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방법 논문

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

7.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

2020년 3월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

이 논문에서

요약

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

초록

1970년대 초, 연구자들은 유방 상피 세포를 쥐의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 성공적으로 이식했습니다. 이식 기술을 사용하여 유방 상피를 이식하는 것은 사춘기 설치류 호스트가 제공하는 호르몬 환경을 이용합니다. 이 연구 결과는 이상적으로 유선 발달에 각종 생물학 조작의 충격을 탐구하고 유선 생물학의 많은 양상을 해부하기 위하여 적당합니다. 일반적인, 그러나 제한, 특징은 이식된 상피 세포가 강하게 주변 기질에 의해 영향을 받고 내인성 상피에 의해 경쟁된다는 것입니다; 네이티브 유방 조직을 이용하기 위하여는, 복부 inguinal 백색 지방 패드는 이식의 앞에 호스트 유방 상피를 제거하기 위하여 삭제되어야 합니다. 쥐 모형 유기체를 사용할 때 중요한 장애물은 포스트 위들링 한 쥐에서 개발 유방 나무를 지우는 것이 효율적이지 않다는 것입니다. 선 없는 지방 패드로 이식 하는 경우, 기증자 상피 세포 는 삭제 된 호스트 지방 패드를 다시 채우고 기능성 유선을 형성 할 수 있습니다. 중간 지방 패드는 이러한 접목에 대 한 대체 위치. 주요 장점은 그것은 덕트 구조부족 아직 상피 성장을 촉진하는 데 필요한 정상 기질을 제공하고 쥐에서 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 또 다른 주요 장점은 최소 침습적이라는 것입니다. 추가적으로, 중간 지방 패드는 접목을 위한 사이트를 분리하기 위하여 이용될 수 있는 내측 혈관을 포함합니다. 내 인 성 동맥 그대로 남아 있기 때문에, 이 기술은 또한 이식 된 동맥에 내 인 성 유선 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 이 논문은 쥐의 간경엽 백색 지방 패드로 유방 상피 세포 이식의 방법을 설명합니다.

서론

출생 후 유방 선 발달 및 덕트 형태 형성은 사춘기의 개시에 호르몬 신호에 의해 크게 영향을 받은 프로세스입니다. 쥐와 쥐에서, 유선 생물학의 일반적으로 사용되는 모형 유기체에서는, 이 프로세스는 성숙한 자렌치종의 대형귀착되는 급속한 증식 및 분화 귀착되는 나이의 약 3 주에서 시작됩니다. 성숙한 유방 동맥은 확장과 불굴의 수많은 라운드를 겪을 수 있습니다, 초기 20세기 부터 조사를받고있다 속성. 과확산과 암 발달의 맥락에서, 유선 이식 기술은 1950년대1에개발되었고, 1977년2,3,4. 설치류에서 이식 기술의 정제는 여전히 널리 정상적인 유선 개발 및 질병 상태에 대한 다양한 치료 및 유전 조작의 효과를 연구하는 데 사용되는 정상적인 유선 생물학을 이해하는 주요 발전에 기여하고있다.

많은 가설이 생성되고 이후에 유선 이식을 사용하여 시험되었습니다, DeOme 외에 의해 처음 기술된 19591. 수십 년에 걸친 실험은 전체 지방 패드5,6,7을 다시 채우기 위해 기증자 유방 땀샘에서 절제된 덕트 조직의 성향을 보여주었고, 유선 발달의 중요한 성분이 이러한 상피 구조에 존재한다는 것을 나타냈다. 나중에 마우스에서 연구한 결과, 단일 유방 줄기 세포가 지운 지방 패드를 다시 채울 수 있고 기저 및 발광 유방 상피 세포의 단일, 일반적인 전구의 발견에 기여할 수 있음을 보여주었다8,9,10. 이러한 결론에 따라, 이식은 가소성의 결과로 다선 재채기 잠재력을 가진 세포의 풀을 증가시켜 접목 된 세포가 기능성 유선7,10,11,12,13을성장시킬 수 있도록 하는 것이 제안되었다. 중요한 것은, 설치류에서 이식 기술의 사용은 세포 배양 유발이상(14)의 한계를 극복하고 종종 단지 몇 주 만에 결과를 제공한다.

절차는 원래 마우스에 있는 preneoplastic 병변의 맥락에서 기술된 동안, 그것은 곧 쥐로 확장하고 암 감수성의 측정으로 다형성을 확립하기 위하여 발암물질 처리와 함께 이용되었습니다15,그러나 이식 기술의 대중성은 각 종에 대한 유전 공구의 발달을 따랐습니다. 이식을 통합하는 마우스 연구 결과는 많은 번역 사실 인정을 기여했더라도, 쥐 유방 선의 garenchyma는 인간을 더 밀접하게 닮은16,17 및 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 유방암을 공부를 위한 명백한 이점을 제안합니다. 유방 종양은 두 종에서 유도할 수 있습니다, 그러나 호르몬 감도 및 유전자 발현 단면도식으로 다릅니다. 1 차적인 다름은 쥐 유방 종양이 표현하고 난소와 뇌하수체 호르몬 수용체, 즉, 에스트로겐과 황체 호르몬 (PR)의 기능에 달려 있다는 것입니다, 인간 유방암의 발광A 특수형과 유사. 실제로, 유방 상피 세포 이식은, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 유방암에 관여하는 유전적 변이체를 연구하고 유방 상피 세포에 대한 영향의 세포 자율성을 결정하는 데 사용되어 왔다18.

종양 생물학 이외에, 일반적인 래트 유방 선의 덕트 상피는 분지의 더 높은 수준을 전시하고 마우스 보다는 기의 두꺼운 층에 의해 측면됩니다. 기질의 중요성은 유방 상피 이식 연구 결과에서 잘 문서화됩니다. 유방 상피는 지방 기질과 상호 작용해야하며, 이상적으로는 그 자체의 중간엽으로 특징적인 형태 형성19,20을겪어야합니다. 수용자 유선으로 조직을 이식하는 것은 최적의 환경을 제공합니다. 그러나, 내인성 상피의 존재는 결과를 방해할 수 있습니다. 내인성 상피의 유방 선사전 클리어링은 일반적으로 마우스 이식 검사에서 수행되며 내인성 유방 조직의 외과 적 절제 및 / 또는 젖꼭지 의제거가필요합니다1,21,22. 가능하지만, 유동 후 쥐에서 유방 상피를 미리 지우는 것은 널리 수행되지 않습니다, 주로 때문에 후 weanling 쥐에서 성장하는 유방 나무를 지우기의 무효. 체내 의 지방 조직의 영역이 이식 된 유방 상피21,23,24의성장을 지원할 수 있음을 보여주었기 때문에, 조직을 중간 흰색 지방 패드로 이식하여 쥐에서 사전 지우기 과정을 쉽게 피할 수 있습니다.

이 논문에 기술된 이식 방법은 효소 해리 유방 선 오르가노이드 (유방 덕트 상피 및 형태 형성이 가능한 다른 세포 유형의 단편) 또는 실험실 쥐의 인간, 등소 성 또는 인원성 균주에서 간경질 지방 패드에 단산분리 된 세포를 주입하는 것을 포함합니다2. 간경막 지방 패드는 일반적으로 유방 조직이 없기 때문에, 내인성 상피를 미리 지울 필요없이 여러 이식 부위에 적합한 환경을 제공합니다. 그 결과, 숙주 동물의 내인성, 복부 인과 유방 땀샘은 외과 조작의 대상이 되지 않으며 정상적으로 발달하며 결과 해석을 방해할 수 없습니다. 부가적으로, 온전한 유방 땀샘은 유방 상피 발달 및 종양발생에 대한 호스트 대 공여자 효과를 평가하기 위해 비교를 위해 사용될 수있다 18,25. 단일 줄기 세포로부터 유방선의 재모집단은 마우스에 사용할 수 있지만, 쥐를 위해 아직 개발되지 않았으며, 주로 쥐 유방 줄기 세포25,26,27을선택할 항체의 가용성부족으로 인해 개발되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 재채백 전위를 정량화하기 위해 단산이 분산된 유방 상피 세포의 이식은 성공적으로 수행될 수 있고, 이들 세포는 적절한 프레임워크2,3,4로이식될 때 정상적으로 발전할 것이다. 오르가노이드는 여러 가지 용도로 양호하지만, 단산성 세포는 양적 적용을 위해 요구되며, 예를 들어, 이온화 방사선치료(28)에 이어 암 개시에 필요한 유방 상피 세포의 수를 결정하거나 세포학적으로 선택된 유방 상피 세포 집단의 특성을 비교하기 위해29.

현재까지, 여기에 설명 된 절차는 유방 선 개발 및 유방암 발달의 기본 메커니즘을 연구하는 전반적인 목표를 가진 쥐에서 유선 이식을 수행하는 가장 강력한 방법입니다. 종종, 기증자 및/또는 수용자 동물은 상피 이식 전, 도중 또는 후에 다른 변수에 드러릅니다. 예로는 화학발암 발생30,방사선28,31,32,호스트/공여자 게놈18의유전자 조작 및 호르몬 조작12를포함하는 단일 유전자 연구가 있다. 이 프로토콜에 기술된 효소 해리의 주요 장점은 유세포 분석, 3-D 배양, 유전자 편집 등을 포함하는 상피 오르가노이드 또는 단산성 세포를 분리할 수 있는 기회입니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램은 유전 공학기증자 및 / 또는 호스트 조직의 추가 조작을 포함 할 것이다. 예를 들어, 공여자 세포는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 사용하여 임의의 선택된 게놈 궤적에서 생체 외 를 유전적으로 변경할 수 있다. 유사하게, 수신자 쥐는 또한 기증자와 수령인 공학한 유전 요인 사이 상호 작용을 공부하기 위하여 유전으로 변경될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물은 AAALAC 승인 시설에 보관및 유지되었으며, 이 프로토콜에 설명된 실험은 MUSC 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 상호 이식에 사용하기 위한 동물은 근친 또는 등인성 균주여야 하며, 선천상태는 적어도 6세대 동안 선호되거나 역교차되어야 한다.

1. 수확 기증자 쥐 유방 선 상피

  1. 이식에 필요한 기증자 쥐의 수를 결정합니다.
    참고: 일반적으로, 1 명의 기증자 쥐 (4 주) 4 받는 사람 동물에 이식에 대 한 충분 한 세포를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특정 응용 프로그램에는 추가 수의 셀이 필요하며 총 수율에 변형별 차이가 있을 수 있습니다.
  2. 모든 소모품에 라벨을 부착하고 외과 의사의 접근 가능한 배치를 확인합니다(표1).
  3. 각 여성 기증자 쥐의 체중을 기록합니다. 기증자 쥐를 완전히 마취하거나 안락사시키기 위해 제도적 지침을 따르십시오. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
  4. 동물을 멸균 수술장으로 옮김시. 동물을 등에 놓고 70% 에탄올로 복부 표면 전체를 살포합니다.
  5. 흉부, 복부 및 심구 유방 땀샘에 접근 할 수 있도록 시상, X 자형 절개를 합니다. 가위를 사용하여 기증자 쥐로부터 모든 유방 선 조직을 해부(그림 1). 눈에 보이는 모든 림프절을 제거합니다.
  6. 집게를 사용하여 유방 조직을 추출하고 얼음에 라벨이 붙은 60mm 접시에 놓습니다. 60mm 접시에 500 μL의 무혈청 DMEM/F12 용지를 추가합니다. 유선 조직의 배치를 조정하여 완전히 젖은 상태로 유지하십시오.
  7. 가위를 사용하여 유방 조직을 잘게 다듬습니다. 이렇게하려면, 조각으로 조직을 잘라 1-2 mm3 크기(그림 1C). 모든 기증자 조직이 수확 될 때까지 얼음에 동맥을 유지 (60 분 을 초과하지 마십시오).
    참고 : 추가 인력은 유방 땀샘을 다듬고 외과 의사가 조직 추출을 진행하는 동안 콜라게 나제 용액을 추가로 준비 할 수 있습니다.

2. 안락사 기증자로부터 뇌 조직 추출

  1. 기증자 동물의 시체를 조심스럽게 뒤집어 서 경향이 있는 위치에 놓습니다. 핀으로 고정합니다. 70% 에탄올로 머리와 뒤쪽을 살포합니다.
  2. 두개골의 기지를 찾아 후두 콩질 아래에 절개를합니다. 피부 아래에 날카로운 가위를 삽입하고 머리의 측면을 포함하여 두개골에서 피부를 잘라.
  3. 뼈 커터 나 강한 가위를 사용하여 후두골에서 정면 뼈까지 중간선을 따라 두개골을 자른다. 블레이드를 가능한 한 피상적으로 유지하고 기본 뇌 조직의 파괴를 방지하기 위해 위쪽으로 각도를 유지하십시오.
  4. rongeurs 또는 강한 집게를 사용하여 뼈를 벗겨냅니다. 소뇌에 도구를 측면으로 삽입하여 양쪽의 뼈를 부러뜨려 뼈가 있는 청각 운하를 노출시다. 수막과의 연결을 끊습니다.
  5. 구부러진 미세 팁 집게로 뇌를 부드럽게 들어 올립니다. 호일 조각에 뇌를 놓고 무게를 기록 한 다음 즉시 얼음에 저장된 동일한 양의 (w : v)의 미디어로 15 mL 튜브로 옮김하십시오.
    1. 선택적으로, 필요한 경우, 이식 절차에 추가 사용을 위해 뇌 하 수 체를 제거 하는 미세 팁 집게를 사용 하 여 (뇌 아래 위치).
  6. 조직을 방해하기 위해 기계적 균질제를 사용하십시오. 저속으로 10-15s의 뇌를 균질화하십시오. 혼합물을 적어도 1 분 동안 얼음에 앉게한 다음 다시 균질화하십시오. 최종 혼합물이 큰 조각이 없는 경우 균질화로 충분합니다.
  7. 100 μm 필터를 통과하여 균질체를 걸립시다. 사용 될 때까지 얼음에 여과액을 유지 (미만 4 시간).

