마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

방광암은 가장 널리 퍼진 요로 암이며,^매년165,000명의 환자가 사망합니다. 방광암의 다양한 모형 중, 근육 침습적인 비뇨기과 암은 공격적인 표현형을 나타내고, 그것의 5 년 생존율은 50%²보다는 더 낮습니다. 침습성 비뇨기과 종양에 대한 새로운 치료 옵션은 지난 수십 년 동안 확장되지 않았습니다^1.

암 세포주들은 약물^{스크리닝3에}광범위하게 사용되어 왔다. 비록 유리한 결과 암 세포 주에서 수많은 약물 후보에서 관찰 되었습니다., 나쁜 결과 임상 시험에서 보고^4. 체외 2차원(2D) 배양 환경에 대한 적응이 증가한 후, 세포주에서 네이티브 종양을 재량화하는 것이 점점 더 어려워지고 있다. 동물성 암 모델 또는 환자 유래 종양 이종이식은 방광암 세포주에서 관찰되는 한계를 해결하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 동물암 모델은 시간과 자원집약적입니다. 따라서, 개선된 질병 모델은 수년 동안 수요가 증가해 왔으며, 새로운 모델 시스템인 오르가노이드는 기존 모델의 단점을 극복하기 위해 개발되었다^5.

오르가노이드는 생체 외에서 해당 생체 내 기관의 생리학적 특성을 재현할 수 있는 다세포 3D 구조체입니다. 정상 및 종양 오르가노이드는 다능성 또는 성체 줄기 세포, 및 1차 종양 세포로부터 각각^5,6에서유래될 수 있다. 지난 몇 년 동안, 종양 오르가노이드는 결장^8,9,방광^10,췌장^{11,전립선13, 간 14,}유방¹⁵ 종양 조직을 포함하여 다양한 종양 조직^7의다수로부터 확립되었다. 이러한 종양 오르가노이드는 그들의 본래 종양을 현상형및 유전적으로 모방한다. 생체 내 종양 조직과 수많은 실용적인 응용 분야와의 유사성으로 인해 연구자들은 암 발병 기전 연구에서 새로운 질병 모델로 채택했습니다.

여기서, 발암물질 유도 뮤린 침윤성 우로테탈종양(16)으로부터 종양 오르가노이드의 확립을 위한 절차가 마련된다. N-부틸-N-(4-hydroxybutyl) 니트로사민(BBN)은^{마우스(17)에서} 침습성 비뇨기과 암을 유도하는 발암물질로 사용되며, 마우스 근육 침습성 방광 종양의 병리학적 특성을 나타내는 종양 오르가노이드는 BBN-유도^{음낭암(16)으로부터}확립된다. 종양 오르가노이드를 유전적으로 조작하는 방법은 렌티바이러스 매개 형질전환을 사용하여 방광암 의 발병의 분자 기반을 연구하기 위한 모델 시스템을 개발하는 방법을 예시한다. 또한, 방광암에서 네이티브 방광 환경의 역할을 조사하기 위해 오르가노이드를 방광으로 직교적으로 이식하는 방법이 기재되어 있다.

모든 절차는 포스텍의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 승인 및 수행되었습니다 (IACUC 번호 : POSTECH-2019-0055).

