정보 부호화 된 펩토이드 올리고머의 합성과 동적 공유 반응체 쌍 및 루이스 산성 희토류로 아민과 알데히드를 사용하여 분자 사다리로 이러한 펩토이드의 시퀀스 지시자가 조립하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 다중 역할 시약으로 금속 triflates.
이 프로토콜은 상호 보완적인 핵산 서열의 자가 조립을 위해 일반적으로 사용되는 열 사이클링을 모방하는 방식으로 쌍으로 결합된 동적 공유 상호 작용에 의해 매개된 정보 인코딩된 올리고머릭 가닥의 자가 조립 중에 관찰된 운동 트래핑을 우회하기 위해 Lewis acidic 다역할 시약을 사용하는 것을 제시합니다. 알데히드와 아민 펜던트 모이티를 베어링하는 1차 아민 단량체는 동적 공유 반응제 쌍으로 사용하기 위해 직교 보호 그룹과 함께 기능화됩니다. 변형된 자동화된 펩타이드 신디사이저를 사용하여, 1차 아민 단량체는 고체 상 서브모노머 합성을 통해 올리고(peptoid) 가닥으로 인코딩된다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정제와 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의한 특성화시, 서열 특이적 올리고머는 알데히드 모에이티를 탈피하고 완전히 드란에 있는 반응물 쌍 평형에 영향을 미치는 루이스 산성 희토류 금속 트리플랫의 고부하를 받게 된다. 그 후, 루이스 산의 일부가 추출되어 상보적 서열 특이적 가닥의 어닐링이 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(MALDI-MS)을 특징으로 하는 정보 부호 분자 사다리를 형성할 수 있게 합니다. 이 보고서에 설명된 간단한 절차는 동적 공유 어셈블리 분야에서 일반적으로 경험되는 운동 트랩을 우회하며 견고하고 복잡한 아키텍처의 미래 설계를 위한 플랫폼 역할을 합니다.
소규모 서브유닛이 열역학적 구동 경로를 통해 더 큰 아키텍처를 생성하는 자체 조립 공정은 π-스태킹 및 수소결합1,2,3,4와같은 분자 간 상호 작용을 일반적으로 활용하여 일반적으로 거시 및 초분자 나노 구조에 대한 향상된 제어를 제공했습니다. 특히, 핵산(즉, 폴리뉴클레오티드)은 왓슨크릭 염기 페어링에 의해 제공되는 높은 정보 밀도로서 놀랍도록 다재다능한 나노 시공 매체로 등장하여 복잡하고 서열 선택적구조4,5의조립을 허용한다. 이러한 과도 분자 간 결합의 본질적으로 낮은 강도는 하위 단위 재배열 및 오류 보정을 가능하게하는 반면, 결과 구조는 종종 열 및 기계적열화에 취약합니다 6. 대조적으로, 동적 공유 상호 작용7,8,9,온화한 조건하에서 가역적이거나 재배열 할 수있는 공유 결합 형성 반응의 클래스는 최근 사다리10,11, 12,13,케이지14,15,16및 스택17과같은 복잡한 거대 분자를 산출하기 위해 채택되었습니다. 결합 강도와 견고한 구조를 증가시켰습니다. 불행하게도, 이러한 공유 종의 비교적 낮은 재배열 비율에 의해 재배열 및 오류 확인을 위한 용량이 감소되고, 원하는 제품으로 자체 조립을 위한 그들의 용량을 감소시켰다18. 이러한 운동 트랩핑을 해결하기 위해 촉매 또는 가혹한 반응 조건은 종종 간단한 빌딩 블록과 함께 활용됩니다. 여기서, 우리는 올리고머 잔류 서열에 인코딩된 정보에 의해 혼성화가 지시되는 서열 특이적 올리고머로부터 분자 사다리의 자가 조립을 가능하게 하기 위해 운동 트래핑을 우회하는 과정을 보고한다.
이들의 합성 접근성을 감안할 때, 폴리(N-치환 글리신)s(즉, 펩토이드)는 분자 사다리가 조립되는 올리고머 전구체로서19가지로사용된다. 펩토이드는 펩타이드의 구조적 이소메로, 펜던트 그룹은 α-탄소20과결합되는 대신 백본 매개 질소에 부착된다. 고체 상 합성을 사용하여 펩토이드 사슬을 따라 동적 공유 펜던트 그룹의 정확한 배치가 용이하게 달성되어 복잡한 상분자 구조(21)로조립 할 수있는 전구체 올리고머의 설계가 가능합니다.
