방법 논문

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

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DOI:

10.3791/60415

2019년 10월 13일

이 논문에서

요약

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

초록

세포는 화학 자극에 반응하여 이동 패턴을 변경, 자극의 그라데이션을 포함. 화학 구배의 방향으로 세포 이동, 화학 요법으로 알려진, 개발에 중요 한 역, 면역 반응, 상처 치유, 그리고 암 전이. 화학요법은 생체 내에서 세포의 집합뿐만 아니라 단일 세포의 이동을 조절하는 동안, 시험관 내 연구는 단일 세포 화학 요법에 초점을 맞추고, 부분적으로 적절한 실험 도구의 부족으로 인해. 이러한 격차를 해소하기 위해 여기서 설명한 것은 미세 유체와 미세 패턴화를 결합하여 집단 세포 이동에 대한 화학 적 그라데이션의 효과를 입증하는 독특한 실험 시스템입니다. 또한 견인 현미경 검사법과 단층 스트레스 현미경 검사가 시스템에 통합되어 기판뿐만 아니라 주변 세포 간의 세포력 의 변화를 특성화합니다. 개념 증명으로서, Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포의 마이크로 패턴 원형 섬의 이동은 알려진 산란 인자 인자 (HGF)의 구배 하에서 테스트됩니다. HGF의 높은 농도 근처에 위치한 세포는 세포 섬 내의 반대쪽에 있는 세포보다 더 빨리 이동한다는 것을 발견했습니다. 같은 섬 내에서, 셀 룰 러 견인 은 양쪽에 유사, 하지만 세포 간 스트레스는 높은 HGF 농도의 측면에 훨씬 낮은. 이 새로운 실험 시스템은 세포 집단에 의한 화학 전술 이동의 역학을 연구하는 새로운 기회를 제공 할 수 있습니다.

서론

생물학적 시스템에서의 세포 이동은 조직 형성, 면역 반응 및 상처 치유1,2,3에관여하는 근본적인 현상이다. 세포 이동은 또한 암 같은 일부 질병에 중요 한 과정4. 셀은 종종 집단 세포 마이그레이션4,5로알려진 개별이 아닌 그룹으로 마이그레이션됩니다. 세포가 집합적으로 이동하려면 미세 환경의 감지가 필수적입니다6. 예를 들어, 세포는 물리화학적 자극을 인식하고 운동성, 세포-기질 상호 작용 및 세포-세포 상호 작용을 변경하여 반응하여 화학 적 구배를 따라 방향 이동을초래하는 7,8, 9,10. 이러한 연결을 바탕으로, 화학력 체11,12,

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프로토콜

참고: 스텐실(두께 = 250 μm) 및 마이크로채널 부품(두께 = 150μm), 유리 에칭(깊이 = 100 μm) 및 주조 제작을 위한 SU-8 금형의 리소그래피는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 제조업체에 설계를 전송하여 아웃소싱되었습니다.

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 스텐실 및 마이크로채널 제조

  1. 스텐실과 마이크로채널의 마이크로패턴을 디자인합니다.
  2. 실리콘 웨이퍼(직경 4")에서 SU-8 금형(스텐실의 경우 ~250μm, 마이크로채널의 경우 ~150μm)을 제작 또는 아웃소싱합니다.
  3. 염기 엘라스토머 및 경화제를 10:1의 비율로 혼합하여 PDMS 혼합물을 준비한다.
    1. 50 mL 원엽 튜브에 염기 엘라스토머 15 mL을 놓고 1.5 mL의 경화제를 추가합니다. 이 중 두 가지를 준비합니다.
    2. PDMS 혼합물을 5분 동안 소용돌이. 196 x g에서 PDMS 혼합물을 1분 동안 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거한다.
  4. PDMS 스텐실을 제조하기 위해, PDMS가 SU-8 기둥의 측면을 만지지만 SU-8 패턴의 상단이 아니라는 것을 않도록 SU-8 패턴 영역을 피하면서 웨이퍼에 PDMS 혼합물의 ....

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결과

화학 구배 하에서 집단 이동을 탐구하기 위해 미세 유체 시스템은 견인 현미경 검사법(그림 1)과통합되었습니다. 통합 시스템을 구축하기 위해, 폴리아크릴아미드(PA) 겔을 맞춤형 절단 유리상에 시공하고, MDCK 세포를 PDMS 스텐실로 만든 미세패턴 섬 내에서 시종하였다. 이 실험을 위해, MDCK 세포의 12개의 섬(3개의 열에 의하여 4개의 행, ~700 μm의 직경)이 생성되었다. PA 겔에 부착된 세포 후, PDMS 스텐실을 제거하여 집단 이동을 개시하였다. 미리 만들어진 미세유체 채널은 세포 섬 위에 미세 유체 채널을 구축하기 위해 PA 겔 의 상부에 배치되었다(도1A).