1. 방광 종양 오르가노이드의 시험관 내 문화

1. 뮤린 방광 종양에서 방광 종양 오르가노이드를 확립 (그림 1A.).
   참고: BBN 유도 마우스 방광 종양을 생성하는 절차는 신 외에서 설명된다.¹⁷.
   1. 6개월 동안 마우스 광고 리비텀에 어두운 병에 0.1% BBN 함유 물을 제공합니다. 일주일에 2회 BBN 함유 물을 변경합니다.
      참고: 8-10주에 약 25g의 체중을 가진 C57BL/6 남성 마우스를 사용했습니다. BBN 함유 물은 단일 케이지에서 최대 5마리의 마우스를 투여할 수 있다.
   2. 6 개월 후, 이산화탄소 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 전체 방광 종양을 분리하십시오. 90mm 페트리 접시에 옮김을 옮김을 드시면 됩니다.
   3. 멸균 수술 가위를 사용하여 비 암 부위와 괴사 부위를 제거하고 차가운 1x Dulbecco의 인산 완충 식염수 (DPBS)로 방광 종양 조각을 2-3 번 씻으하십시오. 조각을 수집하고 새로운 90mm 페트리 접시로 전송합니다.
   4. 10 mMM 4-(2-하이드록스예틸)-1-피페라진에탄에설포닉산(HEPES)으로 덜베코의 수정된 최소 필수 배지(DMEM) 1mL를 첨가합니다.
   5. 종양 조직을 멸균 된 면도날을 사용하여 가능한 한 작은 조각으로 (0.5-1 mm³⁾다진다.
   6. 10 mM HEPES, 250 μg/mL 콜라게나아제 타입 I, 250 μg/mL 콜라주나아제 타입 II, 250 U/mL 써릴리신이 있는 DMEM 9 mL을 추가합니다. 다진 종양 조직을 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서궤도 셰이커상에 1.5-2시간 동안 배양하여 세포 현탁액내로 단편을 해리한다. 셀 현탁액을 50 mL 튜브로 옮김.
      참고 : 마우스에서 수확 된 종양의 크기가 1cm^3보다큰 경우 써리신의 양을 2 배로 치료하거나 배양 시간을 늘립니다.
   7. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 튜브를 원심분리하고 상월체를 흡인한다.
   8. 5 mL의 암모늄 염화물 칼륨 (ACK) 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 다시 일시 중단하여 적혈구를 용해시합니다. 적혈구의 완전한 용해까지 실온 (RT)에서 3-5 분 동안 튜브를 배양하십시오.
      참고 : 적혈구가 관찰되지 않으면 lysing 과정을 생략하십시오.
   9. 튜브에 20 mL의 DMEM을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 튜브를 원심분리하고 상월체를 흡인한다.
   10. 펠렛을 0.25% 트립신-EDTA 1mL 및 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드(Y-27632)로 다시 일시 중단하여 펠릿을 단일 세포로 해리합니다. 37°C 수조에서 튜브를 5분 동안 배양합니다.
       참고 : 단일 세포로의 완전한 해리를 확인하기 위해 현미경으로 종양을 관찰하십시오. 셀 덩어리가 지속되면 서스펜션을 더 피펫합니다.
   11. 10% 태아 소 혈청 (FBS)으로 DMEM 10 mL을 사용하여 트립신을 중화하십시오. 새로운 50 mL 튜브에 100 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 걸쳐 소화되지 않은 이물질을 제거합니다.
   12. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 튜브를 원심분리하고 상월체를 흡인한다.
   13. 150 μL의 얼음-차가운 성장 인자를 이용하여 24개의 웰플레이트에 잘 코팅하여 지하 막 매트릭스(표)를 감소시키고 24웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에30분 동안 배치하여 지하 막 매트릭스를 고형화한다.
       참고 : 사용 전에 응고를 방지하기 위해 4 °C에서 지하 멤브레인 매트릭스를 해동하고 유지하십시오.
   14. DMEM의 1 mL를 사용하여 펠릿을 다시 중단하고 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 얼음에 1.5 mL 마이크로 튜브로 3-4 x 10⁴ 종양 세포를 전송합니다.
   15. 4°C에서 3분 동안 400 x g에서 마이크로튜브를 원심분리하고 상급체를 조심스럽게 버립니다.
   16. 500 μL의 미리 온화한 오르가노이드 배지(표 1)및 10 μM Y-27632로 세포를 재중단하고 코팅된 잘 로 옮김을 전달한다. 24개의 웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에놓는다.
   17. 여분의 방광 종양 세포는 1.5 mL 극저온에서 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신, 10 % 디메틸 설폭화물 (DMSO)을 포함하는 DMEM의 1 mL로 비축 될 수 있습니다. 저온 냉동 용기에 넣고 용기를 -80 °C 냉동실로 옮김. 하룻밤 동안 냉동실에 보관한 후, 장기간 보관을 위해 저온을 액체 질소로 옮깁니다.
   18. 500 μL의 미리 온난한 오르가노이드 배지를 사용하여 2일마다 배지를 변경한다(그림1B).
2. 배양 방광 종양 오르가노이드.
   참고 : 직경이 100-150 μm에 도달하면 방광 종양 오르가노이드의 통과가 권장됩니다.
   1. 500 μL의 콜라게나아제/디스파스를 종양 오르가노이드가 있는 24개의 웰 플레이트에 있는 오르가노이드 배지에 넣습니다. 지하 멤브레인 매트릭스와 매질을 위아래로 피펫. 37°C에서 20분 동안 배양하고 세포를 15 mL 튜브로 수확합니다.
      참고 : 현미경으로 지하 막 매트릭스에서 분리 된 오르가노이드를 검사하십시오. 오르가노이드가 지하 막 매트릭스에서 분리되지 않으면 배양 시간 이나 파이펫을 더 많이 늘립니다.
   2. 미리 데운 DMEM 5 mL을 추가하고 4 °C에서 3 분 동안 400 x g의 튜브를 원심 분리하고 상월체를 흡인합니다.
   3. 미리 따뜻해진 1 mL의 트립신-EDTA 및 10 μM Y-27632를 사용하여 펠릿을 다시 중단시켰다. 37 °C 수조에서 5 분 동안 배양하십시오. 세포를 위아래로 활발하게 파이펫하고 10% FBS로 DMEM 5 mL을 사용하여 트립신을 중화시화합니다.
   4. 4°C에서 3분 동안 400 x g에서 튜브를 원심분리하고 상월체를 흡인한다.
   5. 미리 온화 한 오르가노이드 배지의 1 mL를 사용하여 펠릿을 다시 중단하고 단일 종양 세포의 수를 계산합니다.
   6. 1.1.14-1.1.18 단계를 반복합니다.

2. 렌티 바이러스 매개 전이를 사용하여 방광 종양 오르가노이드의 유전자 조작(그림 2A)

1. GFP 발현 렌티바이러스 입자를 생성한다.
   1. 0일째에, 플레이트 HEK 293T 세포는 세포주 배양 배지에서 10 cm 세포 배양 플레이트 당 5-6 x 10⁶ 세포의 밀도로(즉, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 가진 DMEM).
   2. 1일째에, GFP(8 μg), 렌티바이러스 패키징 플라스미드(pCMVR 8.74 및 pMD2.G의 3 μg 의 10 μg) 및 감소된 혈청 배지 1mL(재료표)를함유하는 이송 플라스미드를 포함하는 DNA 트랜스펙션 용액을 준비한다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 총 플라스미드 1μg당 3 μL의 형질감염 시약(재료표)을추가하고 파이펫팅을 통해 부드럽게 섞어주세요. RT에서 20 분 동안 배양하고 10 % FBS로 9 mL의 DMEM을 추가하십시오.
   4. HEK 293T 세포를 가진 세포 배양 플레이트에서 배양 배지를 흡인한다. DNA 형질전환 액의 10 mL을 HEK 293T 세포상에 조심스럽게 전달하고 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다.
   5. 3일째에 형광 현미경(488 nm에서 여기 및 512 nm에서 방출)으로 세포를 관찰하여 형질감염 효율을 결정합니다. 전체 세포 집단에 있는 세포의 거의 90%-100%는 GFP를 표현해야 합니다.
   6. 상온액(바이러스 함유)을 수집하고 0.45 μm 폴리에더설폰(PES) 필터로 상구체를 여과한다.
      참고: PES 필터와 같은 단백질 결합 필터를 사용합니다.
   7. 바이러스를 농축시키기 위해, 98,768 x g의 초원심분리기에서 4°C에서 4°C에서 2시간 동안 바이러스 상판을 스윙 버킷 로터(Tableof Materials)에서조심스럽게 폐기한다.
   8. 차가운 오르가노이드 배지 의 2.5 mL에 펠릿을 다시 중단.
   9. 장기 저장을 위해, 렌티바이러스 배지 250 μL을 극저온 바이알에 넣고 액체 질소를 사용하여 스냅 동결시. 냉동 바이러스 성 주식을 -80 °C 냉동실에 보관하십시오.
2. 방광 종양 오르가노이드의 렌티 바이러스 매개 전위를 수행합니다.
   1. 2일째에, 렌티바이러스 매개 형질전환 전에 전술한 바와 같이 종양 오르가노이드를 12시간 분할한다( 단계 1.2) 12시간.
   2. 3일째에, 37°C 수조에서 바이러스를 함유하는 알리쿼트(2.1.9단계)를 신속하게 해동시키고 10 μM Y-27632 및 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 함유한 오르가노이드 배지의 250 μL을 첨가하였다.
   3. 24웰 플레이트에서 오르가노이드 배지를 종양 오르가노이드로 500 μL의 바이러스 함유 배지로 대체하고 인큐베이터에서 12-16시간 동안 배양한다(37°C, 5%_CO2).
   4. 4일째에 신선한 오르가노이드 배지 500 μL로 배지를 변경합니다.
      참고 : 12-16 시간 의 배양 후 렌티 바이러스와 헥사디 메트린을 함유 한 배지가 세포 독성이기 때문에 배지를 변경해야합니다.
   5. 6일째에, 형광 현미경으로 전염 후 3일 후 종양 오르가노이드로부터 GFP 신호를 모니터링한다(도2B).
   6. 10일째에, 항계 및 육수 7일 후, 1.2단계에서 기재된 바와 같이, 유전자 변형 종양 오르가노이드 라인을 유지한다.

