방법 논문

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

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DOI:

10.3791/60472

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2019년 11월 7일

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1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Hospital, 2Children's National Heart Institute, Children's National Hospital, 3Center for Neuroscience Research, Children's National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences, George Washington University

이 논문에서

요약

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

초록

작은 동물 모델은 더 큰 동물에 비해 유전자 변형 종의 가용성과 낮은 비용으로 인해 심장 혈관 연구에 가장 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 더 큰 포유동물은 일반적인 심장 생리학, 병리생리학 및 치료제의 전임상 시험과 관련있는 번역연구 질문에 더 적합합니다. 심장 연구에서 더 큰 동물 모델을 사용하는 것과 관련된 기술적 장벽을 극복하기 위해, 우리는 고립된 랑엔도르프(Langendorff)가 주입한 돼지 심장에서 생리학적 매개 변수를 측정하는 접근법을 설명합니다. 이 접근법은 심장상태를 평가하기 위한 두 가지 강력한 실험 도구를 결합합니다: 전기생리학(EP) 연구와 파라미터 민감한 염료(RH237, Rhod2-AM)를 사용하여 막간 전압과 세포내 칼슘의 동시 광학 매핑. 기재된 방법론은 심장 전도 시스템, 활동 잠재적 형태, 칼슘 취급, 여기 수축 커플링 및 심장 교류의 발생률을 조사하는 번역 연구에 적합합니다. Arrhythmias.

서론

심혈관 질환은 전 세계적으로 질병과 사망의 주요 원인입니다. 이와 같이, 1 차적인 연구 초점은 일반적인 심장 생리학 및 인간에 있는 이환율 그리고 사망에 기여할 수 있는 근본적인 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있는 방법론을 낙하하는 것입니다. 기본 심장 혈관 연구는 전통적으로 설치류와토끼를포함한 작은 동물 모델에 의존하고있다1,2,3,때문에 유전자 변형 종의 가용성4,5, 더 낮은 비용, 더 작은 실험 발자국 및 더 높은 처리량. 그러나, 돼지 모델의 사용은 보다 임상적으로 관련된 데이터를 제공할 가능성이있다 6. 실제로, 이전 연구는 인간과 돼지 사이의 심장 전기 생리학 (EP)에서 유사 이온 전류7,동작 전위 모양8및 약리학적시험에대한 반응을 포함하여 9. 더욱이, 돼지 심장은 설치류 또는토끼(10)보다인간과 더 유사한 수축성 및 이완 역학을 가지고 있다. 개 모델에 비해, 돼지 관상 동맥 해부학은 더 밀접하게 인간의 심장과 유사11,12 심장 발달에 초점을 맞춘 연구에 대한 선택의 모델입니다, 소아 심장학 및 / 또는 선천성 심장 결함 13. 돼지와 인간의 심장8사이에 차이가 있지만, 이러한 유사성은 돼지 심장을 심장 혈관 연구를위한 가치있는 모델로14.

심장의 역행 관류는 오스카 랑엔도르프16에의해 처음 설립된 이래로 심장 역학 ex vivo15를 연구하기 위한 표준 프로토콜이 되었다. 따라서, 랑엔도르프 관류는 자율적 영향이 없는 상태에서 고립된, 온전한 심장을 지원하는 데 사용될 수 있다. 이 모델은 심장 전기 생리학과 건강하지 않은 심장 사이의 수축성을 직접 비교하는 데 유용한 도구입니다. 심장 역학은 시간적으로 그리고 공간적으로 복잡하기 때문에, 한 지역에 있는 경미한 변경은 극적으로 syncytium17로 일하는 전체 심혼의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 파라미터 민감한 염료의 높은 시공간 화상 진찰은 심혼의 표면에 걸쳐 심장 기능을 감시하기 위한 유용한공구18,19. 실제로, 전압 및 칼슘에 민감한 형광 프로브의 동시 이중 이미징은 조직 수준20,21에서전기 활성, 칼슘 처리 및 여기 수축 커플링의 평가를 허용합니다. 22,23,24,25,26,27,28. 랑엔도르프 관류 및/또는 광학 매핑 기술은 이전에 노화 또는 유전 적 돌연변이로 인한 심장 성능 저하를 문서화하고 약리작용제 또는 환경 노출의 안전성을 평가하는 데 사용되었습니다29 ,30,31,32,33.

