감쇠시키는 것으로 나타났다.

정수리 상피 세포 활성화는 사구체 경화증과 초승달 형성의 발달을위한 핵심 플레이어이기 때문에, 이 세포의 억제는 사구형 질병의 진행을 감속할 수 있었습니다. 정수리 상피 세포 활성화를 구동 하는 분자 경로의 용해성 구엽 질환에서 초플라스틱 및 구체 성 병 변의 형성을 감쇠 특정 치료 개입의 개발로 이어질 수 있습니다.

실험적인 동물 모델에서는, 정수리 상피 세포에 변경된 유전자 발현(녹아웃 모델 또는 형질전환 마우스 모형) 또는 약물 치료의 직접적인 효력에 대한 증거를 제공하기가 빈번하게 어렵습니다. 기존의 녹아웃 마우스에서 생체 내에서 관찰된 생체 내 변화는 정수리 상피 세포의 직접적인 변화에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 유전자 발현은 마우스 내의 다른 세포 유형에서도 변경되기 때문에, 다른 세포 유형에 의해 매개되는 간접적인 효력을 배제할 수 없다. 정수리 상피 세포에서 주로 활성 프로모터에 의해 구동 조건부 cre-lox 마우스의 개발은 어떤 경우에는 용액을 제공하고있다 13. 그럼에도 불구하고 조건부 형질 전환 모델은 복잡하고 더 많은 조건부 라인을 사용할 수 있지만, 기존의 녹아웃 또는 형질전환 마우스 라인의 많은 경우 아직 조건부 대체가 없습니다.

정수리 상피 세포에 대한 직접적인 효과를 연구하기 위해 우리 그룹은 정수리 상피 세포 증식 및 이동을 측정하고 분석하기 위해 마우스 신장에서 분리 된 단일 캡슐형 사구를 사용하여 전 생체 분석기를 개발했습니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 특정 효과를 결정하고 정수리 상피 세포 활성화 및 테스트 치료 옵션에 대한 책임있는 경로를 찾을 수 있게 해 주어 이 활성화를 억제할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 라드부드 대학 니메겐의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다.

참고: 치료되지 않은 건강한 야생형(WT) 마우스(n=4) 및 cd44/----(n=4) 마우스는 12-16주의 나이에 희생하였다. 남성과 여성 마우스 모두 사용 되었다. 모든 마우스는 C57Bl/6 배경에 있었다.

1. 마우스 신장 해부

  1. 자궁 경부 탈구에 의해 건강한 WT 마우스 또는 유전적으로 변경된 마우스를 희생하십시오.
  2. 마우스를 희생한 직후 전체 마우스 신장을 해부합니다. 이를 위해 복부 가위를 사용하여 중앙 복강경 절제술을 수행하여 피부를 절단한 다음 복부 근육을 절단하십시오. 내장을 제거하고 마우스 옆에 놓습니다.
  3. 조직을 연결에서 신장을 자유롭게하고 외과 적 집게를 사용하여 신장을 당겨, 가위로 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단.
  4. 외과 용 집게로 신장을 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 캡슐을 벗어 신장에서 신장 캡슐을 제거하십시오.
  5. 신장을 6웰 세포 배양 플레이트(신장 2개/웰)에 넣고 잘 정한 2mL의 행크스 균형 잡힌 염액(HBSS)으로 준비하여 얼음 위에 놓습니다.

2. 마우스 신장에서 구두를 분리

  1. 신장을 100mm 페트리 접시로 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 신장을 1-2mm의 작은 조각으로 다진다. 다진 신장 조각을 HBSS 의 1-2 mL를 사용하여 젖은 상태로 유지하십시오.
  2. 다진 신장 조각을 300 μm 금속 체 위에 놓고 20mL 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. HBSS로 체를 반복적으로 헹노려 서학적 파이프를 사용하여 깨끗한 페트리 접시에서 흐름을 수집합니다. 또한 메스로 긁어 내어 체의 바닥에 남아 /스틱 모든 것을 수집하고 수집 된 흐름을 통해 (신장 동종)으로 전송합니다.
  3. HBSS를 가진 75 μm 체를 통해 신장 균모를 헹구는. 흐름을 수집하고 53 μm 체를 통해이 흐름을 헹신다. HBSS를 사용하여 두 체를 모두 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다.
    참고: 이 단계에서흐름은 헹지만 75 μm 및 53 μm 체를 통해 압착되지 않습니다. 체에 파편과 작은 구조를 제거하기 위해 HBSS로 세척이 필요합니다. 따라서 일반적으로 HBSS의 200-300 mL은 총으로 사용된다.
  4. 75 μm 및 53 μm 체에 남아 있는 신장 구조/물질을 덜벡코의 변형된 이글 배지(DMEM)로 체의 상부 표면을 세척하여 20%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충하고 물질을 6웰 초저 부착 마이크로플레이트로 옮기는다.
    참고: 체의 상부 표면을 세척하려면 체를 기울어진 위치(>45°)로 헹구고 체 가장자리에서 신장 물질을 수집합니다. 수집된 재료는 캡슐화뿐만 아니라 캡슐화된 구체로 메물리로 보강되어 몇 개의 관 부조각만 표시됩니다. 캡슐화된 구성술은 매우 끈적끈적합니다. 따라서 단일 구엽을 수집하려면, 따라서 페트리 접시 또는 웰 플레이트의 표면에 부착 하는 구체를 방지 하는 것이 중요 하다. 준수를 방지하려면 20% FCS가 있는 배지를 사용하고 이 단계에 초저 부착 플레이트를 사용하십시오.

