상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성
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이 논문에서
요약
초록
인간 자궁 내부증은 바디에 있는 가장 호르몬 반응하는 조직 의 한개이고 임신의 설치를 위해 필수적입니다. 이 조직은 또한 병에 걸린 될 수 있고 이환율및 죽음조차 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 인간 자궁내막 생물학을 연구하는 모델 시스템은 단일 세포 유형의 체외 배양 시스템으로 제한되었다. 또한, 자궁 내막의 주요 세포 유형 중 하나인 상피 세포는 잘 전파되거나 배양에서 생리적 특성을 유지하지 못하므로 자궁내막 생물학에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 우리는 처음으로 인간 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포로 구성된 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 이러한 오르가노이드는 어떤 외인성 스캐폴드 물질을 필요로 하지 않으며 상피 세포가 스페로이드와 같은 구조를 포괄하고 콜라겐을 생성하고 분비하는 중심에 있는 기질 세포와 편광되도록 특별히 조직한다. 에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체는 상피 및 기질 세포및 에스트로겐 및 테스토스테론의 생리적 수준으로 치료하여 오르가노이드의 조직을 촉진한다. 이 새로운 모형 체계는 전에 가능하지 않은 방법으로 일반적인 자궁내막 생물학 및 질병을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
서론
인간 자궁 내막은 자궁 구멍을 일렬로 세게 하고 이식 도중 태아를 위한 첫번째 접촉으로 봉사합니다. 자궁 내막은 발광 및 선 상피 세포, 지지성 기질 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포로 구성됩니다. 함께, 이러한 세포 유형은 성 스테로이드 호르몬에 가장 반응 조직 중 하나입니다 자궁 내막 조직을 구성1. 각 생리 주기 동안 발생 하는 변화는 눈에 띄는. 자궁 내적의 적절한 성장 및 리모델링은 배아 이식이 발생할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 에스트로겐과 프로게스테론에 대한 비정상적인 반응은 임신의 성공적인 설립을 허용하지 않는 내화 자궁 내막을 초래할 수 있으며 자궁 내막 신생물을 포함한 질병을 초래할 수도 있습니다.
자궁 내막에서 발생하는 호르몬 반응 및 필수 변화를 연구하기 위해, 수술 또는 자궁 내막 생검 동안 환자로부터 절제 된 자궁 내막 조직에서 세포는 세포 배양에서 전파되었습니다. 자궁내막 기질 세포는 우선적으로 증식하고 쉽게 전파되며, 프로게스테론에 의해 유도된 분화 과정은 시험관 내에서 재흡수될 수 있다. 그 결과, 이러한 분화 과정에서 많은 것을 배웠으며,2,3. 자궁 내막에....
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프로토콜
자궁 내막 샘플은 노스 웨스턴 대학 프렌티스 여성 병원에서 양성 자궁 조건에 대한 일상적인 자군 절제술을 겪고 폐경 전 여성에서 수집되었다, 기관 검토 위원회 승인 프로토콜에 따르면. 연구에 포함된 모든 여성으로부터 서면 동의를 얻었다.
1. 아가로즈 금형의 준비
- 세포 분리를 시작하기 전에, 제조사의 지시에 따라 오르가노이드를보관하기 위해 1.5% 아가로즈 마이크로 몰드(표)를 주조 및 평형화한다.
2. 자궁내막 오르가노이드의 생성
- 수확 기본 기질 및 상피 세포
- 무균 기술을 사용하는 생체 안전 성 캐비닛에서 효소 용액 (2.5 mg / mL 콜라게 나아제 유형 I + 0.1 mg / mL DNase I을 디스파제 [500 단위]의 10 mL)에서 37 °C에서 준비하고 0.2 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 멸균 필터를 15 mL 중음관으로 합니다.
- 무균 기술을 사용하는 생물 안전 성 캐비닛에서 자궁 생검과 후드 아래의 다진 조직을 메스로 매우 작은 조각으로 긁어 냅니다.
