이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.
서론
무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은비유사성1,2. 흥미롭게도, 마우스는 영장류뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.
Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs
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프로토콜
1. 줄기 세포 유지 보수
- H9 hESCs를 성장 인자 감소 층의 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조, 이제부터는 단순히 매트릭스라고 함)에 유지하십시오.
- 6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 매트릭스 100 μL과 얼음으로 차가운 덜베코의 수정된 독수리 매체(DMEM)/F12 용지 5.9 mL를 결합합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 초과 매트릭스 /미디어가 흡입 된 후 세포를 통과하기 위해 다음 날에 사용하십시오.
- 세포를 매주 약 1:12 분할 비율로 7일마다 배양한다. 37°C, 저산소 인큐베이터(5%O2,5%CO2)에서mTESR-1 매포를 사용하여 세포를 유지한다. 매일 미디어를 새로 고칩니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 세포를 분화 제거.
- H9 세포는 오르가노이드를 생성하기 위하여 그(것)들을 이용하기 전에 4 6 일 통과되어야 합니다. 세포는 세포 군집의 대략 1:8 비율로 통과되어야 합니다. 이렇게하려면 DMEM F12 매체로 세포를 헹구고 중성 프로테아제 (예를 들어, 디스파제, 단순히 프로테아제라고 함)로 세포를 해리하고 DMEM / F-1....
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결과
그림 1은 프로토콜의 여러 단계에서 세포/오르가노이드가 어떻게 생겼는지 를 입증하기 위해 여러 시간 지점의 대표적인 브라이트필드 이미지를 보여줍니다. hESCs를 조직 배양 플레이트에서 제거하고, 작은 조각으로 나누어, 그들이 구체를 형성 하는 T75 초저 부착 플라스크에 배치. 세포는 이 클러스터의 중심에 있는 어둡고 죽어가는 세포 없이, 밝고 유사한 크기에서 보이는 것이 중요합니다. 세포는 점차 bFGF를 제거하였다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내 이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드는 시간이 지남에 따라 더 커지고 어두워지지만, 뇌 오르가노이드 발달과 확장 전반에 걸쳐 존재하는 신경 로제트 와 같은 구조 (검은 색 화살표)를 주의하는 것이 중요합니다. 로제트는 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경관의 특징을 포함하고, 상피 특성을 표시하고 정점루멘(15)을둘러싸고 있다.
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토론
다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추가 기술은 세포에 기초에 더 많은 정보를 모으기 위하여 미래 연구 결과에서 이용될 것입니다. 이 시스템의 또 다른 한계는, 보다 최근의 연구들 중 일부에서 행해진 바와 같이 오르가노이드 내에 혈관구조가 통합되지 않는다는 것이다17,18,19. 그러나, 낮은 산소 환경에서 높은 산소 환경으로 hESCs를 전환하는 것은 더 밀접하게 개발 배아에서 호기성 전.......
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공개 사항
S.G.K.는 Dansar IT 및 Gene-in-Cell의 SAB 멤버입니다.
감사의 글
예일 줄기세포 코어(YSCC)와 예일암센터(YCC)에 도움을 주셔서 감사합니다. 그의 신경병리학 적 검토에 대한 김정박사에게 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 재생 의학 연구 기금에 의해 지원되었다, Dimes의 행진, NHLBI R01HL131793 (S.G.), 예일 암 센터와 예일 암 생물학 교육 프로그램 NCI CA193200 (E.B.) 조셉과 루실 매드리.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 염소 안티 토끼 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP 항체 | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY | USA 356231 | |
| H9 hESC WiCell | , Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | USA 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR 배지 | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | 전자 현미경 과학, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR 기계 | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, | MA AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| 초저 부착성 T75 플라스크 | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
참고문헌
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S.
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