결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.
서론
진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.
그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV
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프로토콜
1. 철분 고갈 정의 매체의 준비
- KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다.
- 금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교반합니다. 플라스틱 수신기가 있는 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과하여 MCR을 살균하고 제거합니다. 여과를 가속화하고 필터 막힘을 방지하기 위해, 여과 하기 전에 약 30 분 동안 수지 퇴적물을 보자.
참고: 이 배지는 원자 흡수 분광법에 의해 결정된 2 μM 잔류 철보다 적습니다. - ZnCl의 0.5 mg/L,MgSO4의40 mg/L, 그리고 0.1 mg/L의 MnSO4. 별도로, 탈이온수에서 각 금속 보충제의 농축 된 주식 (1,000x)을 준비하고 MM 보충 전에 여과하여 살균하십시오. 철고갈, 금속 보충 MM은 여기서 저철 MM(LIMM)이라고 한다.
- 10 mM H....
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결과
MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2, 도 3). 콜로니 형성 단위(CFUs)로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철분에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 보였다(50 μM FeCl3)(그림 3). 한 가지 대표적인 실험의 결과가 제시되었지만, 이는 MEV의 다중(>10) .......
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토론
진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따라서 MEV 절연 방법의 효율을 최적화하는 것이 중요합니다. 진균은 조잡한 MEV 제제를 배지로 쉽게 응집하고 쉽게 오염시키는 글리콜리파이드 및 기타 소수성 분자를 방출하기 때문에 생화학 및 기능적 연구를 수행하기 전에 MEV를 정화하고 검증하는 것이 중요합니다. Mtb가 철 제한 조건하에서 MEV의 방출을 향상시킨다는 것을 입증한 이전 관찰에 기초하여, 철 제한 진균에서 EV 정제를 위한 프로토콜이 설치되었습니다. 또한 비악성 M. 스메그마티스는 또한 .......
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공개 사항
저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.
감사의 글
우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 - 로살레스에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amicon 교반 셀 모델 108 | EMD Milipore UFSC40001 | 세포 한외여과 시스템 | |
| BD 폴리프로필렌 225mL 원뿔형 튜브 | Fisher | 05-538-61 | 원추형 원심분리기 튜브 |
| Biomax 100kDa 컷오프 한외여과막 | EMD Milipore | PBHK07610 | 한외여과막 |
| Chelex-100 수지 | Bio-Rad | 142-2842 | 금속 킬레이트 수지 |
| Middlebrook 7H10 한천 | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar 플레이트 |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial Broth 배지 |
| 니트로 셀룰로오스 블로팅 멤브레인 | GE Healthcare | 10600001 | 블로팅 멤브레인 |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 요오딕사놀 |
| 폴리카보네이트 초원심분리 튜브 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | 폴리카보네이트 초원심분리 튜브 25 mm x 89 mm |
| 폴리프로필렌 박막 원심분리 튜브 13 mm x 15 mm | 벡크만 쿨터 | 344059 | 폴리프로필렌 박막 원심분리 튜브 13 mm x 15 mm |
| 단백질 분석 염료 | BioRad | 5000006 | Bradford 단백질 염색 |
| SYPRO Ruby Molecular | Probes | S12000 | 초고감도 단백질 염색 |
| TMA-DPH | 분자 프로브 | T204 | 1-(4-트리메틸암모늄페닐)-6-페닐-1,3,5-헥사트리엔p-Toluenesulfonate |
| 진공 여과 플라스크 | CellPro | V50022 | 필터 장치 |
참고문헌
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M.
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