3. 방광 오르가노이드의 정형 외과 이식(그림 3A)

1. 정형 외과 이식을 위한 방광 종양 오르가노이드를 준비하십시오.
   1. 이식 전에, 상기와 같이 5-7일 동안 방광 종양 오르가노이드를 배양하였다(단계 1.2).
   2. 500 μL의 콜라게나아제/디스파스를 종양 오르가노이드가 있는 24개의 웰 플레이트에 오르가노이드 배지에 넣으세요. 지하 멤브레인 매트릭스 및 매체를 위아래로 파이펫. 37°C에서 20분 동안 배양하고 세포를 15 mL 튜브로 수집합니다.
   3. 미리 데운 DMEM 5 mL을 추가하고 4 °C에서 3 분 동안 400 x g의 튜브를 원심 분리하고 상월체를 흡인합니다.
   4. 1 mL의 DMEM으로 펠릿을 다시 일시 중단하고 용액을 90mm 페트리 접시로 옮김.
   5. 현미경으로, p200 마이크로 파이펫을 사용하여 10-100 종양 오르가노이드를 집어 얼음에 마이크로 튜브로 수집합니다.
   6. 4 °C에서 3 분 동안 400 x g에서 튜브를 원심 분리하고 조심스럽게 상류를 버립니다.
   7. 마우스가 수술을 받을 준비가 될 때까지 얼음위에 세포 펠릿을 유지합니다.
2. 점막 방광 벽 이식
   참고 : 이 절차는 Fu et al^18에의해 게시 된 프로토콜에서 수정됩니다.
   1. 새로운 환경에 적응할 수 있도록 실험 1주일 전에 8~10주 된 남성 누드 마우스(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl)를 준비합니다. enrofloxacin주입 (5 mg/kg) 피하 24 수술 전에 시간.
   2. 비누와 물로 벤치 표면을 청소합니다. 수술 전에 수술 기구를 오토클레이브하고 멸균 기구를 사용하여 수술을 수행하십시오.
   3. 29 G 인슐린 주사기, 파이펫 팁 및 지하 멤브레인 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오. 케토 프로 펜을 관리 (5 mg/kg) 마취의 관리 하기 전에 피하.
   4. 유도 챔버에서 4 % 이소플루란으로 마우스를 마취시. 전신 마취가 달성되면, 마우스를 척추 위치에 놓고 2 % 기화 된 이소플루란의 마스크 흡입으로 마취를 유지하십시오.
      참고: 마취 시간이 30분 이상이면 면봉을 사용하여 두 눈의 연고를 적용하여 각막 건조를 피하십시오.
   5. 멸균 거즈로 포비동 요오드를 바르고 70% 에탄올로 닦아냅니다. 매번 새 거즈 나 면봉으로 3 회 반복하십시오.
   6. 일회용 멸균 수술 커튼을 사용하여 항문과 수술 장을 덮습니다.
   7. 배율을 위해 해부 현미경을 사용하여 멸균 수술 가위로 하부 중질 복부의 피부와 근육 벽에 작은 횡절개 (1.5 cm 미만)를 만듭니다. 복강에서 방광을 노출하고 식염수에 젖은 면봉으로 지지하십시오.
      참고: 방광이 소변으로 가득 차 있으면 방광을 부드럽게 눌러 약간 압축을 풀수 있습니다.
   8. 50% 고농도 지하 막 매트릭스를 함유하는 오르가노이드 배지의 80 μL에서 오르가노이드 펠릿(단계 3.1.7)을재중단(재료표).
   9. 해부 현미경으로 29 G 인슐린 주사기를 사용하여 방광 돔의 전방 측면에 오르가노이드 현탁액을 주입하십시오.
   10. 항균 흡수 봉합술로 복벽의 내부 층을 닫은 다음 4-0 나일론 봉합사로 외부 층을 닫습니다. 포비도 요오드와 70 % 에탄올로 수술 부위를 소독하십시오.
   11. 마우스가 적외선 조사기 에서 10-15 분 동안 회복될 수 있도록 하십시오.
   12. 수술 후 하루, 마우스의 일반적인 상태와 해부학 누출을 확인합니다. 케토프로펜 (5 mg/kg)을 수술 후 3일 동안 매일 한 번 관리하고, 수술 후 10일 동안 매일 1회 엔로플록사신(5 mg/kg)을 치료하십시오.
   13. 절개 부위가 치유되면 (수술 후 10-14 일), 봉합사를 제거하십시오. 종양 오르가노이드 주입 후 2-3 주 동안 마우스 방광 종양의 성장을 모니터링하십시오.
   14. 방광 종양 성장이 관찰되면 이산화탄소 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 전체 방광 종양을 수확하십시오. 차가운 DPBS(그림 3B)^16을사용 하 여 씻어.
   15. 방광 종양 조직학을 분석하기 위해, 헤마톡신 및 에오신(H 및 E) 염색을 사용하여 조직의 파라핀 내장 부분을염색(도 3B)^16.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 시험관 내 배양
~1 cm3 BBN-유도 종양으로부터 해리된 종양 세포의 수는 적어도 4 x 105 세포이다. 세포가 처음에 지하 막 매트릭스에 파종되면, 비암성 세포 및 파편이 관찰될 수 있다. 이물질은 서브컬쳐를 계속하여 서서히 희석되었다. 도 1B는 상이한 시점에서 배양된 오르가노이드의 이미지를 나타낸다. 종양 세포가 종양 오르가노이드를 형성하지 않는 경우, 세포는 해리 단계 동안 잠재적으로 죽은. 이러한 경우, 효소와의 배양 시간을 포함한 해리 절차는 세포 생존력을 높이기 위해 조정될 필요가 있다.