임상 환경에서, 침략적인 심장 전기 생리학 연구는 수시로 심장 리듬 소요를 조사하고, 병리학을 확인하고, 가능한 처리 선택권을 찾아내기 위하여 이용됩니다. 유사하게, 우리는 부비동 노드 기능을 평가하고, 방실 전도를 측정하고, 심근 조직의 내화성을 확인하는 데 사용될 수 있는 EP 프로토콜을 기술합니다. 기재된 EP 연구는 고립된 심혼에 있는 심장 생리학을 완전하게 특성화하기 위하여 광학 매핑, 또는 안과엽(34)과함께 수행될 수 있다. 기재된 프로토콜에서, 높은 시공간적 분해능 형광 이미징은 이중 방출 설정에서 전압(RH237) 및 칼슘(Rhod-2AM) 염료의 조합으로 수행되었다. 추가적으로, 심장 전기 생리학 파라미터는 부비동 리듬 및 프로그램된 전기 자극에 응하여 둘 다의 밑에 감시되었습니다.

프로토콜

모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회 (8 판)에 따라 실시되었다. 이 연구 결과에 사용된 모든 방법 및 프로토콜은 NIH에 의해 간행된 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 따라 아이들의 국립 병원에 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 위원회에 의해 승인되었습니다. 이 연구에 사용된 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하여 인도적인 치료를 받았습니다.

1. 준비

  1. 수정된 크렙스-헨셀레이트 용액16의 6 L을 준비한다(mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4,24.0 NaHCO3,1.2 KH2PO4,10.0 글루코스, 2.0 나트륨 피루바테, 2%의 알부민, 2.0 CaCl2). 실험 당일 CaCl2를 추가하면 시간이 지남에 따라 인산염이 있는 경우 염화칼슘이 칼슘 인산염으로 용액에서 침전됩니다.
  2. 멸균 여과 후 pH를 7.4로 조정합니다(공극 크기: 0.22 μm). 275-310 mOsm/kg의 범위를 보장하기 위해 솔루션 삼투압을 확인하십시오. 심장이 절제된 직후 얼음에 1L를 식혀 서두세요. 보온겐(95%O2,5%CO2)을버블링하기 전에 약 37°C로 수조에서 3L를 따뜻하게 한다.
    참고: 온난화는 차가운 액체가 용해할 수 있는 가스 용량을 증가시키기 때문에 기포와 잠재적색전증을 최소화합니다. 따라서 수정된 크렙스-헨셀리트 매개체가 관류 시스템을 통과하고 따뜻해짐에 따라 가스가 기포로 방출됩니다.
  3. 2 L의 심전도를 준비한다(변형된 델 니도 심전도 용액, 표 1). 500 mL 비커를 채우기 위해 얼음 큐브 트레이에 충분한 심전도를 얼린다.
  4. 42 °C로 설정 된 순환 수조를 켭니다. 펌프를 켜서 닫힌 수력 가열 루프에서 향수를 순환시립니다(전체 재료 목록은 재료 표 및 그림 1참조).
    참고: 가열 된 순환 수조는 물 재킷 튜브와 열교환기를 따뜻하게하는 데 사용됩니다.
  5. 시스템을 통해 물에 보편적 인 세제의 1 % 용액 2 L을 실행하여 튜브 회로 및 챔버를 청소합니다. Langendorff 시스템의 모든 튜브 회로와 챔버를 정수된 물 >4 L로 헹구십시오. 시스템에서 모든 물이 제거될 때까지 펌프를 실행합니다.
  6. 관류 펌프 (폴리 프로필렌 필터, 기공 크기 >5 μm)에 맞춰 합성 멤브레인 필터를 추가하십시오. 80 kPa에서 95 % O2 및 5 %CO2가있는 극세사 산소 공급기 (헤모 필터)를 가스로.
    참고: 알부민을 사용할 때, 종종 튜빙 회로를 통해 산소 화 및 / 또는 펌핑 활동과 관련된 거품이있다. 항폼 화합물(antifoam Y30 에멀젼)은 주기적으로(~30분마다) 첨가하여 담금질할 수 있습니다.
  7. 대강위 또는 버블 트랩에 위치한 압력 센서에 대한 2점 교정(0 및 60 mmHg)을 확인합니다. 필요에 따라 보정하십시오.
  8. 심장 절삭 직전에 Langendorff 루프 관류 시스템에 미디어를 붓습니다. 배향물이 산소화 된 이향수로 가스가 공급되는 마이크로 화이버 산소 공급기 (hemofilters)를 통과한 다음 열교환기를 통해 대류에서 37 °C의 매연 온도를 유지하십시오.
  9. 순환 수조를 42°C와 같은 37°C보다 몇 도 높게 설정하여 교환 시 및 시스템 전반에 걸쳐 열 손실을 고려합니다. 열전대와 순환 이향수 온도를 모니터링합니다.

