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방법 논문

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

11.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60384

⸱

2019년 10월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, 2National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

초록

인간 자궁 내부증은 바디에 있는 가장 호르몬 반응하는 조직 의 한개이고 임신의 설치를 위해 필수적입니다. 이 조직은 또한 병에 걸린 될 수 있고 이환율및 죽음조차 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 인간 자궁내막 생물학을 연구하는 모델 시스템은 단일 세포 유형의 체외 배양 시스템으로 제한되었다. 또한, 자궁 내막의 주요 세포 유형 중 하나인 상피 세포는 잘 전파되거나 배양에서 생리적 특성을 유지하지 못하므로 자궁내막 생물학에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 우리는 처음으로 인간 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포로 구성된 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 이러한 오르가노이드는 어떤 외인성 스캐폴드 물질을 필요로 하지 않으며 상피 세포가 스페로이드와 같은 구조를 포괄하고 콜라겐을 생성하고 분비하는 중심에 있는 기질 세포와 편광되도록 특별히 조직한다. 에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체는 상피 및 기질 세포및 에스트로겐 및 테스토스테론의 생리적 수준으로 치료하여 오르가노이드의 조직을 촉진한다. 이 새로운 모형 체계는 전에 가능하지 않은 방법으로 일반적인 자궁내막 생물학 및 질병을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서론

인간 자궁 내막은 자궁 구멍을 일렬로 세게 하고 이식 도중 태아를 위한 첫번째 접촉으로 봉사합니다. 자궁 내막은 발광 및 선 상피 세포, 지지성 기질 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포로 구성됩니다. 함께, 이러한 세포 유형은 성 스테로이드 호르몬에 가장 반응 조직 중 하나입니다 자궁 내막 조직을 구성1. 각 생리 주기 동안 발생 하는 변화는 눈에 띄는. 자궁 내적의 적절한 성장 및 리모델링은 배아 이식이 발생할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 에스트로겐과 프로게스테론에 대한 비정상적인 반응은 임신의 성공적인 설립을 허용하지 않는 내화 자궁 내막을 초래할 수 있으며 자궁 내막 신생물을 포함한 질병을 초래할 수도 있습니다.

자궁 내막에서 발생하는 호르몬 반응 및 필수 변화를 연구하기 위해, 수술 또는 자궁 내막 생검 동안 환자로부터 절제 된 자궁 내막 조직에서 세포는 세포 배양에서 전파되었습니다. 자궁내막 기질 세포는 우선적으로 증식하고 쉽게 전파되며, 프로게스테론에 의해 유도된 분화 과정은 시험관 내에서 재흡수될 수 있다. 그 결과, 이러한 분화 과정에서 많은 것을 배웠으며,2,3. 자궁 내막에 있는 그밖 중요한 세포 모형은, 발광 및 선 상피 세포, 그러나, 전통적인 단층으로 잘 성장하지 않으며, 극성을 잃고, 노화되고, 및 제한된 증식 잠재력을 가진. 그 결과, 그들의 생물학및 인간 자궁 내적에서그들의 역할의 더 적은 알려지다. 많은 신생아가 상피 세포에서 유래하는 것처럼, 증식 또는 암세포에 의한 형질전환과 관련된 메커니즘은 완전히 정의될 수 있습니다. 게다가, 연구 결과는 호르몬 반응이 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포 사이 친밀한 paracrine 활동을 관련시키는 것을설치했습니다4,5.

최근, 자궁내막 상피 세포의 3차원(3D) 오르가노이드 배양은 자궁내막 조직에서 형성된 오르가노이드의 첫 번째 보고인 2개의 독립적인 그룹6,7에의해 확립되었다. 이들 오르가노이드는 단백질 매트릭스(Tableof Materials)내에 내장된 자궁내막 상피 세포로 구성되었으며 자궁내막 자궁내막, 기질 섬유아세포의 중요한 호르몬 반응 구획을 포함하지 않았다. 매트릭스 단백질은 로트마다 다를 수 있고 조직에서 반드시 발생하지 않는 신호 경로를 트리거 할 수 있으므로 매트릭스 단백질을 자궁 내적의 구성 요소로 대체하는 것이 이상적입니다. 현재 연구에서는, 인간 자궁내막의 상피 및 기질 세포의 비계가 없는 인간 자궁내막 오르가노이드를 생성하는 프로토콜이 제시된다. 기질 세포의 존재는 상피 세포에 대한 지원을 제공 할뿐만 아니라 자궁 내막 호르몬반응에중요하도록 설립 된 필요한 paracrine 작업을 제공합니다4,8,9 .