참고: 적어도 20 mm x 10 mm ....
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결과
프로토콜의 회로도는 그림 1에설명되어 있습니다. 자궁 조직은 병리학자에 의해 검사 된 후 수술에서 얻어졌습니다. 자궁내막은 스크레이핑에 의해 근막으로부터 분리되었고, 자궁내막 조직은 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포에 효소적으로 소화되었다. 상피 및 기질 세포를 아가로스 몰드의 마이크로웰에 첨가하였다. 배양 7일 후, 오르가노이드를 추가로 7-14일 동안 E 및 T로 처리하였다.
조직학적 처리를 위해, 자궁내막 오르가노이드를 포함하는 아가로스 형은 아가로스로 밀봉하고 4% PFA를 밤새 고정했습니다. 이들 몰드는 표준 파라핀 포함, 단면화 및 기관학, 면역형광 또는 면역성 화학을 위해 염색되었다. 헤마톡신 및 에오신(H&E)염색(도 2A)은중앙에 있는 세포와 세포를 일렬로 세우는 단일 층의 세포를 가진 스페로이드와 같은 구조를 밝혀냈다........
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토론
우리는 외인성 스캐폴드 물질을 사용하지 않고 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 1차 자궁내막 상피 세포가 오르가노이드6,7을형성할 수 있다는 것이 이미 나타났지만, 이들 세포는 마우스 육종 세포에 의해 분비된 단백질의 젤라틴 매트릭스에 내장되었다(재료 표참조). 형성 스페로이드 와 같은 구조. 또한, 자궁내막 기질 세포는 결석하였다. 우리는 자궁내막 조직의 필수적인 지지 성분인 우리 시스템의 기질 세포가 상피 세포가 부착하고 파라크린 신호가 세포 유형 간에 발생하도록 스캐폴드를 제공했다고 추측합니다. 기질 세포 의 주위에 상피 세포의 조직은 생리적인 단서를 제공하는 2개의 세포 모형 사이 액티브한 상호 작용을 표시했습니다. 자궁 내막의 호르몬 반응이 상피 세포와 기질 세포 사이의 파라크 상호 작용에 의존함에 따라.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 NIEHS/NIH/NCATS UG3 교부금(ES029073)과 노스웨스턴 페인버그 의과 대학 기금(JJK)에 의해 지원되었습니다. 우리는 파라핀 포함을 위한 고정된 오르가노이드를 처리하기 위한 노스웨스턴 병리학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다. 우드럽, 버데트, 어반크 연구소를 포함한 UG3 팀 전체가 통찰력 있는 토론과 협업을 위해 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로 스 HS, 분자 생물학 학년 | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| 아가로 스 금형 | 시그마-알드리치 | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| 염화암모늄(NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-에스트라디올 | 시그마-알드리치 | E2257 | |
| 콜라겐 분해 효소, 유형 II, 분말 | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| 에스트로겐 수용체(SP1), 토끼 단클론 항체 | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| DAPI를 사용한 플루오로실드, 조직학 장착 매체 | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드 |
| 헤마톡실린 염색 용액 | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris 제형, 무수은 |
| 헤파린 용액 | STEMCELL Technologies | MammoCult 배지 | |
| 첨가 Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | MammoCult 배지 |
| 오가노이드 배지에 첨가 - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | 2 µ 보충; L/mL 헤파린 및 5 &마이크로; L/mL 하이드로코르티손 |
| 파라포름알데히드, 16% 용액 | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 인산염 완충 식염수, pH 7.4 | 시그마-알드리치 | P3813 | |
| 프로게스테론 수용체, PgR 1294, 비접합, 배양 상등액 | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| 단백질 매트릭스 - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin 항체 | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | 시그마 - Aldrich | S6014 | |
| 테스토스테론 | 시그마 - Aldrich | 86500 | |
| 트리 크롬 얼룩 | Abcam | ab150686 | |
| 왁스 필름 - Parafilm | VWR | 52858-000 |
참고문헌
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
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