여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.
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방법 논문
역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
무세포 단백질 합성(CFPS)은 체외 단백질 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학의 새로운 기술입니다. 그러나 CFPS가 실험실을 넘어 제때 제조 기술에 대한 광범위하고 표준이 될 경우 이러한 시스템의 성능 한계를 이해해야 합니다. 이 질문으로, 우리는 GLYCOlysis, 펜토오스 인산 통로, 삼차 질산 주기, 에너지 대사 및 CFPS 반응에 있는 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 13C-aniline으로 태그가 지정된 내부 표준을 사용하는 반면 샘플의 화합물은 12C-aniline으로파생됩니다. 내부 표준 및 샘플을 역상 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS)에 의해 혼합 및 분석하였다. 화합물의 공동 용출은 이온 억제를 제거하여 평균 상관 계수가 0.988인 2-3배 이상의 대사산물 농도를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 40개의 화합물 중 5개는 아니라인으로 태그가 지정되지 않았지만, CFPS 샘플에서 여전히 검출되고 표준 곡선 방법으로 정량화되었습니다. 크로마토그래피 실행을 완료하는 데 약 10분이 걸립니다. 종합하면, 우리는 단일 LC/MS 실행에서 CFPS에 관련된 40개의 화합물을 분리하고 정확하게 정량화하는 빠르고 견고한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 무세포 신진 대사를 특성화하는 포괄적이고 정확한 접근법으로 궁극적으로 무세포 시스템의 수율, 생산성 및 에너지 효율을 이해하고 향상시킬 수 있습니다.
서론
무세포 단백질 합성(CFPS)은 단백질과 화학 물질의 제조를 위한 유망한 플랫폼으로, 전통적으로 살아있는 세포를 위해 예약되어 있는 응용 프로그램입니다. 무세포 시스템은 조세포 추출물에서 유래하고 세포 성장과 관련된 합병증을제거1. 또한 CFPS는 세포벽의 간섭 없이 대사산물 및 생합성 기계에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 그러나, 무세포 프로세스의 성능 한계에 대한 근본적인 이해는 부족했습니다. 대사 산물 정량화를위한 높은 처리량 방법은 신진 대사의 특성화에 유용하며 대사 전산 모델2,3,4의구성에 중요합니다. 대사 산물 농도를 결정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 핵 자기 공명 (NMR), 푸리에 변환 적외선 분광법 (FT-IR), 효소 기반 분석 및 질량 분광법 (MS)5,6,7을포함합니다 ,8. 그러나, 이러한 방법은 종종 한 번에 여러 화합물을 ....
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프로토콜
1. 항리 선 태그시약 준비
- pH 4.5에서 6M 아니라인 용액을 준비합니다. 후드에서 작업하여 550 μL의 애실린과 337.5 μL의 LCMS 등급의 물과 12M 염산(HCl)의 112.5 μL을 원심분리기 튜브에 결합합니다. 소용돌이잘 4 °C에서 저장합니다.
참고: 아닐린은 2개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
주의: 아닐린은 독성이 매우 높으며 연기 후드에서 작업해야 합니다. 염산은 매우 부식성이 높습니다. - pH 4.5에서 6M 13C 이실린 용액을 준비합니다. 250 mg의 13C6-aniline과 132 μL의 물과 44 μL의 12 M HCl. 소용돌이를 잘 결합하고 4 °C에서 보관하십시오.
- 200 mg/mL N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디미드 염산염(EDC) 용액을 준비합니다. 10 μL의 물에 EDC 2 mg을 녹여 모든 시료에 태그를 지정하고 소용돌이가 잘 될 수 있습니다.
참고 : EDC 용액은 반응과 같은 날에 준비되어야한다. EDC는 아니라인12를가진 화합물의 유도체화를 위한 촉매로서 작용한다.
2. 표준준비
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결과
개념 증명으로, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현하는 대장균 기반 CFPS 시스템에서 대사 산물을 정량화하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. CFPS 반응(14 μL)을 담금질하고 에탄올로 탈단백질화하였다. CFPS 샘플은 12C-aniline으로 태그된 다음 표준은 13C-aniline으로태그가 지정되었습니다. 태그가 지정된 샘플 및 표준을 결합하여 LC/MS(그림1)에주입하였다. 이 프로토콜은 내부 표준을 사용하여 중앙 탄소 및 에너지 대사에 관여하는 40개의 대사산물을 검출하고 정량화했으며, 아닐린으로 태그되지 않은 대사산물 5개에 대한 표준 곡선도 개발되었다(그림2). 이 통로에서 관련시킨 다양한 대사 산물은 인산화된 설탕, 인산화환균산, 카르복실산, 뉴클레오티드 및 보조 인자의 부류였다. aniline을 이용한 유도체화는 친수성 분자에 소수성 모이티.......
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토론
무세포 시스템에는 세포벽이 없으므로 복잡한 시료 전처리없이 대사산물과 생합성 기계에 직접 접근할 수 있습니다. 그러나 세포 없는 반응 시스템을 정량적으로 심문하기 위한 철저하고 견고한 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 거의 이루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 무세포 반응 혼합물과 잠재적으로 전세포 추출물에서 대사 산물을 정량화하는 빠르고 강력한 방법을 개발했습니다. 세포가 없는 반응또는 전세포 추출물에서 발견되는 것과 같은 복잡한 혼합물에서 대사 산물의 개별 정량화는 여러 가지 이유로 도전적입니다. 이러한 이유 중 중심은 화학적 다양성입니다. 이러한 혼합물(예를 들어, 카르복실산, 아민, 인산염, 하이드록실 등)에 동시에 존재하는 작용기의 배열은 분석복잡성을 크게 증가시킨다. 이를 우회하기 위해 13C내부 표준과 결합하여 대사 산물 혼합물에 소수성 성분을 도입하는 항염 유도법을 사용했습니다. 이 방법을 사용하여 단일 LC/MS 실행에서 무세포 반응에서 40개의 대사 산물을 강력하게 검출하고 정량화했습니다. 이.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
기술된 일은 국립 암 학회 (https://www.cancer.gov/)에서 수상 번호 1U54CA210184-01을 통해 암 물질 대사의 물리학에 센터에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
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| 아세토니트릴, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
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| VWR, 헤비 듀티 와류, | VWR | , 와류, | |
| 물, LCMS, | JT, BAKER, | 9831-03 | WATER |
| , Waters, Acquity H, UPLC 클래스, Quaternary Solvent Manager | , Waters, | LCMS | |
| Waters, Acquity H, UPLC 클래스, 샘플 관리자, FTN, | Waters, | LCMS | |
| Waters Acquity Qda 검출기 | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | 소프트웨어 | |
| Waters LCMS 총 회수 바이알 | Waters | 186000384c | LCMS 바이알 |
참고문헌
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7
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