새로운 다세포 자궁내막 오르가노이드는 생성이 간단하고 상피 세포와 기질 세포를 모두 통합하는 자궁 내막의 모형 시스템을 제공합니다. 이 organoids는 호르몬 불균형 또는 외인성 모욕 때문에 종양 발생과 같은 질병의 장기 호르몬 변경 그리고 초기 사건을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 organoids의 복잡성은 결국 진정으로 인간 조직 생리학을 모방하기 위하여 가능하게 근심 세포와 내피 및 면역 세포를 포함하여 그밖 세포 모형을 포함하도록 확장될 수 있었습니다.

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프로토콜

자궁 내막 샘플은 노스 웨스턴 대학 프렌티스 여성 병원에서 양성 자궁 조건에 대한 일상적인 자군 절제술을 겪고 폐경 전 여성에서 수집되었다, 기관 검토 위원회 승인 프로토콜에 따르면. 연구에 포함된 모든 여성으로부터 서면 동의를 얻었다.

1. 아가로즈 금형의 준비

  1. 세포 분리를 시작하기 전에, 제조사의 지시에 따라 오르가노이드를보관하기 위해 1.5% 아가로즈 마이크로 몰드(표)를 주조 및 평형화한다.

2. 자궁내막 오르가노이드의 생성

  1. 수확 기본 기질 및 상피 세포
    1. 무균 기술을 사용하는 생체 안전 성 캐비닛에서 효소 용액 (2.5 mg / mL 콜라게 나아제 유형 I + 0.1 mg / mL DNase I을 디스파제 [500 단위]의 10 mL)에서 37 °C에서 준비하고 0.2 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 멸균 필터를 15 mL 중음관으로 합니다.
    2. 무균 기술을 사용하는 생물 안전 성 캐비닛에서 자궁 생검과 후드 아래의 다진 조직을 메스로 매우 작은 조각으로 긁어 냅니다.
      참고: 적어도 20 mm x 10 mm x 1 mm인 자궁내막 조직은 충분한 수의 오르가노이드를 생성하는 데 필요합니다.
    3. 15 mL 원엽 튜브에 효소 용액에 갓 다진 조직을 넣습니다. 뚜껑을 닫고 밀랍 필름(재료 표)으로상단을 감싸오염을 방지 합니다.
    4. 수조 또는 인큐베이터에 조직을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 부드러운 흔들림 (80−100 rpm).
    5. 50 mL 원엽 튜브에 20 μm 세포 스트레이너 위에 100 μm 세포 스트레이너를 쌓습니다. 두 스트레이너를 통해 용액을 필터링한 다음 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 10mL로 15mL 원엽 튜브를 헹구고; 재료 표) 모든 세포가 수집되도록 여과기를 통해 세척하십시오.
      참고: 유동-통과 액체는 기질 세포 및 적혈구를 포함합니다 (~20 mL 총). 상피 세포는 20 μm 스트레이너에 수집됩니다. 소화되지 않은 조직의 덩어리는 100 μm 스트레이너 위에 남아 있습니다. 소화되지 않은 조직을 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리십시오.
    6. 20 μm 세포 스트레이너를 2.1.5 단계에서 새로운 50 mL 원추형 튜브로 반전시키고 20 mL의 오르가노이드 매질(재료 표)으로스트레이너에서 상피 세포를 1 % 펜 / 스트렙으로 보충했습니다.
    7. 원원단 튜브를 5분 동안 500 x g에서 2.1.5단계및 2.1.6단계에서 원원분리합니다.
    8. 수집 된 기질 세포로 상류를 제거하고 적혈구 매물 완충액 10 mL로 펠릿을 다시 중단하십시오.  37°C에서 10-15분 동안 배양하고, 원원관을 5분 동안 500 x g에서 원원유하고, 상반신을 제거하고, 200-30μL의 오르가노이드 매체로 펠릿을 다시 중단합니다(추가 지침은 2.2.2단계 참조).
    9. 수집된 상피 세포를 사용하여 상체를 제거하고 100 μL의 오르가노이드 매체로 다시 중단합니다(추가 지침은 2.2.2 단계 참조).
  2. 파종 세포
    1. 24웰 플레이트의 웰(well 당 1곰팡이)에서 1.5%의 아가로즈 몰드를 평형화한 후, 아가로오스 몰드의 외부에 오르가노이드 매질을 제거하고 조직 배양판을 기울여 아가로오스 접시의 세포 파종실에서 배지가 되도록 할 수도 있습니다. 조심스럽게 제거하십시오.
    2. 현미경하에 상피(단계 2.1.9)와 기질(단계 2.1.8에서) 세포 현탁액을 볼 수 있습니다.  상피 또는 기질 세포 현탁액에 한 번에 100 μL에 더 많은 오르가노이드 매체를 추가하여 현탁액이 밀도가 대략 동일하도록합니다.
      참고: 상피 세포는 함께 뭉쳐질 것이고, 단일 세포 현탁액으로 상피 세포를 소화/트립시니화하는 것은 바람직하지 않습니다.
    3. 기질 세포의 1 부분을 부피별로 상피 세포의 3 부분과 결합하십시오.
    4. 아가로즈 몰드의 세포 시딩 챔버 내로 결합된 셀 현탁액의 피펫 50 μL(60,000 셀).
    5. 아가로즈 몰드가 세포로 채워지면, 24웰 플레이트의 우물에 신선한 오르가노이드 매질 400 μL을 조심스럽게 추가합니다.
      참고: 매질은 아가로즈 접시의 표면 바로 아래에 도달하고 세포가 금형에서 떠오르게하지 않습니다. 2-3 일 후에 세포가 정착하고 오르가노이드를 형성하기 시작합니다.
    6. 500 μL의 오르가노이드 배지로 매일 배지를 변경합니다.
    7. 후 2-3 일, 0.1 nM estradiol (E) 및 0.8 nM 테스토스테론 (T)로 보충되는 것으로 배지를 변경하여 상피 및 기질 세포의 조직을 촉진합니다.
      참고: 상피 및 기질 세포의 조직은 호르몬의 유무에 관계없이 발생할 수 있지만, 더 많은 오르가노이드는 호르몬의 존재에 조직됩니다.

3. 실험을 위한 자궁내막 오르가노이드 수확

참고: 실험이 끝난 후, 자궁내막 오르가노이드는 조직학 또는 RNA 분석을 위해 처리될 수 있습니다. 다음 단계는 오르가노이드를 처리하는 방법을 설명합니다.

  1. 조직학
    1. 끓여서 인산완충식염수(PBS)에 1.5%의 아가로스를 녹입니다. 액체 아가로오스를 약 50°C로 식힙니다.
    2. 해부 현미경으로 24 웰 플레이트를 기울이고 아가로즈 금형 의 외부에서 매체를 조심스럽게 피펫합니다. 조심스럽게 오르가노이드를 방해하지 않도록 아가로즈 금형의 내부에서 매체를 파이펫.
    3. 해부 현미경으로, 조심스럽게 아가로즈 접시의 챔버로 따뜻한 (50 °C) 1.5 % 아가로스의 70-75 μL피펫. 오르가노이드를 방해하지 않도록 주의하십시오.
    4. 4°C에서 5분간 식힙니다.
    5. 24웰 플레이트의 각 웰에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 넣고 4°C에서 하룻밤 사이에 오가노이드를 함유하는 전체 밀봉된 아가로즈 몰드를 고정시다. 그런 다음 파라핀 을 포함하기 위해 가공할 준비가 될 때까지 4°C에서 70% 에탄올에 보관합니다.
  2. RNA 격리
    1. 해부 현미경으로 24 웰 플레이트를 기울이고 아가로스 금형의 챔버에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다.
    2. 신선한 오르가노이드 배지 1 mL을 아가로스 몰드에 직접 피펫하여 오르가노이드가 마이크로웰에서 흘러 나오도록 합니다. 너무 많은 거품을 만들지 않도록주의하십시오.
    3. 3.2.2 단계에서 동일한 매체로 파이펫팅을 다시 반복합니다.
    4. 오르가노이드를 함유하는 모든 배지를 수집한다. 원심분리기를 최대 속도로 오르가노이드를 수집하고 RNA 추출을 진행한다.

