자동화는 셀 제조에서 업스케일링 및 비용 관리의 핵심입니다. 이 원고는 소규모 바이오 프로세싱을 위한 완충교환 및 세포 농도 단계를 자동화하기 위한 카운터플로우 원심 세포 처리 장치의 사용을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 및 세포 기반 치료법의 성공적인 상용화에는 비용 효율적이고 확장 가능한 제조 공정이 필요합니다. 버퍼 교환 및 제품 농도는 대부분의 제조 공정에 필수적인 구성 요소입니다. 그러나 제품 개발의 초기 단계에서이러한 단계는 종종 수동으로 수행됩니다. 버퍼 교환을 위한 수동 막다른 원심분리는 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 확장이 가능하지 않습니다. 폐쇄된 자동화 시스템은 이러한 까다로운 단계를 효과적으로 제거할 수 있지만 구현이 어려울 수 있습니다. 여기서는 중소 규모 셀 처리에 적합한 새로 개발된 셀 처리 장치를 설명하고 수동 처리와 대규모 자동화 사이의 격차를 해소하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 유속 및 원심분리 속도를 수정하여 다양한 세포 유형 및 프로세스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 수동 프로세스에 비해 짧은 처리 시간과 높은 세포 복구를 입증했다. 자동화된 공정으로부터 회수된 세포는 또한 그들의 증식속도를 유지했다. 이 장치는 완충물 교환, 세포 제형 및 냉동 보존과 같은 단계를 수용하기 위해 밀폐 된 제조 공정에서 모듈 식 구성 요소로 적용 할 수 있습니다.
서론
현대 의학의 풍경은 유전자와 세포 기반 치료 (GCT)의 최근 발전을 통해 빠르게 변화하고있다. 번역 연구에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나인 GCT 부문은 독특하고 전례 없는 도전에 직면하고 있습니다. 견고한 임상 결과 외에도 효율적이고 비용 효율적인 제조 공정은 소규모 제조1에서달성하기 어려운 GCT의 상업적 성공에 필수적입니다. 세포의 각 배치가 수백 또는 수천 대신 한 환자에 대한 몇 가지 복용량을 생산할 때 시간, 노동 및 품질 보증의 비용이 확대됩니다. 제조 과정이 항체 및 재조합 단백질의 생산에 더 가깝다는 동종 세포 치료와는 달리, 자가 세포 치료는 일반적으로 소규모 수술1로생산된다. 바이오 의약품 제조2에서비교적 새로운 현상으로, 소규모 전지 처리에 대한 옵션은 현재 매우 제한적입니다.
버퍼 교환은 셀 제조에 필수적입니다. 그것은 세포가 배양 배지에서 제거되고 동결 보존 또는 주입을 위해 집중되는 다운스트림 프로세스 의 한개입니다. 현재 소규모 세포 제조는 학술 연구 환경에서와 유사한 프로세스를 적용하는 경우가 많으며 불임 유지를 위해 전문 클린 룸에의존합니다 3....
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프로토콜
1. 버퍼 교환을위한 시약 및 셀 의 준비
- 클래스 2 층류 흐름 후드에서 버퍼 준비(재료 표참조). 주사기와 바늘 조립체를 사용하여 500 mL 식염수 백에서 식염수 50mL를 제거합니다. 이를 50 mL의 20% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 대체하여 식염수로 2% HSA를 만들어 세척 완충제 역할을 합니다.
- 배양 혈관으로부터 세포를 제거하고 세포 수를 수행하여 트라이판 블루 배제에 의한 시작 세포 수량 및 생존 가능성을 결정한다. 셀을 전사 백에 로드합니다.
참고: 이 프로토콜에서 Jurkat 세포는 RPMI에서 배양되었고, MC는 DMEM:F12에서 배양되었다. 두 매체 모두 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 항생제 항균제를 보충하였다. 세포는 37°C에서 5%CO2로배양하였다. 중간 나무 또는 부착 세포의 경우, 세포를 분리하기 위해 배양 용기에 소화 효소 (예를 들어, 트립신)를 추가하고 세포가 분리되면 배양 배지로 담금질하십시오. 세포가 배양 혈관에서 확장되었기 때문에 전사 백이 이 프로토콜에서 사용되었다. 그러나, 세포가 세포 배양 백에서 배양되는 경우, 멸균 튜브 용접을 통해 일회용 키트에 직접 연결될 수 있다. 이 프로토콜에서, 3 x 107 Jurkat 세포 또....
