Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Organotypic 슬라이스 배양은 분리된 1차 세포 배양보다 생체 내 상태를 더 가깝게 모방하는 강력한 시험관 내 모델입니다. 초기 출생 후 발달에서, 소뇌 Purkinje 세포는 그(것)들이 프로그램한 세포 죽음을 겪는 동안 취약한 기간을 통과하는 것을 알려지고 있습니다. 여기서, 우리는 이 중요한 시간 동안 마우스 organotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 슬라이스는 Purkinje 세포 생존및 신경 보호 처리의 효험을 평가하기 위하여 추가 표지됩니다. 이 방법은 새로운 신경 활성 분자를 선별하는 데 매우 유용 할 수 있습니다.
서론
생체 외 모델링은 생물 의학 연구에 필수적인 도구입니다. 그것은 조사자가 공부하고 제한한 세포 모형에 있는 특정 기계장치를 단단히 통제할 수 있습니다, 또는 고립된 시스템/기관에서. 오르가노티픽 슬라이스 배양은 특히 신경과학 분야에서 시험관내 기술로 널리 사용되고있다 1. 이 방법은 먼저 롤러 튜브 기술2를사용하여 뇌 조각을 배양한 Gähwiler에 의해 처음 확립되었으며, 나중에 야마모토 등에서 수정되었으며, 이들은 피질 슬라이스 배양을 수행하기 위해 미세 다공성 멤브레인의 사용을도입했습니다 3. 1 차적인 세포 배양에 비해, organotypic 슬라이스 배양은 조직의 세포 아키텍처를 보존하는 이점을 제시, 조직 섹션의 평면에서 뿐만 아니라 네이티브 세포 세포 연결.
Organotypic 조각은 해마4,피질5,줄무늬6,소뇌4,7,척수8,
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프로토콜
동물과 관련된 모든 실험은 노스웨스턴 대학 동물 연구 위원회에 따라 수행되었다.
1. 오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양 전 준비
- 사전에 70% 에탄올로 분무된 세포 배양 후드에서 멸균 병 수신기에 부착된 250 mL 병 상판 진공 필터에 배양 배지 200 mL를 준비합니다. 기저 중간 이글 100 mL(BME), 행크스 균형 소금 용액 50 mL(HBSS), 50 mL의 열 불활성화 말 세럼, 200 mM L-글루타민 1mL(최종 농도 1mM), 5 mL 의 200 g/L 글루코스(최종 농도 5 mg/mL)를 추가합니다. 배양 배지를 진공 걸이하고 최대 한 달 동안 +4 °C로 유지하십시오.
- 멸균 된 생물 안전 성 캐비닛에서 패키지에서 6 웰 배양 플레이트를 꺼내십시오. 배양 배지 1 mL로 각 우물을 채웁니다. 치료가 시험되는 경우, 약리학 적 제제를 잘 처리하고, 대조군을 위한 동일한 부피의 비컨티컬 용액을 잘 첨가한다. 본 연구에서, 우리는 잘 처리 된 잘 (30 mM 최종) 및 제어 웰에 멸균 수의 1 μL 3 M KCl 용액을 추가했다.
- 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인(공극 크기 = 0.4 μm)을 가진 개별적으로 래핑된 세포 배양 삽입물의 필요한 수의 세포 배양 ....
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결과
도 4에도시된 바와 같이, 이 프로토콜은 Purkinje 세포 생존이 면역 형광 및 이미지 획득 단계에 따라 평가될 수 있는 orgnotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 생성한다. 퍼킨제 세포는 항칼빈딘 D-28K(희석 1/200) 및 Alexa594 항마우스(희석 1/300) 항체의 조합으로 표지되었다. 이미지 스티칭은 전체 소뇌 슬라이스의 그림을 얻기 위해 현미경 수집 소프트웨어 (NIS-Elements)에 의해 자동으로 수행되었다. 슬라이스당 Purkinje 셀 번호는 차트를 생성하고 통계 분석을 수행하기 위해 프리즘 8 소프트웨어에 입력하였다. P6에서, Purkinje 세포 생존율은 그들의 공지된 취약성 창4와 일치하는 대조군에서 낮았다(도4A,E). 기증자 동물이 나이가 들고 이 중요한 기간을 종료함에 따라 생존이 증가했습니다(그림
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토론
소뇌 슬라이스 배양은 산후 발달 중에 프로그램된 Purkinje 세포 사멸을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 그들의 신경 보호 잠재력을 위한 후보 분자를 급속하게 스크리는 것을 이용될 수 있습니다. 주요 장점은 설정이 간단하고 매우 비용 효율적이며, 단지 장비에 적당한 투자가 필요하다는 것입니다 (진동은 조직 헬기보다 최대 3 배 더 많은 비용이 들 수 있습니다). 또한, 10 ~15개의 건강한 슬라이스를 하나의 마우스 새끼에서 생성할 수 있으며, 한 동물만 사용하여 다른 실험을 병렬로 수행할 수 있습니다.
일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 가능한 한 효율적으로 배양을 수행하고 배양 할 건강한 소뇌 섹션을 선택하는 것이 중요합니다. 이 방법은 장기 배양(최대 수개월)에도 적합합니다. 따라서 오염을 피하기 위해 해부 및 자르는 과정에서 좋은 무균 기술을 사용하고 항생제로 배양을 보충할 필요성을 방지하는 것이 필수적입니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
화상 진찰 일은 로버트 H 루리 포괄적인 암 센터에 수여된 NCI CCSG P30 CA060553에 의해 관대하게 지원되는 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 대학 센터에서 행해졌습니다. 숀 맥더모트의 기술 지원과 지원에 감사드리며, 그림 1에나타난 손으로 그린 그림에 대해 마야 엡스타인에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG 2차 항체 | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| Anti-Calbindin D-28K 항체 (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 인큐베이터 | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| 커버슬립, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| 드레싱 핀셋, 스트레이트 | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| 양날 | 블레이드 Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, | straight Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine Junps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| 포도당 용액 | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| 말 혈청, 열 비활성화, 뉴질랜드 원산지 | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| 밀리셀 세포 배양 인서트 | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터 장치(PES 멤브레인 포함), 250mL | ThermoFisher Scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R 컨포칼 레이저 현미경 시스템 | Nikon | ||
| NIS-Elements 이미징 소프트웨어 | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| 염화칼 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| 작동 가위, 스트레이트 | 하버드 장치 | 72-8403 | |
| 오비탈 쉐이커 벨리 댄서 | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| 프리즘 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 조직 배양 접시, 60mm(그립 링 포함 | Fisher Scientific | FB012921 | |
| 조직 배양 플레이트, 24웰 | Falcon/Corning | ||
| 이송 피펫, 멸균 | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
참고문헌
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K.
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