imine 연결성의 동적 공유 배열은 imine 발생 응축 반응이 각 결합형성으로 질량 분석법에 의해 자가 조립을 특성화하는 편리한 수단을 제공함에 따라 이 절차에서 사용되어 18 g/mol22의질량 감소를 초래한다. 더욱이, 아민과 알데히드 반응물 및 이민 생성물 사이의 평형은 산 농도를 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 구체적으로, 희토류 금속 트리플랫은 평형에 영향을 미치고, 에틸렌 아세탈 보호 알데히드23,24,25를추가로 탈보호하는 데 사용된다. 참고로, 스산듐 트리플랫은 이미 상온26,27에서공유 유기 프레임워크(COF)의 합성을 돕는 최근의 성공을 포함하여 동적 공유 자성 조립 분야에서 일반적으로 사용되고 있다. 또한, 올리고 (펩토이드) 서열과 희토류 금속 triflate의 대조 용해도는 액체 – 액체 추출을 통해 평형 제어를 가능하게한다. 보고된 프로세스는 이 제어를 사용하여 정보 지향자가 조립하는 것을 방지하는 운동 장벽을 우회합니다.
본 명세서의 기술은 정보가 펜던트 그룹의 순서대로 인코딩되는 정보 베어링 펩토이드 올리고머의 동적 공유 어셈블리를 설명합니다. 에틸렌 아탈 보호 알데히드 단량체와 함께 Alloc 보호 아민 단량체를 사용하면 직교 차단이 가능하여 자체 조립 반응 중에 비드 및 아세트탈 보호에 대한 Alloc 보호 가 가능하므로 합성 된 서열이 올리고머 화 및 특성화 이전에 조기에 반응하지 않도록합니다. 중요한 것은, 고체 상 합성은 UV 또는 보라색 광 조사 하에 비드로부터 올리고머 절단을 가능하게 하기 위해 광라빌 수지(photolabile resin)를 사용하여 수행되며, 산-비질, 에틸렌 아세탈 계 보호 군의 조기 보호를 배제한다. 몇 가지 대체 보호 해제 체계가 고려될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 처음에 이중 산-비질 보호 기(Boc-amine 및 에틸렌 아세탈-알데히드)를 강한 산에 의한 초기 탈방의 의도로 채택하고 중화하여 자가 조립 반응이 진행될 수 있도록 하였다; 그러나, 이 접근법은 염기의 첨가시 침전물의 즉각적인 생성을 초래했다. 대안적으로, 광나래빌 보호기인 2-(2-니트로페닐)의 프로실카보닐(NPPOC)을 가진 아민의 보호는, 알데히드가 정제 전에 삼불화산(TFA)으로 처리될 때 선택적으로 탈보호될 수 있는 것으로 구상되었다. 불행하게도, UV 광을 가진 보호 기의 상태 광용해에서도 광감작제의 존재 및 연장 된 조사 기간25후 양적 보호를 감당하지 못했다. 트리메틸릴레톡카보닐(즉, Teoc)은 아민 보호그룹으로 사용될 수 있으며 희토류 금속 트리플랫으로 처리시 분열을 당할 수 있습니다. 그러나 정량적 Teoc 보호는 에틸렌 아세탈 보호에 필요한 것보다 훨씬 더 높은 희토류 금속 트리플랫 하중을 필요로 합니다. 이 프로토콜의 경우, Teoc-amines가 사용될 수 있지만, 루이스 산 농도는 서브 정량적 아민 보호가 더 큰 자가 조립 구조에 문제가 될 수 있기 때문에 그에 따라 조정되어야 합니다. 알리파틱 작용기는 간략하게 고려되었으나, 알데히드의 보호를 해제하려면 펩티드 서열을 트렁킨 가혹한 조건이요구된다(32,33).
Neee와 Nma를 불활성 스페이서 잔류물로 통합하면 올리고머 용해도를 개선하고 전구체 올리고머의 실용성 대량 태깅을 가능하게하여 대량 분광법에 의해 생성 된 종의 준비 식별을 감당할 수 있습니다. 더욱이, 인접 한 백본 세그먼트선형, 트위스트 없는 올리고머34,35를형성 하기 위해 반대 회전 상태를 채택 하는 펩 토이드의 ‘Σ-strand’ 형태를 감안할 때, 교대 동적 공유 및 불활성 스페이서 잔기를 통합 하는 시퀀스는 반응성 펜던트 그룹 동일한 방향으로 지향 하는 구조를 용이 하 게. 서브모노머 방법의 다양성, 1 차 아민의 크고 다양한 라이브러리는 펩토이드 올리고머를 추가로 수정하기 위해 사용될 수 있지만 높은 결합 효율을 유지하기 위해 프로토콜에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
올리고(peptoids)는 유리 반응용기(19)에서수동으로 합성될 수 있는 반면, 공정의 자동화는 매 잔류물 첨가에 대한 시간을 몇 시간에서 반 시간으로 감소시다. 또한 자동화는 단량체 및 세척 용매 폐기물의 양을 감소시며, 특히 시판되지 않는 1차 아민 단량체를 사용할 때 바람직합니다. 보호 된 아민 잔류물에서 Alloc 분열은 효율적인 반응이지만 팔라듐 산화는 불완전한 보호 를 초래할 수 있습니다. 따라서, 수지의 일부를 갈라테스트하고 ESI-MS로 탈방 정도를 특성화하는 것이 좋습니다. 시험 분열을 위해, 405 nm 조사에서 30 분 질량 분광법을 위한 충분한 펩토이드를 풀어 놓습니다. 부분 제보호는 혐기성 조건의 사용 또는 탈보호 반응을 반복하는 것으로 제한될 수 있다.
