인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

Summary

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

Abstract

배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.

Introduction

무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은^{비유사성1,2}. 흥미롭게도, 마우스는 영장류^뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고^3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.

Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용^5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs^7,8에서비교적 유사한 경로를 따랐습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 분리된 인간 ESCs(hESCs)의 클러스터로 시작하며, 도금 단계^9,10뿐만 아니라 외인성 성장 인자(11)를 첨가하기 전에 파스카 실험실의 뇌 오르가노이드 프로토콜의 초기 단계인 톰슨 및 장 실험실의 정액 작업의 초기 단계와 유사하게 시작한다. 지하막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)는 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜에 활용되어 왔으며 효과적인 스캐폴드^8로나타났다. 그러나, 가장 일반적으로 사용되는 지하 막 매트릭스는 생산¹²동안 배치 가변성에 배치와 성장 인자의 알 수없는 수량과 공동 으로 공동 으로 합병증없이 오지 않는다. 또한 이러한 행렬은 이미징을 복잡하게 하고 오염 및 비용의 위험을 증가시킬 수 있습니다.

인간의 뇌 오르가노이드는 많은 질문에 대답하는 데 사용할 수 있지만, 염두에 두어야 할 특정 한계가 있습니다. 하나는, 배아 줄기 세포에서 시작, 오르가노이드는 더 밀접하게 노화 뇌보다 미성숙 한 뇌를 닮은 등 알츠하이머 병과 같은 노년기에 발생하는 질병에 대한 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 둘째, 우리의 프로토콜은 여러 뇌 영역에서 세포에 대한 치료 또는 질병의 효과를 연구하는 데 유용한 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌 발달의 마커를 발견했지만, 다른 프로토콜은 특정 뇌 영역에 집중하기 위해 따를 수 있다^13,14. 마지막으로, 오르가노이드 모델의 또 다른 제한은 크기의 반면, 인간의 뇌의 평균 길이는 약 167 mm, 교반의 사용으로 만든 뇌 오르가노이드는 4mm^8까지 성장하고이 프로토콜에 의해 형성 된 오르가노이드는 1-2mm로 10 주까지 증가합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 프로토콜은 인간의 뇌 조직 및 여러 세포 유형의 상호 작용을 연구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.

Protocol

1. 줄기 세포 유지 보수

1. H9 hESCs를 성장 인자 감소 층의 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조, 이제부터는 단순히 매트릭스라고 함)에 유지하십시오.
   1. 6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 매트릭스 100 μL과 얼음으로 차가운 덜베코의 수정된 독수리 매체(DMEM)/F12 용지 5.9 mL를 결합합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 초과 매트릭스 /미디어가 흡입 된 후 세포를 통과하기 위해 다음 날에 사용하십시오.
2. 세포를 매주 약 1:12 분할 비율로 7일마다 배양한다. 37°C, 저산소 인큐베이터(5%_O2,5%_CO2)에서mTESR-1 매포를 사용하여 세포를 유지한다. 매일 미디어를 새로 고칩니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 세포를 분화 제거.
3. H9 세포는 오르가노이드를 생성하기 위하여 그(것)들을 이용하기 전에 4 6 일 통과되어야 합니다. 세포는 세포 군집의 대략 1:8 비율로 통과되어야 합니다. 이렇게하려면 DMEM F12 매체로 세포를 헹구고 중성 프로테아제 (예를 들어, 디스파제, 단순히 프로테아제라고 함)로 세포를 해리하고 DMEM / F-12로 헹구고 플레이트를 4 플레이트 (6-well 또는 10 cm)에서 20 % ~ 20 % 동안 30-60 세포 클러스터로 헹구습니다. 수확 2일 전에, 일반 인큐베이터(21%_O2,5%_CO2)로전환한다. 플레이트는 오르가노이드 형성을 시작할 때 ~ 80 % 의 합의에 도달해야합니다.

2. 오르가노이드 문화를 위한 hESCs의 해리

1. 프로테아제 스톡 솔루션(5 U/mL)을 알리쿼트합니다.
   참고: 일반적으로 몇 개월 동안 사용하기 위해 -20 °C에서 1 mL aliquots를 동결합니다.
2. 6웰 또는 10cm hESC 플레이트마다 1mL의 스톡 솔루션과 5mL의 DMEM/F12를 추가하여 프로테아제 스톡 용액을 작업 농도로 희석합니다.
3. 세포 배양 배지를 흡인하고 제거한 다음 프로테아제 용액으로 hESCs를 덮습니다. 10-15 분 동안 또는 식민지의 가장자리가 반올림하고 매트릭스에서 분리하기 시작할 때까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
4. 플레이트를 기울이고 프로테아제 용액을 흡인하고 DMEM/F12로 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다. 10cm 플레이트를 사용할 때는 6웰 플레이트와 6mL를 사용할 때는 세척할 때마다 2 mL/well을 사용하십시오. 이 단계를 수행할 때 콜로니가 행렬에 연결되어 있는지 확인합니다.
5. 신선한 mTESR 용지 약 1.5 mL을 각 웰(또는 10cm 플레이트의 경우 5mL)에 다시 넣고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 씻어내도록 합니다.
6. 10mL 파이펫을 사용하여 플레이트 내에서 hESC를 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 부드럽게 흡인하고 분배합니다. 식민지 클러스터는 이 단계를 완료할 때 ~250-350 μm 크기의 사각형과 유사해야 합니다.