3. 유방 선 추출물의 소화 및 처리

  1. 지시된 대로 해동 또는 온난 시약을하였다(표 1). 오르가노이드 또는 단분산 세포를 복구하기위한 적절한 단계를 따르십시오.
  2. 모든 기증자 동물에 대해 혈청이 없는 소화 매체 10 mL(콜라게나제 제외)를준비합니다(보충 파일 1).
    참고: 사용되는 소화 매체의 부피는 그룹화 된 조직을 수용하기 위해 조정 (확대 또는 축소)할 수 있습니다(해당하는 경우).
    1. 오르가노이드의 경우 3.3으로 건너뜁니다.
    2. 단산세포의 경우, 혈청이 함유되지 않고 콜라겐나아제 소화제 외에 신선한 단색분해 혼합물 및 불활성화 용액(보충파일 2, 보충 파일 3)을준비합니다. 3.3 단계로 진행합니다.
  3. 기증자로부터 의 모든 유방 조직을 추출하고 다진 경우, 콜라게나아제 효소를 따뜻한(또는 실온) 소화 매체에첨가한다(보충파일 1). 반전하여 섞는다.
  4. 콜라게나아제 소화 매체를 20 μm 필터를 통과시다. 소화를 위해 라벨이 부착된 50 mL 튜브에 여과된 매체 10 mL을 분배합니다.
  5. 각 샘플에 대해 새로운 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하고 다진 기증자 조직을 각 60mm 접시에서 콜라주나제 소화 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다. 1,000 μL 팁끝에서 1cm 떨어진 곳에서 잘라내고 사용하기 전에 장치에 수동으로 놓습니다. 다진 티슈를 1-2회 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
    참고 : 조직이 이송 중에 피펫을 만들기 어려운 경우 50 mL 튜브에서 소량의 콜라게나아제 소화 매체를 사용한 다음 다시 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 제거하십시오.
  6. 샘플을 흔들리는 인큐베이터에 수평 위치에 놓고 샘플이 37°C, 200-220 rpm에서 1.5-2h를 소화할 수 있도록 합니다.
    1. 오르가노이드의 경우 3.7로 건너뜁니다.
    2. 단분산 세포의 경우 소화의 마지막 10 분 동안 혼합물에 DNase I (0.2 μg / mL)를 추가합니다. 이전과 같이 활발한 흔들림으로 배양하십시오. 3.7단계로 진행합니다.
  7. 조직이 완전히 소화되면, 펠렛 1,200 x g에서 10 분 동안 차가운 원심분리 (4 °C)를 사용하여 현탁액(도 1D).
    참고: 세포의 생존력을 높이기 위해 모든 단계 사이에 얼음에 튜브를 보관하십시오.
  8. 펠릿이 형성되었는지 확인하고 상류층과 지방 층을 조심스럽게 붓습니다. 신선한 DMEM/F12 용지 10mL에서 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
  9. 약 10s에 대해 68 x g에서 짧게 돌입니다. 세포의 명확한 분리가 없는 경우 스핀의 길이(속도는 아님)가 증가할 수 있습니다. 진행하기 전에 펠릿을 육안으로 검사합니다(그림1D).
  10. 조심스럽게 작은 볼륨을 남기고 상급을 제거하십시오. 오르가노이드 또는 단분산 세포가 필요한지 여부에 따라 다음 단계로 진행하십시오.
    참고 펠릿이 매우 느슨하기 때문에 튜브에 소량의 용지를 두는 것이 중요합니다. 잔류 매피는 세척 단계를 통해 희석됩니다.
    1. 오르가노이드의 경우, DMEM/F12 용지의 10mL 부피를 더 추가하고 세척/스핀을 반복합니다. 두 번째 세척 후, 여과를 위해 DMEM/F12 용지의 더 작은 부피(1-2 mL)로 세포를 다시 정지시. 3.11 단계로 진행합니다.
    2. 단분산 세포의 경우, 미리 온난한 HBSS 2 mL에 0.025%(v) 트립신 및 6.8 mM EDTA로 용해합니다. 37°C에서 3-5분 동안 소화합니다. 즉시 비활성화합니다.
      1. 트립신을 비활성화하는 것을 막기 위해 10% FBS로 DMEM/F12 4mL를 추가합니다.
      2. 5 분 동안 270 x g에서 세포를 돌린 다음 10 % FBS로 DMEM / F12에서 다시 일시 중단하십시오. 3.11 단계로 진행하여 셀을 필터링합니다.
  11. 새로운 50 mL 튜브에 배치 된 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 필터링합니다. 세포를 현탁하는 데 사용되는 동일한 염기 배지의 1 mL을 파이펫팅하여 스트레이너를 미리 적신 다음, 덕트 파편/오르가노이드를 수집하기 위해 파이펫을 사용하여 필터를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
    참고 : 단일, 4 주 된 기증자 쥐의 유선 조직에서 여과 된 상피의 대략적인 수율은 1 x 106 세포입니다.
    1. 오르가노이드의 경우 여과액을 폐기하십시오. 유방 오르가노이드는 세포 스트레이너의 바구니 안에 남아 있고 더 작고, 원치 않는 세포는 제거될 것입니다. 새로운 50 mL 튜브를 통해 세포 여과기를 반전하고 세포를 수집하는 데 필요한 모든 부피로 헹구십시오. 3.12 단계로 진행합니다.
    2. 단산성 세포의 경우, 유방 상피 세포가 더 작은 기질 및 면역 세포와 함께 필터를 통과하기 때문에 세포 여과기를 버리고 여과액을 유지하십시오. 소화/원심분리에 사용된 튜브를 10% FBS로 DMEM/F12의 다른 부피로 헹구고 동일한 세포 여과기를 통과합니다. 1,200 x g에서 원심분리에 의해 단산분리된 세포를 5분 동안 펠렛. 3.12단계로 진행한다.
      참고: 다시 일시 중단된 셀은 후속 응용 프로그램에 사용할 준비가 되었습니다.
  12. 펄스는 용액을 회전시키고 다음 단계로 진행하기 전에 세포 펠릿의 형성을 보장합니다. 필요한 경우 펄스가 다시 회전합니다.
  13. 조심스럽게 장식품을 제거하십시오. 펠릿을 소량(1,000-2,000 μL의 DMEM/F12)으로 다시 일시 중단하여 계수를 위한 세포를 집중시다.
  14. 세포를 세고 필요한 경우 희석하십시오. 각 동물에 대한 DMEM/F12 매질의 20 μL에서 이식용 원하는 세포 수를 다시 중단합니다. 항상 얼음에 세포를 유지.
    참고: 공여체 세포는 연구의 종점에 기초하여 각 접목 부위에 대해 1 x 105 - 1 x 106 셀의 범위에 요구될 것이다. 예를 들어, 발암 실험은 종종 다른 응용 프로그램에 비해 이식 된 세포의 더 많은 수를 필요로한다. 필요한 셀의 수는 각 균주에 대해 실험적으로 결정되어야 합니다. 본 프로토콜에 기재된 절차는 3.16단계에서 설명한 바와 같이 뇌 균질화와 혼합하기 전에 이식 부위당 20 μL 미디어에서 250,000개의 공여자 세포를 활용하였다.
  15. 다른 실험에 필요한 세포의 임의의 aliquot(들)를 준비한다(예를 들어, FACS 격리3,26,27,30,33).
    1. 오르가노이드의 경우 3.16 단계로 진행하십시오.
    2. 단분산 된 세포의 경우, Trypan 또는 메틸렌 블루 염색을 사용하여 가능한 세포를 정량화한 다음 진행하십시오.
  16. 모든 이식 수령인을 위해 기증자 물질의 단일 배치를 준비합니다. 이식의 모든 부위에 대해 50% 뇌 균질화(20 μL)와 동일한 양의 세포 현탁액(20 μL)을 결합합니다.
    참고: 각 현장에는 현장당 총 40μL이 주입되지만 폐기물에 대해 최소 25%의 추가 부피를 포함하는 것이 좋습니다.
  17. 즉시 이식 또는 나중에 이식에 대 한 세포를 동결 진행 (잠재적인 정지 지점).
    참고: 냉동 세포는 이 프로토콜로 테스트되지 않았으며 이식 실험을 위해 동물 코호트를 생성하기 전에 최적화가 필요합니다. 신선한 세포를 이식하는 것이 좋습니다.

4. 이식 절차 (수령인 쥐 4-5 주 나이)

  1. 각 수령인 쥐를 무게와 절차에 사용되는 승인 된 진통제의 정확한 복용량을 계산합니다.
    참고: 신체 분동은 시술 전에 최대 24시간까지 측정할 수 있습니다. 면도 기간 동안 각 동물을 제한하거나 간략하게 마취하려면 기관 지침을 따르십시오.
  2. 전기 클리퍼를 사용하여 각 동물의 수술 부위를 면도하십시오. 두개골의 기저부와 척추 기둥의 시작을 식별합니다. 척추 를 내려가는 방법의 약 1/3, 뒤의 상부 흉부 부분에 3cm x 2cm 영역을 면도하십시오.
    참고: 면도는 이식 당일 마취하에 도행할 수 있지만 멸균장 밖에서 수행해야 합니다. 필요할 때까지 쥐를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
  3. 이식에 필요한 모든 소모품을찾습니다(표 1).
  4. 사용하기 전에 실험실 동물 마취 시스템을 평가하십시오. 유체를 위로 하고 필요한 탱크 나 부품을 교체하십시오. 마취 챔버에 가스 라인이 열려 있는지 확인하고 모든 주변 라인이 닫혀 있으므로 이소플루란 마취 및 산소는 챔버에 배치되면 동물에게 자유롭게 흐를 수 있습니다.
  5. 수령인 동물의 체온을 지원하는 따뜻한 가열 패드.
  6. 수술에 사용할 멸균 필드를 생성합니다. 표 1에설명된 대로 소모품을 정렬합니다.
  7. 제도적으로 승인된 동물 관리 프로토콜에 의해 표시된 대로 수용자 쥐에게 수술 전 진통제를 투여하십시오.
  8. 멸균 된 DMEM / F12 매체로 해밀턴 주사기를 씻어 세포 손실을 방지하십시오. 바늘이 주사기의 몸에 고정되어 있는지 확인하고 바늘을 액체에 삽입하고 플런저를 다시 그립니다. 최대 볼륨으로 채웁니다. 플런저를 아래로 누르고 내용물들을 폐기물 수거 튜브로 배출합니다. 3-5회 반복합니다.
  9. 기증자 물질(3.16단계에서 제조)의 전체 부피를 각 조건(예: 제어, 처리, 야생형, 녹아웃 등)에 대해 별도의 주사기에 로드합니다. 바늘 의 끝을 액체에 삽입하고 플런저를 다시 그리고 튜브의 부피가 감소함에 따라 혼합물의 표면 아래에 바늘을 유지하십시오.
    참고: 각 주사기에 10% 이상의 추가 볼륨을 포함합니다. 남은 혼합물을 튜브를 닫고 더 필요한 경우를 대비하여 얼음에 보관하지 마십시오.
  10. 주사기가 완전히 적재된 후 주사기를 반전시키고 플런저를 약간 눌러 바늘 끝에 있는 기포를 제거합니다. 모든 것이 준비되면 다음 단계로 진행하십시오.
    참고: 바늘 끝이 멸균 장 내에서도 다른 표면에 닿지 않도록 하십시오. 세포의 생존을 촉진하기 위해 얼음의 작은 용기 위에 주사기의 몸을 휴식하는 것이 도움이됩니다.
  11. 수령인 동물을 마취실에 놓고 기계를 켭니다.
  12. 동물이 완전히 이완되면 (챔버의 두드리거나 부드러운 움직임에 반응하지 않음), 마취를 코 콘에 지시하고 동물을 멸균 장으로 옮김시.
    참고: 마취의 연장된 기간은 쥐에 의해 잘 용납되지 않습니다. 각 동물에 대한 절차를 10 분 이내에 완료하십시오.
  13. 동물을 (위장에) 걸리기 쉬운 위치에 두어 머리와 척추 의 뒤쪽에 접근 할 수 있도록하십시오.
    참고 : 항상 동물에 대한 적절한 열 지원을 확인하고 정기적으로 단단한 발가락 핀치를 사용하여 마취의 깊이를 평가합니다.
  14. 선택적으로, 눈의 건조를 방지하기 위해 안과 수의사 연고를 적용하십시오.
  15. 갓 면도한 부위를 청소하여 여분의 모발을 제거합니다. 원형 운동을 사용하여 피부에 70 % 에탄올 (또는 다른 시약, 기관 지침당)을 적용한 다음 방부제 (예 : 요오드)를 반복합니다. 수건 드레이프를 동물 위에 놓아 면도 부위의 부위만 노출되도록 합니다.
  16. 동물이 단단한 발가락 핀치로 깊은 자극에 반응하지 않는 지 확인하고 다음 단계로 진행하십시오.
  17. 날카로운 수술 용 블레이드를 사용하여 작은 (2cm) 간절개를합니다.
    참고 : 지방 패드가 피부 바로 아래에 있기 때문에 컷은 피상적이어야합니다.
  18. 방향을 위해 내측 혈관을 찾습니다(그림2B).
  19. 포인을 사용하여 절개의 한쪽에 피부를 들어 올리고 이식이 수행되는 동안 지방 패드에서 멀리 유지(그림 2B). 접목 부위에 바늘을 삽입합니다.
    1. 선택적으로, 조직 안쪽에 바늘의 끝을 이동하고 세포를 수집하는 작은 주머니를 만듭니다. 작고 반복적인 동작을 사용합니다. 바늘을 제거하지 마십시오.
      참고: 이 단계는 프로토콜을 처음 사용할 때 권장됩니다. 주머니를 만들 때 는 매우 섬세 한 지방 패드 조직으로 주의 사용.
  20. 세포 혼합물의 40 μL을 중간 지방 패드 조직에 조심스럽게 주입합니다. 바늘을 천천히 제거합니다.
  21. 조직을 제자리에 잡고 이식된 세포가 3-5초에 정착하도록 하십시오.
  22. 바늘을 제거합니다. 이식의 두 번째 부위에서 주사 절차 (단계 4.18-4.21)를 반복하십시오.
    참고 : 한 기증자 그룹에서 상피는 모든 동물의 지방 패드의 동일한 측면에 주입 할 수 있습니다, 또는 외과 의사의 손 지배에서 배치 효과를 방지하기 위해 측면을 교대로.
  23. 상처 클립이나 봉합사를 사용하여 수술 상처를 닫은 다음 마취를 중단하십시오.
  24. 제도적으로 승인된 프로토콜에 의해 지시된 수술 후 진통제를 제공합니다.
  25. 즉시 열 지지대와 함께 복구 케이지로 동물을 이동합니다. 절개 또는 호흡 곤란에서 출혈과 같은 고민의 표시를 감시하십시오.
    참고: 동물은 5-10분 이내에 완전히 회복되어야 합니다. 생존 절차 후 동물을 식민지로 되돌리기 위한 제도적 지침과 수술 후 모니터링을 참조하십시오.
  26. 선택적으로, 이식 후 3-4주 후에 수용인 쥐에게 발암물질을 투여하여 이식 부위에서 발암 연구를 수행한다.
    참고 : 전형적으로, 쥐 유방 발암은 50-57 일에서 화학 발암 물질 치료를 사용하여 수행됩니다. 이 치료는 이식 수술의 나이를 지시 (사이 수행해야 29-36 나이의 일) 유방 선의 성장을 시작하는 이식 세포에 대한 충분한 시간을 허용.

5. 상피 성장평가

  1. 매일 질 세척을 통해 쥐의 발초 주기를 모니터링하고 현미경 슬라이드에 세포학을 검사합니다. 연구 종료점 8-12일 전에 시작하십시오. 같은 단계에 있는 모든 쥐를 희생한다. 이 단계는 선택적 단계입니다.
    참고 : 쥐 에스트러스 주기는 4-5 일입니다. 동물이 1-2 전체 주기를 통과 할 수 있도록하면 이전 사이클의 세척 슬라이드를 비교하는 데 사용할 수 있으므로 해석이 용이합니다.
  2. 이식 후 6-8주, 기관 지침에 따라 이식 수용자 쥐를 희생한다.
    참고: 자성장은 일반적으로 이식 후 3-6 주 검출, 하지만 추가 시간이 필요할 수 있습니다.
  3. 동물을 쉬운 위치에 놓고 70 % 에탄올로 몸을 청소하십시오. 포셉으로 피부를 들어 올리고 척추 열을 따라 절개를하여 중간 지방 패드를 노출시십시오. 지방 패드의 대부분이 볼 수 있도록 조직에서 멀리 피부를 해부.
  4. 중간 지방 패드에서 이식 부위를 분리하는 내측 혈관을 식별합니다. 전체 패드를 단일 조직으로 절제하거나 혈관을 따라 자르고 측면을 개별적으로 제거하십시오.
  5. 전체 마운트를 위해 양전하 현미경 슬라이드에 조직을 놓습니다. 무딘 집게 2 쌍을 사용하고 부드럽게 슬라이드에 원래의 형태를 복원하기 위해 조직을 확산.
    참고 : 쥐 유방 조직은 매우 섬세합니다. 조직의 가장자리는 그 자체로 말릴 수 있습니다. 티슈가 슬라이드에 부착될 때까지 항상 조심스럽게 다루고 제자리에 고정하십시오(몇 초).
  6. 비교를 위해 내인성 복부 환각 유방 땀샘 중 적어도 하나를 홀 마운트 (방향을 위한 림프절).
  7. 슬라이드를 70% 에탄올에 7-10일 동안 놓고 조직을 해체합니다. 조직이 마르지 않도록 필요한 만큼 자주 에탄올을 보충하십시오.
  8. 명반 카민 얼룩을 준비하고 조직이 충분히 불투명 할 때 슬라이드를 처리합니다. 사용 전에 얼룩이 식도록 하십시오(보충 파일 4).
    참고: 얼룩은 고정 및 재수화 단계의 하루 전에 최대 1일까지 준비할 수 있습니다. 이 용액은 4 °C에서 보관할 수 있으며 재사용 가능성이 제한적입니다.
  9. 슬라이드를 25 % 빙하 아세트산에 배치하여 조직을 고정하십시오 : 75 % 에탄올을 60 분 동안.
    1. 에탄올 의 감소 농도의 일련의 3 세차의 시리즈를 통해 조직을 다시 수화 : 15 분 동안 70 % 에탄올, 5 분 동안 50 % 에탄올 5 분 및 dH2O 5 분.
  10. 4-8 일 동안 명반 카민으로 얼룩을 지입니다. 얼룩이 조직에 완전히 침투했는지 확인하려면 매일 슬라이드 뒷면을 확인하십시오. 염색이 완료되면 다음 단계로 진행하십시오.
    참고: 글랜드의 가장 두꺼운 부분에 보라색 색조가 있고 더 이상 흰색으로 나타나지 않는 경우 염색이 완료됩니다.
  11. 에탄올의 농도가 증가하는 일련의 슬라이드를 통해 슬라이드를 탈스테인하고 탈수시면 30분 동안 70% 에탄올, 30분 동안 95% 에탄올, 30분 동안 100% 에탄올을 탈수한다.
  12. 탈수된 슬라이드를 3일 이상 자일렌에 놓고 조직을 지웁습니다. 장기간 보관을 위해 미네랄 오일로 옮깁니다.
  13. 슬라이드가 지워진 후 저출력 광 현미경 또는 고해상도 디지털 사진을 사용하여 분석을 위해 슬라이드이미지를 수집합니다. 모든 슬라이드에 대해 이미지 수집 매개 변수가 일관되도록 합니다.
    참고 : 상피 의 파생은 명확하게 구별해야합니다.
  14. 이진 결과로 파생의 존재를 처리합니다.
  15. 획득 된 이미지를 사용하여 이식 부위의 50 %에서 ≥1 유방 자성장을 생성 한 이식 된 상피 세포의 평균 수를 계산합니다. 필요에 따라 다른 물리적 기능을 정량화합니다.

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결과

기증자 및 수령인 유방 땀샘
이식용 쥐 유방 상피 세포를 분리하고 준비하는 단계는 도 1A에나타내고 있다. 나이 4 주에, 기증자 쥐의 내인성 유방 동맥은 성숙을 시작하고 상피는 명반 카민으로 얼룩진 전체 장착 된 슬라이드에 시각화 될 수있다(그림 1B). 이 나이에 1명의 기증자 쥐는 이식을 위한 대략 1 x 106 세포를 제공할 것입니다. 수집된 공여자 조직의 양이 부족하거나 후속 다듬기의 양이 불충분하면, 콜라게나아제 소화 후 세포의 수율이 낮을 수 있다. 따라서 기증자로부터 가능한 한 많은 유선 조직을 수집하는 것이 중요합니다. 완전히 소화 된 유방 선 조직은 현탁액에 눈에 보이는 조직의 조각...