이 기사에서는 Sc (OTf)3을 다역할 시약으로 중점하는 반면, 이터비움 트라이플랫과 같은 다른 희토류 금속 트리플랫은 분자 사다리의 정보 지향 조립을 성공적으로 중재하는 것으로 나타났습니다. 특히, Sc(OTf)3은 희토류 금속 트리플랫중 가장 많은 루이스 산성이다. 따라서, 다른 희토류 금속트리플랫(24,36)에의해 제공되는 감소된 촉매 능력으로 인해, 완전한 에틸렌 아세탈 보호 및 가닥 해리효과를 위해 더 큰 등가물들이 요구될 수 있다. 필요한 등가물의 수는 가닥이 완전히 해리되는 지점을 관찰하여 MALDI 질량 분석법으로 결정할 수 있습니다. 해리는 자체 조립 공정에서 중요하며 상승된 온도에서 핵산 가닥의 용융과 유사합니다. 촉매의 후속 추출은 서열 특정 듀플렉스의 조립을 추진하는 동적 공유 페어링의 형성 및 중단을 가능하게합니다. 올리고머 가닥의 이 점진적인 어닐링은 다른 방법에 의해 경험된 운동 트랩(분자 사다리의 경우 레지스트리 밖의 종을 산출하거나 순서를 잘못 쌍으로 만들 수 있음)을 우회합니다.
클로로포름은 여기에 사용되는 클로로포름/아세토니트릴/물 삼차 시스템에서 상 분리로서 우수한 용매로서 자체 조립구조물(37)의침전을 초래하지 않고 루이스 산의 부분추출을 촉진한다. 또한, 클로로포름은 분자 사다리 용해도를 유지하면서 이민 형성을 촉진하는 몇 안되는 용매 중 하나입니다. 시스템의 동적 특성으로 인해 레지스트리 를 벗어난 양과 잘못 페어링된 이중 면류의 미량은 종종 관찰될 수 있습니다. 이 시스템은 추출 시 희토류 금속 트리플랫 농도의 작은 변화에 크게 영향을 받지 않지만, 때때로 불충분한 촉매 추출은 불완전한 혼성화 및 비특이적 올리고머 커플링의 상당 부분을 생성합니다. 이 경우, 단일 가닥의 완전한 해리가 공정에 필수적이기 때문에 일반적으로 촉매의 1.5 등가물로 먼저 다시 해리한 다음 즉시 다시 추출하는 것보다 두 번째 추출하는 것이 바람직합니다. 여러 가지 독특한 정보 부호인 분자 사다리를 동시에 조립하려면 등가물 및 총 반응 량을 유지하는 데 사용되는 희토류 금속 트리플랫 스톡 솔루션의 농도를 증가시켜야 할 수 있습니다.
이러한 자체 어셈블리는 주로 질량 분석법을 특징으로 하지만 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 비롯한 다른 기술이 가능합니다. 제한 사항에는 필요한 재료의 양, 단량체의 경제성 및 신호 대 잡음 비율이 포함됩니다. 1H NMR과 같은 용매가 필요한 기술은 자체 조립 된 구조의 불용성으로 인해 추가로 고통을 겪을 수 있습니다. 또한, 희토류 금속 삼중팽창 농도 는 ICP-MS 또는 내부 표준이 있는 19FNMR과 같은 방법을 통해 결정할 수 있다.
매크로 및 수화 나노 구조 및 재료에 대한 향상된 제어를 향한 진전이 진행됨에 따라 정기적이지만 수정 가능한 어셈블리를 설계하고 제작해야 하는 과제가 발생합니다. 이 보고서에 설명된 프로토콜은 동적 공유 상호 작용을 통해 서열 선택적 어셈블리를 통해 이러한 나노 구조를 달성하는 경로를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 미국 에너지부, 과학부, 기초 에너지 과학부의 지원을 #DESC0012479. S.C.L.은 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 인정하며, A.F.A.는 아부다비 국영 석유 회사(ADNOC)의 지원을 인정합니다.
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |