본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.
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이 논문에서
요약
초록
1970년대 초, 연구자들은 유방 상피 세포를 쥐의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 성공적으로 이식했습니다. 이식 기술을 사용하여 유방 상피를 이식하는 것은 사춘기 설치류 호스트가 제공하는 호르몬 환경을 이용합니다. 이 연구 결과는 이상적으로 유선 발달에 각종 생물학 조작의 충격을 탐구하고 유선 생물학의 많은 양상을 해부하기 위하여 적당합니다. 일반적인, 그러나 제한, 특징은 이식된 상피 세포가 강하게 주변 기질에 의해 영향을 받고 내인성 상피에 의해 경쟁된다는 것입니다; 네이티브 유방 조직을 이용하기 위하여는, 복부 inguinal 백색 지방 패드는 이식의 앞에 호스트 유방 상피를 제거하기 위하여 삭제되어야 합니다. 쥐 모형 유기체를 사용할 때 중요한 장애물은 포스트 위들링 한 쥐에서 개발 유방 나무를 지우는 것이 효율적이지 않다는 것입니다. 선 없는 지방 패드로 이식 하는 경우, 기증자 상피 세포 는 삭제 된 호스트 지방 패드를 다시 채우고 기능성 유선을 형성 할 수 있습니다. 중간 지방 패드는 이러한 접목에 대 한 대체 위치. 주요 장점은 그것은 덕트 구조부족 아직 상피 성장을 촉진하는 데 필요한 정상 기질을 제공하고 쥐에서 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 또 다른 주요 장점은 최소 침습적이라는 것입니다. 추가적으로, 중간 지방 패드는 접목을 위한 사이트를 분리하기 위하여 이용될 수 있는 내측 혈관을 포함합니다. 내 인 성 동맥 그대로 남아 있기 때문에, 이 기술은 또한 이식 된 동맥에 내 인 성 유선 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 이 논문은 쥐의 간경엽 백색 지방 패드로 유방 상피 세포 이식의 방법을 설명합니다.
서론
출생 후 유방 선 발달 및 덕트 형태 형성은 사춘기의 개시에 호르몬 신호에 의해 크게 영향을 받은 프로세스입니다. 쥐와 쥐에서, 유선 생물학의 일반적으로 사용되는 모형 유기체에서는, 이 프로세스는 성숙한 자렌치종의 대형귀착되는 급속한 증식 및 분화 귀착되는 나이의 약 3 주에서 시작됩니다. 성숙한 유방 동맥은 확장과 불굴의 수많은 라운드를 겪을 수 있습니다, 초기 20세기 부터 조사를받고있다 속성. 과확산과 암 발달의 맥락에서, 유선 이식 기술은 1950년대1에개발되었고, 1977년2,3,4. 설치류에서 이식 기술의 정제는 여전히 널리 정상적인 유선 개발 및 질병 상태에 대한 다양한 치료 및 유전 조작의 효과를 연구하는 데 사용되는 정상적인 유선 생물학을 이해하는 주요 발전에 기여하고있다.
많은 가설이 생성되고 이후에 유선 이식을 사용하여 시험되었습니다, DeOme 외에 의해 처음 기술된 19591. 수십 년에 걸친 실험은 전체 지방 패드5,....
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프로토콜
모든 동물은 AAALAC 승인 시설에 보관및 유지되었으며, 이 프로토콜에 설명된 실험은 MUSC 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 상호 이식에 사용하기 위한 동물은 근친 또는 등인성 균주여야 하며, 선천상태는 적어도 6세대 동안 선호되거나 역교차되어야 한다.
1. 수확 기증자 쥐 유방 선 상피
- 이식에 필요한 기증자 쥐의 수를 결정합니다.
참고: 일반적으로, 1 명의 기증자 쥐 (4 주) 4 받는 사람 동물에 이식에 대 한 충분 한 세포를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특정 응용 프로그램에는 추가 수의 셀이 필요하며 총 수율에 변형별 차이가 있을 수 있습니다. - 모든 소모품에 라벨을 부착하고 외과 의사의 접근 가능한 배치를 확인합니다(표1).
- 각 여성 기증자 쥐의 체중을 기록합니다. 기증자 쥐를 완전히 마취하거나 안락사시키기 위해 제도적 지침을 따르십시오. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 동물을 멸균 수술장으로 옮김시. 동물을 등에 놓고 70% 에탄올로 복부 표면 전체를 살포합니다.
- 흉부, 복부 및 심구 유방 땀샘에 접근 할 수 있도록 시상, X 자형 절....
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결과
기증자 및 수령인 유방 땀샘
이식용 쥐 유방 상피 세포를 분리하고 준비하는 단계는 도 1A에나타내고 있다. 나이 4 주에, 기증자 쥐의 내인성 유방 동맥은 성숙을 시작하고 상피는 명반 카민으로 얼룩진 전체 장착 된 슬라이드에 시각화 될 수있다(그림 1B). 이 나이에 1명의 기증자 쥐는 이식을 위한 대략 1 x 106 세포를 제공할 것입니다. 수집된 공여자 조직의 양이 부족하거나 후속 다듬기의 양이 불충분하면, 콜라게나아제 소화 후 세포의 수율이 낮을 수 있다. 따라서 기증자로부터 가능한 한 많은 유선 조직을 수집하는 것이 중요합니다. 완전히 소화 된 유방 선 조직은 현탁액에 눈에 보이는 조직의 조각.......