2. 심장 절제 및 랑엔도르프 관류

  1. 케타민 (20 mg/kg)과 자일라진 (2 mg / kg)의 근육 내 (I.M.) 주사로 돼지를 진정시키고 내구 튜브로 삽관하십시오. 유도를 위해 펜타닐 (50 μg / kg)과 로쿠로늄 (1 mg / kg)의 정맥 (I.V.) 볼러스 주사를 투여하십시오. 흡입 된 이소플루란 (0.5−3 %), 펜타닐 (10-25 μg / kg), 판쿠로늄 (1 mg / kg)으로 마취를 유지하십시오.
    참고: 이 원리 증명 연구를 위해, 청소년 요크셔 돼지 (14-42 일, n = 18)는 체중 2.5-10.5 kg 및 18-137 g 의 심장 무게(그림 2)에서원거리로 사용되었습니다. 유도를 위한 추가 주입이 필요한 경우에, 케타민 (10 mg/kg) I.M. 주입될 수 있습니다.
  2. 일단 동물이 완전히 마취되고 반응하지 않는, 상승 대원과 오른쪽 심방을 노출하는 절제술을 수행합니다.
    1. 메스를 사용하여 흉부 입구의 흉골 상단에서 xiphoid 과정까지 중간 절개를합니다. 소작 (또는 가위)으로 흉골이 보일 때까지 기본 지방과 근육을 해부하십시오.
    2. xiphoid 프로세스에서, 외과 뼈 가위 또는 뼈 톱으로 manubrium를 통해 흉골 중간선을 잘라. 심장을 노출하는 절개에 리트랙터를 삽입합니다.
  3. 18 G 바늘과 주사기를 사용하여 오른쪽 심방으로 헤파린 (300 U / kg)의 볼루스 복용량을 전달하여 장기 절제 시 혈전을 최소화하십시오. 흡수 패드를 가슴 구멍에 놓고 심장 주위에 얼음을 두습니다.
  4. 가위로 심낭을 조심스럽게 슬라이스하고 주변 결합 조직에서 무딘 해부로 대동맥을 분리하고 대동맥 아치의 첫 번째 동맥 가지 바로 아래에 대동맥을 고정시다. 18 G 바늘이있는 50 mL 주사기를 사용하여 오름차순 대받침의 상단을 통해 얼음 차가운 심장 변삭증 (20 mL / kg)을 주입하십시오.
  5. 심장으로 이어지는 혈관을 잘라 내고 오름차순 대류로 심장을 제거하고 절제 된 심장을 얼음 차가운 심장 전절기로 떨어 급하게하십시오.
  6. 한 쌍의 지혈로 대공의 벽을 잡고 심장 위에 매달린 얼음 차가운 심전도 1 L (~ 70mm Hg를 제공하기 위해 ~ 95cm)으로 이어지는 튜브에 부착 된 골비 캐뉼러에 미끄러. 거품이 혈관에 유입되는 것을 방지하기 위해 물이 대류에 들어오고 채울 때까지 하십시오.
    참고: 기계적 비커플러 (2,3-부탄디온 단색 [BDM] 또는 blebbistatin)의 사용은 조직의 산소 수요가 감소함에 따라 관상 관류 속도를 감소시킬 것이다.
  7. 탯줄 테이프를 사용하여 캐뉼라에 대류를 고정하고 심장의 무게를 견딜 수 있도록 지혈을 묶어 추가로 고정하여 캐뉼라에 매달려 있습니다(그림 1C). 차가운 매체가 중력을 통해 70 mmHg의 일정한 압력으로 심장을 역행할 수 있도록 하십시오. 따뜻한 (37 °C) 랑엔도르프 관류 시스템 (&10 분)으로 옮길 준비가 될 때까지 차가운 심전도에 잠긴 심장을 유지하십시오.