이어서 미세유체 채널 내에서 농도 구배를 확립하기 위해, 좌측 입구는 형광 염료 용액을 함유하는 공급 저장소에 연결되었다. 또한, 중간 및 우측 입구는 미디어만을 포.......

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토론

구성 세포의 집단 이동은 개발 및 재생 중에 중요한 과정이며, 이동 방향은 종종 성장 인자의 화학구배4,23에의해 유도된다. 집단 마이그레이션 중에 셀은 인접한 셀 및 기본 기판과 계속 상호 작용합니다. 이러한 기계적 상호 작용은듀로탁시스(42,plithotaxis33,및 kenotaxis43)와같은 새로운 현상을 야기한다. 그러나, 이 연구는 성장 인자의 단일 농도를 사용 하 여 수행 되었다, 태아 소 혈 청에 그 등. 간격을 채우기 위해 이 프로토콜은 화학 적 구배 하에서 집단 세포 이동 중에 기계적 상호 작용을 측정 할 수있는 새로운 실험 플랫폼을 설명합니다.

이 새로운 플랫폼은 마이크로패터닝, 견인력 현미경 및 미세 유체학적 의 세 가지 실험.......

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공개 사항

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 한국 정부(MSIP)의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원으로 지원되었다. NRF-2017R1E1A1A01075103), 고려대학교 보조금, BK 21 플러스 프로그램. 그것은 또한 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL00718, R01EY019696).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES 버퍼 용액Gibco15630-056
1 mm 생검 펀치Integra Miltex33-31AA-P/25
100 mm 페트리 접시SPL10100100 mm 직경, 15 mm 높이
14 mm 중공 펀치ILJIN124-0571
18 mm Ø 커버슬립Marienfeld-Superior111580원형 18mm, 두께 No. 1 (0.13 - 0.16 mm)
2% 비스-아크릴아미드 용액Bio-Rad1610142보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.
3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 (TMSPMA)시그마-알드리치440159-500ML
3-방향 스톱콕협성HS-T-61N주의: 이전에 개봉한 경우에는 사용하지 마십시오.
최소 볼륨 라인 30cm협성HS-MV-30주의: 이전에 개봉한 경우에는 사용하지 마십시오.
35mm 세포 배양 접시. Corning
430165 40% 아크릴아미드 용액Bio-Rad1610140보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.
최소 볼륨 라인 75cm(소아용)HS-MV-75주의: 이전에 개봉한 경우 사용하지 마십시오.
J.T. BakerJT9508-03
과황산암모늄(APS)Bio-Rad1610700
항생제-항진균제Gibco15240-062
바닥 유리 칩MicroFIT24 x 24 x 1mm, 맞춤형, 직사각형 홈(6 x 12mm, 깊이: 100 & m)
콜라겐 I형, 쥐꼬리코닝354236
맞춤형 유리 홀더한구그 메카트로닉스맞춤형
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres 아민 변성 마이크로스피어InvitrogenF87640.2 µ m, 황록색 형광등(505/515)
간세포 성장 인자(HGF)Sigma-AldrichH1404-5UG재조합, 인간
JuLI 스테이지 라이브 셀 이미징 시스템NanoEnTek InAutomated X-Y-Z 스테이지 및 형광 이미징 인큐베이터 호환(37 ° C 및 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포유형 II
산소 플라즈마 시스템Femto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate– dextranSigma-AldrichR9379-100MG70kDa, 미세유체 채널에서 HGF의 시공간 분포를 추정하는 데 사용
멸균 피하 주사 바늘 18GKOVAX바늘 끝을 자르고 90도 구부려 볼륨 라인으로 입/출력 포트 연결
접착 테이프3M/Scotch810D33m x 19mm
SU-8 마스터 몰드MicroFIT4인치 직경, 맞춤형
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589-20°C에 보관하십시오. 습기와 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
Sylgard 184 엘라스토머 키트다우 코닝PDMS
주사기 펌프Chemyx Inc.모델 Fusion 720회수
주사기 주사기KOVAX1, 3, 5, 10 또는 50cc 입구 저장소 또는 출구 주사기 펌프
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)Bio-Rad1610800보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.
자외선(UV) 램프UVP LLC95-0248-02365nm 파장
를 재사용하거나 재사용하지 마십시오(소아용)를 재사용하거나 재사용하지 마십시오성 아세트산을 재사용하거나 재사용하지 마십시오. 액

참고문헌

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology.

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태그

Madin Darby Canine KidneyPDMS

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