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결과
이 프로토콜에서는 Jurkat 셀과 MSC를 대표적인 예로 사용하여 자동화된 버퍼 교환 프로세스를 시연했습니다. 이 과정에서 Jurkat 셀과 MCS는 유속을 제어하는 원심력과 펌프 속도의 차이로 동일한 처리 단계를 공유했습니다(표1). 도 2는 완충교환 과정에서 유동화된 셀 베드가 어떻게 나타날 수 있는지에 대해 카메라에 의해 포착된 대표적인 이미지를 나타낸다. 일반적으로 유동화 된 세포 베드는 세포가챔버 의 끝에 작은 공간으로 원뿔의 중간과 앞쪽으로 축적되는 그림 2A의이미지와 유사하며 세포가 축적되지 않고 셀 로딩 입구의 개구부가 표시됩니다. 유동화된 셀 베드는 상이한 점도 또는 밀도에 있는 새로운 완충액을 도입할 때 압축될 수있다(도 2B). 이 프로토콜에서는 세척 단계를 .......
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토론
설명된 자동화된 버퍼 교환 프로토콜은 간단하고 사용자 친화적입니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에는 중요하고 특별한 주의가 필요한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 우리의 경험에서, MCS와 같은 더 큰 세포를 가공할 때 (평균 직경 10-15 μm) 각 실행은 최적 세포 회수를 달성하기 위하여 적어도 1 x 107 셀을 포함해야 합니다(그림 4B). Jurkat 세포 (평균 ~ 10 μm 직경)와 같은 작은 세포를 처리하는 것은 안정적인 유동 세포 베드를 달성하기 위해 약 3 x 107 셀이 필요합니다(그림 4B). 세포 수가 너무 낮으면, 세포는 최종 세포 회복에 영향을 미칠 유동침대에서 제거될 확률이 높습니다. 또한 일정한 원심 속도를 적용할 때 다양한 펌프 속도로 셀 손실률을 비교했습니다. 여기서, 유량(도
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공개 사항
SW, IF, DJ는 COO, CTO, 그리고 Scinogy Pty. Ltd.의 CEO입니다. CFC 장치에 대한 액세스도 Scinogy에 의해 제공되었습니다.
감사의 글
이 작업은 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램과 경제 개발, 일자리, 운송 및 자원부에서 제공하는 빅토리아 정부 기술 바우처에 의해 지원됩니다. RL은 국가 보건 및 의학 연구 위원회 경력 개발 펠로우십의 수혜자입니다. AL은 호주 대학원 상을 받는 사람입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20ml 루어 잠금 주사기 | BD | 302830 | |
| 20% 인간 혈청 알부민(HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(디메틸아미노)벤즈알데히드 | 시그마-알드리치 | 156477-25g | |
| 500ml IV 식염수 백 | Fresenius Kabi | K690521 | |
| 항생제-항진균제 | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| 자동 세포 계수기 (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| 세포 자극 칵테일 (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| 세포 전달 백 | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision 플레이트 리더 | Perkin Elmer | N/A | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| 루어(암) 피팅 | CPC | LF41 | |
| PC 노트북 또는 PC 태블릿 장치 | ASUS | N/A | |
| 플레이트 리더(SpectraMax i3) | 분자 장치 | N/A | |
| 재조합 인간 IFN-&감마; | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea 역류 원심분리기 세포 처리 장치 | Scinogy | N/A | |
| Rotea 일회용 처리 키트 | Scinogy | N/A | |
| RPMI 매체 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| 수술용 가위 | ProSciTech | 420SS | |
| 트리클로로아세트산 | 시그마-알드리치 | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 트립신 분해 효소(TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
참고문헌
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Sp....
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재인쇄 및 허가