렌티바이러스 매개 유전자 조작을 이용한 방광 종양 오르가노이드에서 GFP의 발현
방광 종양 오르가노이드는 성공적인 렌티바이러스 감염으로 강한 GFP 신호를 나타냈다(그림 2B). 농도 후, 총 250 μL의 바이러스 함유 매체는 지하 막 매트릭스상에 3 x 104 개의 단일 종양 세포를 감염시키기에 충분했고, 90%-100% 감염 효율을 유지했다. GFP 신호는 렌티바이러스 성전환 후 3일 후에 방광 종양 오르가노이드에서 검출될 수 있었다. 형광 신호가 낮으면 바이러스 감염의 효율이 잠재적으로 낮습니다. 이것은 낮은 바이러스성 적등기와 같은 수많은 요인 때문일 수 있고, 절차는 그에 따라 조정될 필요가 있습니다.

방광 종양 오르가노이드의 정형 외과 이식
BBN 유도 방광 종양 오르가노이드로부터 수득된 방광 종양 동종 이식편은 도 3B16에제시된다. 방광 종양 동종 이식은 정형외과 이식 후 3주 후에 수확되었다. 이식된 방광 종양의 안과는 H 및 E 염색을 사용하여 분석되었다. 종양 오르가노이드의 정형 외과 이식은 2-3 주 동안 방광 종양으로 증가할 수 있습니다.

그림 1: 마우스 방광 종양 오르가노이드의 시험관 내 배양. (A)마우스 방광 종양 오르가노이드의 확립을 위한 회로도. (B)방광 종양 오르가노이드의 배양에 대한 대표적인 이미지는 상이한 시점에서. 마우스 방광 종양 오르가노이드를 9일 동안 확립하고 배양하였다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 렌티바이러스 매개 유전자 조작을 사용하여 방광 종양 오르가노이드에서 GFP의 발현. (A)렌티 바이러스 형질 전환 및 방광 종양 오르가노이드의 변환의 개략도. (B)GFP를 발현하는 방광 종양 오르가노이드의 대표적인 이미지. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 방광 종양 오르가노이드의 정형 외과 이식. (A)누드 마우스에 방광 종양 오르가노이드의 정형 외과 이식의 개략도. (B)방광 종양 오르가노이드로 이식된 마우스에서 방광 및 H 및 E 염색된 절편을 대표적인 이미지. 가운데 패널의 박스된 영역의 확대된 뷰는 왼쪽 패널에 표시됩니다. 배율 막대 = 500 μm. 이 수치는 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 4.0 국제 공공 라이선스(CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에 따라 발행된 그림 1-그림 보충 1, Kim 등16에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 방광 종양 오르가노이드 배지의 조성.

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.