3. 오르가노이드의 생성

1. 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)없이 30 mTESR 매질의 30 mTESR을 함유하는 단일 초저 부착 T75 플라스크내로 세포를 전달한다.
2. 다음 날, 플라스크(들)를 기울여 코너에 있는 라이브 셀풀을 구하십시오(첫날에는 5-10분이 걸릴 수 있지만 클러스터가 커질수록 더 빨라집니다).
   참고: 이 단계 또는 후속 단계에서 플라스크 의 바닥에 부착 된 많은 수의 세포가있는 경우 세포를 새 플라스크로 옮니다. 처음 이틀 동안 죽은 세포의 높은 인구를 가지고 정상입니다. 용지 변경을 수행할 때는 가능한 한 많은 세포 파편을 제거해야 합니다.
3. 일단 세포가 정착되면, 살아있는 세포를 포함하는 매체의 대략 10 mL를 떠나는 매체 및 죽은 세포를 흡인합니다.
4. 낮은 bFGF 매체의 ~ 20 mL를 추가 (DMEM/F12 1 x N2로 보충, 1 x B27, 1 x L-글루타민, 1 x NEAA, 0.05% 소 혈 청 알부민 (BSA), 그리고 0.1 mM 모노티오 글리세롤 (MTG) 30 ng/mL bGF보충.
5. 2일째에 세포를 확인합니다. 대부분의 세포가 건강하고 밝게 보이면 아무 것도 할 필요가 없습니다. 그러나 세포의 3분의 1 이상이 어둡게 나타나면 20 ng/mL bFGF로 보충된 낮은 bFGF 매체의 ~20 mL로 미디어(3.2단계에서와 동일한 틸팅 기법을 사용)로 교체합니다.
6. 3일째에, 10 ng/mL bFGF로 보충된 20 mL의 낮은 bFGF 매체로(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 미디어의 절반을 교체한다.
7. 5일째에 배지의 절반을(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 신경 유도 매체 20mL(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)로 교체합니다.
   참고 : 다른 세포보다 훨씬 큰 세포 또는 오르가노이드의 큰 클러스터가있는 경우, 그들은 문화에서 제거해야합니다. 크기는 현미경의 밑에 외관에 의해 추정됩니다; 예를 들어, 레티클이 있는 접안 렌즈를 사용하십시오. 오르가노이드의 대다수는 유사하게 크기 (대략 100 ±20 μm)입니다. 우리는 다른 것 보다는 대략 2 x 더 작거나 더 큰 오르가노이드를 제거했습니다.
8. 격일로 중간 크기(~15mL)의 절반을 NIM으로 교체하십시오.
9. 배양 3주 후, 100x 페니실린/스트렙토마이신을 배지에 추가합니다(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)을 원하는 경우 최종 농도에서 1x로 추가하십시오. 격일로 미디어를 새로 고칩니다.
   참고 : 이 방식으로, 우리는 문화에서 최대 6 개월 동안 오르가노이드를 유지했습니다.

4. RNA 추출 및 준비

1. 10 mL 파이펫을 사용하여 플라스크에서 약 15 개의 오르가노이드 (크기에 따라 다름)를 부드럽게 추출하고 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
   1. 원심분리기(200 x g 1분)에 오르가노이드를 부드럽게 펠렛하고, 덜베코의 PBS(DPBS)를 3회 1회 헹구세요.
2. 검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, RNeasy 키트)을 사용하여 RNA를 추출합니다.
3. 260 및 280 nm에서 각 샘플의 광학 밀도 값을 측정합니다.
4. 검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, iScript cDNA 합성 키트)을 사용하여 cDNA를 준비한다.
5. 적어도 하나의 하우스키핑 유전자를 포함하여 미리 검증된 프라이머(표1)를사용하여 qRT-PCR을 수행한다.

5. 면역 화학

1. 고정
   1. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하고 4°C에 놓습니다.
   2. 멸균 면도기를 사용하여 멸균 전사 파이펫의 팁을 잘라냅니다.
   3. 절단 전달 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 부드럽게 추출하는데, 특히 커지면 쉽게 부서질 수 있으며, 추가 용지 또는 DPBS가 있는 6웰 플레이트에 넣습니다.
   4. 플레이트를 기울이고 용지를 흡인하고 1x DPBS로 교체합니다. 1x DPBS로 세포를 2회 더 헹구다.
   5. DPBS를 4% PFA 용액으로 교체하고 4°C의 셰이커에 놓습니다.
      참고 : 2 일 동안 (작은 오르가노이드의 경우) 7 일 (오르가노이드 >3 개월), 짧은 시간 (예 : 16-24 시간)도 가능할 수 있습니다.
   6. DPBS에서 30%, 20%, 10%의 자당 솔루션을 준비합니다.
   7. PFA에서 고정한 후, 10% 자당 용액으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
   8. 10% 자당을 20% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
   9. 20% 자당을 30% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.
2. 냉동 단면
   1. 드라이 아이스의 평평한 층을 준비하고 그 위에 라벨플라스틱 금형을 배치합니다.
   2. 최적의 절삭 온도 매체 (OCT)의 얇은 층을 금형에 붓고 (몇 초 이내에) 경화하기 시작합니다.
   3. 팁이 잘린 전사 파이펫을 사용하여 금형의 OCT 상단에 몇 개의 오르가노이드를 놓고 오르가노이드의 위치에 주의를 기울이십시오.
   4. 곰팡이가 가득 차고 오르가노이드가 덮일 때까지 OCT에 천천히 추가하십시오. 10분 동안 완전히 굳어지게 하십시오.
      참고: 10분 이상 동결하면 단면화에 여러 오르가노이드의 이상적인 상대적 배치를 보장하는 데 도움이 되지만, 에탄올 드라이 아이스 믹스 또는 액체 질소를 사용하여 더 빨리 동결할 수 있습니다.
   5. 절단 시 쉽게 찾을 수 있도록 마커로 오르가노이드의 상대 위치를 표시합니다.
   6. 금형을 가방이나 상자에 넣고 단면을 잘라낼 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
   7. 저온 극저온을 사용하여 10 μm 섹션을 슬라이스하고 조직을 표지된 양전하 슬라이드에 놓습니다.
3. 얼룩
   1. 차단 용액 (0.3 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 일반 당나귀 혈청)을 준비하십시오.
   2. 소수성 pap 펜을 사용하여 조직의 둘레를 그립니다.
   3. 슬라이드를 PBS로 3회 5분 동안 헹구십시오.
   4. PBS를 실온에서 1시간 동안 차단 용액으로 교체하십시오.
   5. 차단 용액을 밤새 4 °C에서 항체 용액 (적절한 농도의 항체, 0.1 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 정상 당나귀 혈청)으로 교체하십시오.
   6. 다음 날, 슬라이드를 PBS로 3회 10분 동안 세척합니다.
   7. PBS를 실온에서 1시간 동안 항체 용액으로 희석된 적절한 이차 항체(적절한 농도)로 대체합니다.
   8. 1x PBS로 매번 10분 동안 3회 헹구어 내보시기
   9. 4', 6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI) 얼룩을 바르고 1x PBS로 10분동안 3회 헹구어주세요.
   10. 부착은 장착 용액으로 슬라이드 전면에 입술을 덮고, 어둠 속에서 실온에서 건조시키고, 4 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오.

Results

그림 1은 프로토콜의 여러 단계에서 세포/오르가노이드가 어떻게 생겼는지 를 입증하기 위해 여러 시간 지점의 대표적인 브라이트필드 이미지를 보여줍니다. hESCs를 조직 배양 플레이트에서 제거하고, 작은 조각으로 나누어, 그들이 구체를 형성 하는 T75 초저 부착 플라스크에 배치. 세포는 이 클러스터의 중심에 있는 어둡고 죽어가는 세포 없이, 밝고 유사한 크기에서 보이는 것이 중요합니다. 세포는 점차 bFGF를 제거하였다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내 이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드는 시간이 지남에 따라 더 커지고 어두워지지만, 뇌 오르가노이드 발달과 확장 전반에 걸쳐 존재하는 신경 로제트 와 같은 구조 (검은 색 화살표)를 주의하는 것이 중요합니다. 로제트는 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경관의 특징을 포함하고, 상피 특성을 표시하고 정점^{루멘(15)을}둘러싸고 있다.

Discussion

다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추가 기술은 세포에 기초에 더 많은 정보를 모으기 위하여 미래 연구 결과에서 이용될 것입니다. 이 시스템의 또 다른 한계는, 보다 최근의 연구들 중 일부에서 행해진 바와 같이 오르가노이드 내에 혈관구조가 통합되지 않는다는 것이다^17,18,19. 그러나, 낮은 산소 환경에서 높은 산소 환경으로 hESCs를 전환하는 것은 더 밀접하게 개발 배아에서 호기성 전...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 염소 안티 토끼	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP 항체	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY	USA 356231
H9 hESC WiCell	, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR 배지	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	전자 현미경 과학, Hatfield, PA	RT15710
qPCR 기계	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington,	MA AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
초저 부착성 T75 플라스크	Corning, Corning, NY, USA	3814