3. 사구형 의 배양

  1. 초저 부착 마이크로플레이트를 반전된 광 현미경으로 가져와 캡슐화된 단일 캡슐화 및/또는 20μL 파이펫으로 캡슐화된 구광을 수집합니다. 다른 구조물과 파편을 피하십시오. 파이펫 팁에서 단일 구두를 수집한 후 동일한 파이펫 팁에 수집된 신장 물질 없이 신선한 DMEM 배지를 20μL의 부피에 추가합니다.
  2. 20 μL DMEM 배지를 24웰 세포 배양판의 중심으로 단일 소구체를 전송하고 37°C및 5% (v/v)CO2에서 3시간 동안 배양하여 음의 중앙으로 구생물을 부착할 수 있도록 한다. 음구체의 부동을 피하기 위해 조심스럽게 접시를 이동하여 우물의 보더에게.
  3. 3 h 의 배양 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 하이드로코르티존, 인간 내피 성장 인자, 소 뇌 추출물 및 젠타미신 황산 암포테리신 B(재료의 표)및 추가 5 % (v /v) FBS 및 1 % (v /v) 펜틴 을 포함하는 성장 인자 키트로 보충 된 내피 성 기저형 배지 (EBM)의 500 μL을 조심스럽게 추가합니다.
  4. 37°C에서 6일간 단일 글로메룰리, 5% (v/v) CO2를배양한다.
    참고: 6일 이내에 정수리 상피 세포로 구성된 아웃성장이 형성됩니다. 하나는 정수리 상피 세포에 특정 화합물 또는 약물의 효과 테스트 하는 것을 목표로 하는 경우 이 6 일 기간 내에서 매체에 추가 해야.

4. 정수리 상피 세포 증식 분석

  1. 6 일 후에 사구배 기재를 분석합니다. 디지털 반전 광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.
  2. 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI)를 사용하여 포사구배의 표면적 및 직경, 그리고 성장하는 세포 또는 성장형 구체의 수를 결정합니다.
    1. 사구선 성장의 표면적을 확인하려면 tif를 엽니다. ImageJ의 스케일 바가 있는 구사적 아웃성장 파일. 스케일 표시줄에 직선을 그리고 분석 및 측정(예: 1mm = 460 픽셀)을 클릭하여 픽셀의 거리를 결정합니다.
    2. 분석,설정 축척 및 픽셀(예: 460)의 알려진 거리를 입력하여 스케일을 결정하고, 알려진 거리(예를 들어, 1) 및 길이 단위(예를 들어, 1mm)를 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
    3. 분석을 클릭한 다음 측정을 설정하여 결과 표에 표시될 결과를 결정합니다. 구체 아웃성장의 표면적을 확인하려면 옵션 영역을 활성화하고 레이블을 표시합니다. 확인을 클릭합니다.
    4. 사구선 아웃성장의 표면적을 결정하려면, 구체 아웃스링 주위에 프리핸드 선택을 그립니다. 분석을 클릭한 다음 측정하면 결과 테이블이 ImageJ에 표시되어 이전 결정 된 배율에서 아웃 성장의 표면적을 보여 주겠습니다 (예 : 4.4, 예 : mm2참조).

5. 사구 세포 의 특성화

참고: 외성장의 세포 조성을 평가하기 위해, 세포 별 마커에 대한 면역 형광 염색은 t = 6 일에서 구체 아웃스키에서 수행됩니다.