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토론
이 프로토콜은 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화 된 유방 상피 세포 이식 기술을 설명합니다. 기증자 쥐에서 격리 된 유방 상피 오르가노이드 (나이의 3-5 주)는 수용자 쥐의 중간 흰색 지방 패드로 접목됩니다 (또한 3-5 주). 결과는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 이식된 조직을 검사하기 위하여 4-6 주 후에 조금으로 해석될 수 있습니다; 그러나, 이식과 희생 사이의 최적의 시간은 전체 실험을 구현하기 전에 결정되어야한다. 너무 적거나 너무 많은 시간이 경과한 경우 결과는 해석할 수 없거나 의미가 없습니다. 프로토콜을 최적화하기 위해 이식 후 6-8주 후에 작은 동물 세트에서 자생을 분석합니다. 이식 된 상피가 존재하지만 저개발인 경우 시간의 길이를 증가시킵니다. 접목이 잘 발달되었지만 상피의 기능이 겹치는 경우 분석을 방해하므로 상피 발생에 대한 주 수를 줄이는 것이 좋습니다. 시간의 양을 단축 할 수없는 경우 (예를 들어, 발암 실험에서), 결과는 개인에서 해석 될 수 없기 때문에, 두 이식 부위 (내측 혈관의 각 측면에.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 홀링스 암 센터의 암 센터 지원 교부금 P30 CA138313 국립 보건원(https://www.nih.gov/)의파일럿 연구 자금과 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 병리학 및 실험실 의학부의 기금에 의해 지원되었습니다. 인터뷰 진술서를 녹음해 주신 마리진 스미스에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; M 주사기 필터 | Fisher Scientific | 09-715G | 멸균 필터링 콜라겐 분해 효소 소화 매체 |
| 1.5 - 2.0 mL 마이크로 원심 분리 튜브 (멸균) | Fisher Scientific | 05-408-129 | 함유 재현 유 세포 및 / 또는 뇌 균질 화합물 |
| 100 µ M 세포 스트레이너 | Corning | 431752 | 필터링 뇌 균질화 |
| 25게이지 바늘이 있는 100uL 기밀 주사기 | Hamilton | 81001 & 90525 | 이식 동물에 이식편 혼합물 주입용(공여자 유전자형/조건당 1개) |
| 1000uL 피펫 팁 + 피펫 | - | 세포/혼합물/조직 전달 | |
| 15mL 폴리프로필렌 튜브 | Falcon (Corning) | 352196 | 뇌 균질화 혼합물 저장 또는 세포 : 이식을위한 균질화 혼합물 |
| 40 µ M 세포 스트레이너 | Corning | 431750 | 세포 펠렛 세척 후 오가노이드 |
| 필터링 50mL 폴리프로필렌 튜브 | Fisher Scientific | 05-539-6 | 기증자 유선 조직의 콜라겐분해 |
| 분해 60mm 접시 | Thermo Scientific | 조직 다진 조직을 위한 | 130181 |
| 명반 황산칼 | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | 염색 유선, 전체 마운트 슬라이드 |
| 수의학용 마취 기화기 | - | - | 기관 프로토콜 준수 |
| 베타 다인 또는 요오드 | - | - | |
| 균질화를 위한 붕규산 유리 배양 튜브 | Fisher Scientific | 14-961-26 | 균질화기에 적합한 튜브 사용) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | 염색 유선 전체 마운트 슬라이드 |
| 세포 계수 장치 | - | ||
| 회복을위한 깨끗한 동물 케이지 | - | 기관 프로토콜 Collagenase | |
| Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 기증자 쥐의 다진 유선 조직의 효소 분해 | |
| 탈 이온수 | 화학 용액 | ||
| DMEM / F12 | GIBCO | 11320033 | 조직, 콜라겐 분해 효소 소화 매체 및 상피 세포 혼합물 재현 탁 |
| EDTA | - | 단분산 혼합물 | |
| 에탄올, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | 유방 전체 마운트 슬라이드 고정제, 유방 전체 마운트 슬라이드 세척, 외과 절개 부위 청소(희석) |
| 태아 소 혈청(FBS) | 하이클론 | 불활성화 용액 | |
| 거즈 | - | - | |
| 빙하 아세트산 | Fisher Scientific | A38-212 | 유방 전체 마운트 슬라이드 고정제(100% 에탄올의 1:4 빙초산) |
| HBSS | GIBCO | - | 단분산 혼합물 |
| 가열 패드 | - | - | 기관 프로토콜 |
| 얼음 양동이 (x2) | 를 | - | |
| 궤도 회전이 있는 인큐베이터 | - | - | 37°C를 유지할 수 있어야 합니다; C, 220-225 RPM에서 흔들기 (유방 조직의 콜라겐 분해 효소 용) |
| 이소 플루란 마취 | - | 기관 프로토콜 | |
| 준수 광학 현미경 또는 디지털 카메라 | - | 전체 장착 유방 상피 시각화 및 / 또는 이미지 획득 | |
| 기계 균질화 기 | Fisher Scientific | - | 조직Miser 또는 대체 모델 |
| 미네랄 오일, 순수 | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | 장기 보관 전체 마운트 |
| 마취 기화기용 산소 탱크 | - | - | 기관 프로토콜 준수 |
| 종이 타월 또는 섬세한 작업용 물티슈 | - | - | |
| 양전하 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | P4981-001 | 전체 마운트 |
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| 멸균 필드 드레이프 | IMCO | 4410-IMC | 이식 중 사용 |
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| 주사기 : 5mL (또는 그 이상) | - | 콜라겐 분해 매체의 멸균 여과 | |
| 용 트립신 | Worthington | 단분산 혼합물 | |
| 액체 용 폐기물 수집 용기 (붓기 또는 흡인) | - | - | |
| 상처 클립 어플리어, 클립 및 제거 도구 | Fine Science Tools | 12020-00 | 견갑간 흰색 패드 패드 위에 피부 절개 닫기 |
| 자일렌 | Fisher Scientific | X3S-4 | 클리어링 유방 전체 마운트 슬라이드 염색 후 |
참고문헌
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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