Method Article

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

DOI:

10.3791/60362

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October 29th, 2019

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1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. 예쁜꼬마선충은 배아 발달 중 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 체계적으로 분석하기 위한 최고의 시스템입니다. 한 가지 과제는 배아 발생이 약 13시간 동안 동적으로 전개된다는 것입니다. 이 반나절 긴 기간 척도는 이미지화 할 수있는 배아의 수를 제한하여 실험의 범위를 제한했습니다. 여기에서는 중간 시간 해상도에서 최대 14개의 다른 조건에서 단일 하룻밤 실행에서 80-100개의 배아에서 동시에 3D 시간 경과 이미징을 허용하는 반 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 간단하며 지점 방문 용량을 갖춘 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 세균 층 명세서 및 형태 형성의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 표현하는 두 개의 맞춤형 균주를 이미지화하는 데 사용함으로써 입증됩니다. 데이터를 분석하기 위해 모든 채널, z-스텝 및 타임포인트에서 개별 배아를 더 넓은 시야에서 자르는 사용자 지정 프로그램을 구축하고 각 배아에 대한 서열을 별도의 티프 스택으로 저장합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 이 프로그램은 시각화 또는 자동화된 분석을 준비하기 위해 개별 배아를 분리, 전처리 및 균일하게 방향을 지정하여 데이터 처리를 간소화합니다. 또한 각 배아의 최대 강도 형광 투영 및 각 배아의 밝은 필드 이미지를 표시하는 다중 패널 파일로 개별 배아 데이터를 컴파일하는 ImageJ 매크로가 제공됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜 및 도구는 이전에 기술된 40개의 발달 유전자의 노크다운 에 따른 배아 발달을 특성화하기 위해 이를 사용하여 검증되었다; 이 분석은 이전에 추가된 발달 표현형을 시각화하고 새로운 표현형을 밝혔습니다. 요약하면, 이 작품은 유익한 형광 마커를 표현하는 균주와 결합될 때, 분석하기 위한 실험을 크게 가속화하는 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구와 결합된 반고처리량 이미징 방법을 자세히 설명합니다. 배아 발달.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상기 C. elegans 배아는 기계론적 세포 생물학 및 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건의 분석을 위한 중요한 모델 시스템으로 배아발달을 유도하는 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. 현재까지, 배아에서 세포 수준 사건 및 세포 운명 명세둘 다의 특성의 다량은 상대적으로 높은 시간 별 화상 진찰 실험을 사용하여 달성되었습니다 (즉, 10-100 s마다 취득) 배아발 발현 형광 마커. 초에서 수십 분의 순서로 이벤트에 적합하지만 이 방법은 기술적으로 더 긴 프로세스의 특성화에 대해 몇 시간에서 며칠로 제한됩니다. 연신장의 끝에 첫번째 절단에서 배아 발달은 대략 10 시간 걸립니다. 이 시점에서, 동시 낮은 시간 해상도 이미징을 허용 하는....

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Protocol

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1. 세미 하이 처리량 이미징을 위한 C. 예쁜꼬마선충 배아 준비

참고: 프로토콜의 이 부분의 목표는 반 동기화 (2 to 8 세포 단계) C. 예쁜꼬마선의 집단을 적절한 마커 균주로부터 해부하는 것입니다(그림 2),이미징을위한 유리 바닥 384 웰 플레이트. 그밖 격판덮개 는 또한 작동할 수 있었습니다, 그러나 작은 우물 크기가 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 태아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 상대적으로 작은 지역에 태아의 퍼짐을 제한하기 때문에 384 웰 플레이트는 바람직합니다. 대략 배아를 동기화하는 것은 발달의 전체 과정이 필드에 있는 각 태아를 위해 붙잡히도록 합니다.

  1. 얼음 차가운 M9 배지에 용해된 테트라미솔 염산염(TMHC)의 5-10 mL 용액을 준비합니다(0.45 M Na2HPO4∙7H2O, 0.11 M KH2PO4,0.04 M NH4Cl) 동안 사용 해부 및 이미징. 이 매체는 부화한 유충을 움직이게 하는 것이 초기 발달 단계에서 태아의 화상 진찰을 방해하지 않는다....