  1. 배지를 조심스럽게 제거하고 인산염 완충식염(PBS)을 사용하여 두 번 구불구를 부드럽게 씻습니다.
  2. PBS에서 4%(w/v) 자당으로 보충된 2%(w/v) 파라포름데히드(PFA)를 사용하여 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS를 사용하여 2배를 조심스럽게 세척합니다.
  3. PBS-ovine 세럼 알부민(BSA) 1%(v/v)에서 적절한농도(재료표)를가진 1차 항체를 실내 온도에서 1시간 동안 배양한다.
  4. 항체 용액을 제거하고 PBS로 3배 조심스럽게 세척하십시오.
  5. 이차항체(재료표)를가진 배양은 실온에서 45분 동안 어둠 속에서 PBS-BSA 1% (v/v)로 희석된다.
  6. 신중하게 PBS와 3 배 세척하고 핵을 시각화하고 둥근 커버 슬립으로 잘 커버하는 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 수성 장착 매체의 1-2 방울을 사용하여 마운트.
  7. 형광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.

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결과

구체 아웃성장 분석법을 수행하는 방법의 체계적인 다이어그램이 도 1에도시된다. 도 2A-D는 광 현미경을 사용하여 관찰된 바와 같이 다른 시점에서 캡슐화된 사구체의 사구체 의 성장을 나타낸다. 외성장은 마우스 신장으로부터 의자간 후 배양에서 2일, 4일 및 6일째(도2B-D)로나타났다. 확장되는 세포가 정수리 상피 세포임을 확인하기 위해, 탈캡슐화된 구엽수는 도 2E, F에도시된 바와 같이 6일 동안 격리되고 배양되었다. 탈캡슐화된 사구는 6일 이내에 잠복기 동안 세포 밖으로 성장을 보이지 않았다. 도 3에서,면역형광...

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토론

이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 하나는 정수리 상피 세포 활성화의 결과인 정수리 상피 세포 증식을 평가하기 위하여 단 하나 캡슐화된 구체를 사용할 수 있습니다. 이 전 생체 내 모델은 우리가 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 분자 경로를 자세히 연구 할 수 있게 합니다. 설명된 방법은 신장 해부및 체질의 간단한 개념에 의존하여 탈구를 분리하고 배양하고 상이한 실험 조건 하에서 정수리 상피 세포의 증식 및/또는 이주를 비교한다. 배양6일 후에 분석될 수 있는 결과는, 예를 들면, 표면적 또는 직경또는 단일 캡슐화된 구체의 성장세포의 수입니다. 이 분석에 대 한 또 다른 응용 프로그램 유도 하거나 정 수리 상피 세포 활성화에 관여 될 수 있는 분자 통로 억제 하는 약물의 효과 연구 할 수 있습니다.

면역형광 염색은 6일 후 배양후 성장세포가 정수리성 상피세포(CD44, 클라우딘-1, SSeCKS)에 대해 양성으로 염색되었으나, 포도세포 특이적 마커 시냅토포틴을 발현하지 않았...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 네덜란드 신장 재단에 의해 지원 되었다 (보조금 14A3D104) 과학적 연구를 위한 네덜란드 조직 (NWO VIDI 교부금: 016.156.363).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 세포 배양 플레이트Corning Costar
anti-CD31BD Pharmingen내피 세포 마커(사용 농도 1:200)
닭 안티 랫 Alexa 647Thermo Fisher ( 사용 농도 1:200)
DAPI-Fluoromount GSouthern BiotechDAPI
디지털 도립 광 현미경Westburg, EVOS fl 현미경
당나귀-안티 염소 Alexa 568Thermo Fishernbsp;( 중고 농도 1:200)
당나귀-안티-래빗 Alexa 568Thermo Fisher ( 사용된 농도 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium Lonza
EBM 매체Lonza
EBM-MV 단일 인용 키트Lonza하이드로 코르티손, hEGF, GA-1000, FBS 및 BBE
태아 소 혈청Lonza
태아 송아지 혈청Lonza
형광 현미경Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodinSanta CruzPodocyte marker (used concentration: 1:200)
Hanks'Balanced Salt SolutionGibco
ImageJ softwareFIJI 1.51n
petri dishSarstedtsize 100
rabbit-anti-claudin1AbcamParietal epithelial cell marker (used concentration: 1:100)
DrRoswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44BD PharmingenParietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpelDahlhausensize 10
Sieves Endecotts Ltd크기 300 µ m, 75 &마이크로; m, 53 &마이크로; m, 스틸
주사기BD Plastipak크기: 20 ml
초저 부착 마이크로플레이트 코닝 Costar6웰 플레이트
를 포함하는 장착 매체&, , , . E. Gelman이 친절하게 제공한

참고문헌

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  3. Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
  4. Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
  5. Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
  6. Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
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  11. Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
  12. Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
  13. Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
  14. Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
  15. Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
  16. Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).

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