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결과

프로토콜의 회로도는 그림 1에설명되어 있습니다. 자궁 조직은 병리학자에 의해 검사 된 후 수술에서 얻어졌습니다. 자궁내막은 스크레이핑에 의해 근막으로부터 분리되었고, 자궁내막 조직은 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포에 효소적으로 소화되었다. 상피 및 기질 세포를 아가로스 몰드의 마이크로웰에 첨가하였다. 배양 7일 후, 오르가노이드를 추가로 7-14일 동안 E 및 T로 처리하였다.

조직학적 처리를 위해, 자궁내막 오르가노이드를 포함하는 아가로스 형은 아가로스로 밀봉하고 4% PFA를 밤새 고정했습니다. 이들 몰드는 표준 파라핀 포함, 단면화 및 기관학, 면역형광 또는 면역성 화학을 위해 염색되었다. 헤마톡신 및 에오신(H&E)염색(도 2A)은중앙에 있는 세포와 세포를 일렬로 세우는 단일 층의 세포를 가진 스페로이드와 같은 구조를 밝혀냈다....

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토론

우리는 외인성 스캐폴드 물질을 사용하지 않고 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 1차 자궁내막 상피 세포가 오르가노이드6,7을형성할 수 있다는 것이 이미 나타났지만, 이들 세포는 마우스 육종 세포에 의해 분비된 단백질의 젤라틴 매트릭스에 내장되었다(재료 표참조). 형성 스페로이드 와 같은 구조. 또한, 자궁내막 기질 세포는 결석하였다. 우리는 자궁내막 조직의 필수적인 지지 성분인 우리 시스템의 기질 세포가 상피 세포가 부착하고 파라크린 신호가 세포 유형 간에 발생하도록 스캐폴드를 제공했다고 추측합니다. 기질 세포 의 주위에 상피 세포의 조직은 생리적인 단서를 제공하는 2개의 세포 모형 사이 액티브한 상호 작용을 표시했습니다. 자궁 내막의 호르몬 반응이 상피 세포와 기질 세포 사이의 파라크 상호 작용에 의존함에 따라...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 연구는 NIEHS/NIH/NCATS UG3 교부금(ES029073)과 노스웨스턴 페인버그 의과 대학 기금(JJK)에 의해 지원되었습니다. 우리는 파라핀 포함을 위한 고정된 오르가노이드를 처리하기 위한 노스웨스턴 병리학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다. 우드럽, 버데트, 어반크 연구소를 포함한 UG3 팀 전체가 통찰력 있는 토론과 협업을 위해 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로 스 HS, 분자 생물학 학년Denville ScientificCA3510-6
아가로 스 금형시그마-알드리치Z764043(https://www.microtissues.com/)
염화암모늄(NH4Cl)Amresco0621
β-에스트라디올시그마-알드리치E2257
콜라겐 분해 효소, 유형 II, 분말Thermo Fisher Scientific17101015
DispaseCorning354235
DNase ISigma-AldrichD4513
EDTAFisher ScientificBP120-1
Eosin StainVWR95057-848
에스트로겐 수용체(SP1), 토끼 단클론 항체Thermo Fisher ScientificRM-9101-S
DAPI를 사용한 플루오로실드, 조직학 장착 매체Sigma-AldrichF6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1x 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드
헤마톡실린 염색 용액Thermo Fisher Scientific3530-32Modified Harris 제형, 무수은
헤파린 용액STEMCELL TechnologiesMammoCult 배지
첨가 Hydrocortisone stock solutionSTEMCELL Technologies07925MammoCult 배지
오가노이드 배지에 첨가 - MammocultSTEMCELL Technologies056202 µ 보충; L/mL 헤파린 및 5 &마이크로; L/mL 하이드로코르티손
파라포름알데히드, 16% 용액전자 현미경 과학15710
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122
인산염 완충 식염수, pH 7.4시그마-알드리치P3813
프로게스테론 수용체, PgR 1294, 비접합, 배양 상등액Agilent TechnologiesM356801-2
단백질 매트릭스 - MatrigelBD Biosciences356231
Purified mouse anti-E-cadherin 항체BD Biociences610181Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]Abcamab92547
RNA lysis and isolation kitZymo ResearchR2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3)시그마 - AldrichS6014
테스토스테론시그마 - Aldrich86500
트리 크롬 얼룩Abcamab150686
왁스 필름 - ParafilmVWR52858-000
에 07980

참고문헌

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  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
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  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

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