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토론

이 프로토콜은 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화 된 유방 상피 세포 이식 기술을 설명합니다. 기증자 쥐에서 격리 된 유방 상피 오르가노이드 (나이의 3-5 주)는 수용자 쥐의 중간 흰색 지방 패드로 접목됩니다 (또한 3-5 주). 결과는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 이식된 조직을 검사하기 위하여 4-6 주 후에 조금으로 해석될 수 있습니다; 그러나, 이식과 희생 사이의 최적의 시간은 전체 실험을 구현하기 전에 결정되어야한다. 너무 적거나 너무 많은 시간이 경과한 경우 결과는 해석할 수 없거나 의미가 없습니다. 프로토콜을 최적화하기 위해 이식 후 6-8주 후에 작은 동물 세트에서 자생을 분석합니다. 이식 된 상피가 존재하지만 저개발인 경우 시간의 길이를 증가시킵니다. 접목이 잘 발달되었지만 상피의 기능이 겹치는 경우 분석을 방해하므로 상피 발생에 대한 주 수를 줄이는 것이 좋습니다. 시간의 양을 단축 할 수없는 경우 (예를 들어, 발암 실험에서), 결과는 개인에서 해석 될 수 없기 때문에, 두 이식 부위 (내측 혈관의 각 측면에...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 홀링스 암 센터의 암 센터 지원 교부금 P30 CA138313 국립 보건원(https://www.nih.gov/)의파일럿 연구 자금과 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 병리학 및 실험실 의학부의 기금에 의해 지원되었습니다. 인터뷰 진술서를 녹음해 주신 마리진 스미스에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; M 주사기 필터Fisher Scientific09-715G멸균 필터링 콜라겐 분해 효소 소화 매체
1.5 - 2.0 mL 마이크로 원심 분리 튜브 (멸균)Fisher Scientific05-408-129함유 재현 유 세포 및 / 또는 뇌 균질 화합물
100 µ M 세포 스트레이너Corning431752필터링 뇌 균질화
25게이지 바늘이 있는 100uL 기밀 주사기Hamilton81001 & 90525이식 동물에 이식편 혼합물 주입용(공여자 유전자형/조건당 1개)
1000uL 피펫 팁 + 피펫-세포/혼합물/조직 전달
15mL 폴리프로필렌 튜브Falcon (Corning)352196뇌 균질화 혼합물 저장 또는 세포 : 이식을위한 균질화 혼합물
40 µ M 세포 스트레이너Corning431750세포 펠렛 세척 후 오가노이드
필터링 50mL 폴리프로필렌 튜브Fisher Scientific05-539-6기증자 유선 조직의 콜라겐분해
분해 60mm 접시Thermo Scientific조직 다진 조직을 위한130181
명반 황산칼Sigma-Aldrich243361/237086염색 유선, 전체 마운트 슬라이드
수의학용 마취 기화기--기관 프로토콜 준수
베타 다인 또는 요오드--
균질화를 위한 붕규산 유리 배양 튜브Fisher Scientific14-961-26균질화기에 적합한 튜브 사용)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022염색 유선 전체 마운트 슬라이드
세포 계수 장치-
회복을위한 깨끗한 동물 케이지-기관 프로토콜 Collagenase
Type 3Worthington Biochemical Corp.LS004183 기증자 쥐의 다진 유선 조직의 효소 분해
탈 이온수화학 용액
DMEM / F12GIBCO11320033조직, 콜라겐 분해 효소 소화 매체 및 상피 세포 혼합물 재현 탁
EDTA-단분산 혼합물
에탄올, 200 ProofDecon Labs2705/2701유방 전체 마운트 슬라이드 고정제, 유방 전체 마운트 슬라이드 세척, 외과 절개 부위 청소(희석)
태아 소 혈청(FBS)하이클론불활성화 용액
거즈--
빙하 아세트산Fisher ScientificA38-212유방 전체 마운트 슬라이드 고정제(100% 에탄올의 1:4 빙초산)
HBSSGIBCO-단분산 혼합물
가열 패드--기관 프로토콜
얼음 양동이 (x2)를-
궤도 회전이 있는 인큐베이터--37°C를 유지할 수 있어야 합니다; C, 220-225 RPM에서 흔들기 (유방 조직의 콜라겐 분해 효소 용)
이소 플루란 마취-기관 프로토콜
준수 광학 현미경 또는 디지털 카메라-전체 장착 유방 상피 시각화 및 / 또는 이미지 획득
기계 균질화 기Fisher Scientific-조직Miser 또는 대체 모델
미네랄 오일, 순수Sigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5장기 보관 전체 마운트
마취 기화기용 산소 탱크--기관 프로토콜 준수
종이 타월 또는 섬세한 작업용 물티슈--
양전하 현미경 슬라이드Thermo ScientificP4981-001전체 마운트
수술 후 진통제--기관 프로토콜
동물의 체중 측정
면도기--전기 이발기 또는 기타
염색 용기--화학 세척당 최소 1개, 슬라이드 수에 적합한 크기, 유리 선호
멸균 필드 드레이프IMCO4410-IMC이식 중 사용
멸균 가위 및 겸자 x3 (오토 클레이브)-기증자 및 수혜자에 사용되는 오토 클레이브 수술 도구
주사기 : 5mL (또는 그 이상)-콜라겐 분해 매체의 멸균 여과
용 트립신Worthington단분산 혼합물
액체 용 폐기물 수집 용기 (붓기 또는 흡인)- -
상처 클립 어플리어, 클립 및 제거 도구Fine Science Tools12020-00견갑간 흰색 패드 패드 위에 피부 절개 닫기
자일렌Fisher ScientificX3S-4클리어링 유방 전체 마운트 슬라이드 염색 후
-효소 륨 뇌 균질화를 위한 (를 따릅니다. - 유를 위한 따르십시오- 세척된 유선의 유선조직 , 진통제의 적절한 투여

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