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Results

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C. 예쁜꼬마기 배아 발달에 대한 분자 교란의 효과를 특성화하는 데 있어 중요한 과제는 배아가 첫 번째 절단에서 연신기 의 끝에서 20°16에서진행되기까지 약 10 시간이 걸린다는 것입니다. 배아의 큰 코호트가 동시에 이미지화될 수 있는 세미 하이 처리량 방법은 각 조건에 대한 충분한 앙상블 크기와 병렬로 여러 조건의 이미징을 허용하기 때문에 이 시간 규모의 이벤트에 유용합니다. 정량분석(그림1A).

세미 하이 처리량 이미징 방법 및 다중 마커 균주
여기에 설명된 반고처리량 이미징 방법(그림 1B에설명됨)은 384웰 유리 바닥판을 채용한다; 멀티 웰 포맷은 최대 14개의 조건을 병렬로 배열할 수 있게 해주며, 우물의 작은.......

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Discussion

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이 작품은 C. elegans에있는 배아 발달에 있는 유전자의 기능을 프로파일링하기 위하여 더 큰 규모의 노력을 가능하게 하기 위하여 개발된 공구 및 방법의 제품군을 기술합니다. 우리의 반 높은 처리량 방법은 단일 실험에서 80-100 배아에 대한 20 분 해상도에서 배아 발달의 3D 시간 경과 이미징을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원하는 마커 균주와 함께 사용하도록 적응 될 수 있지만,이 작품은 배아 발생 중 이벤트를 모니터링하기 위해 개발 된 두 가지 사용자 정의 균주를 사용하여 방법의 잠재력을 보여줍니다 : (1) 조직 특정하는 세균 층 기자 변형 프로모터는 내배엽, 중배엽 및 외피핵을 표시하기 위해 형광 히스톤의 발현을 유도하고, (2) 세포 접합부에서 형광 마커의 발현을 유도하기 위해 표피 및 뉴런 프로모터를 사용하는 형태 형성 리포터 균주 및 플라즈마 멤브레인. 두 균주를 이미징함으로써 세포 운명 사양 및 형태 유전학 적 사건에 대한 분자 교란의 결과를 놀라운 세부 사항으로 캡처 할 수 있습니다. .......

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Acknowledgements

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S.D.O.는 캘리포니아 샌디에이고 대학이 후원하는 국립 의학 연구소의 지원을 받았습니다 (NIH / IRACDA K12 GM068524). A.D.와 K.O.는 루드비히 암 연구소의 지원을 받았으며, 이 연구소는 이 연구를 지원하는 데 사용되는 연구 자금을 제공했습니다. 우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 그의 조언에 대한 앤드류 Chisholm에 감사드립니다, 초기 방법 개발 단계 후이 프로젝트에 기여에 대한 로널드 빅스, 지원 및 소분자 발견에 대한 액세스 데이브 젠킨스와 앤디 시아우 고콘텐츠 이미징 시스템.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
흡인기 튜브 어셈블리Drummond Scientific2-000-000
보정 피펫(25mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager 소프트웨어Yokogawa Electric CorpCV1000
원뿔형 튜브(15mL)Scientific1475-0501
CV1000 현미경Yokogawa Electric CorpCV1000
우울증 슬라이드(3-well)Erie Scientific1520-006
해부 현미경NikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJI오픈 소스https://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab 준비https://openwetware.org/wiki/M9_salts
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlatesLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, 유리 바닥Greiner Bio-One781855
Tetramisole HydrochlorideSigma AldirchT1512-10G
핀셋, Dumont #3전자 현미경 과학0109-3-PO
U-PlanApo 대물렌즈(10회; 0.4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo 대물렌즈(60회; 1.35 NA)Olympus1-U2B832
에 포함USA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

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