    참고: 작은 하트 (&50g, 최대 2 주 된 돼지)의 대반은 심장의 무게를 부담하지만 더 큰 마음은 캐뉼라에서 미끄러질 위험이 있습니다. 초기 통조림 동안 그리고 따뜻하게 시스템으로 이동할 때, 관상 동맥 색전증을 일으킬 수있는 대동맥에 공기가 들어가는 것을 방지하십시오. 대강당에 들어가는 용액보다 기포가 더 빨리 상승할 수 있도록 대형 보어 튜브(>3/8" 내부 직경)를 사용하십시오.
  8. 캐뉼라에 공기를 유입하지 않고 심장을 랑엔도르프 시스템(37°C)으로 옮김을 옮니다. 정상적인 부비동 리듬이 남은 혈액과 심장 마비의 혈관을 씻어 내도록 하십시오.
    참고: 기재된 연구에서 184±17 mL/min의 평균 초기 유량은 고립된 청소년 돼지 심장에서 관찰되었다. 유량은 기계적 비커플러(20 mM BDM)를 포함하는 온난한 매체로 정중한 후에 70±7.5 mL/min(평균 ±SEM)로 감소하였다. 심장 이미징에 영향을 미칠 수 있으므로 심장 조직을 침수시키지 마십시오. 조직 온도는 설치류에 비해 더 큰 부피와 더 작은 표면적으로 인해 돼지 심장의 관상 동맥 흐름에 의해 유지됩니다. 전체 유량하에서, 상피 및 심내막 온도는 각각 35 °C에서 37 °C까지 다양합니다.
    주의 사항: 기계식 언커플러로 작업할 때는 아이웨어를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 심장은 미디어를 신속하고 예기치 않게 배출할 수 있습니다.
  9. 충격적인 부정맥 (심실 빈맥, 심실 세동)의 경우 심장의 정점과 기저에 외부 외륜을 배치하고 5 J에서 단일 충격을 전달하여 심장을 제소하십시오 5 J 증분 (또는 선택 가능한 것으로 제세동기) 50 J, 심전도 또는 충격없는 리듬까지. 필요에 따라 50J에서 충격을 반복합니다.
    참고: 제시된 연구 결과에서는, 준비의 89%는 제세동을 요구했습니다. 평형(~10분) 후, 평균 심박수 70±4.5 bpm(평균 ±SEM)을 청소년 돼지 심장에 대해 관찰하였다(그림2).
  10. 수정 된 Krebs-Henseleit 매체의 적어도 1 L로 심장을 씻어, 재순환하지 않고, 어떤 잔여 혈액과 심장 전기를 제거합니다. 미디어가 심장을 통해 명확하게 실행되면, 순환 루프를 닫아 향수를 재순환시다.

3. 전기생리학 연구

  1. 연구 과정 내내 표준 리드 II 심전도(ECG)를 기록하려면 정점 근처의 심실 에피카슘에 29G 바늘 전극을 부착하고 오른쪽 심방의 다른 전극을 부착합니다. 차동 바이오앰프의 양수 및 음수 입력을 각각 정점 및 우측 심방과 연결합니다.
  2. 우심실상에 양극성 자극 전극 1개를 부착하고, 제2 양극성 자극 전극을 보조를 위해 측면 좌심실에 부착한다.
  3. 전기생리학 자극기를 사용하여 심장의 속도를 조정하고, 초기 전류는 확장기 임계값(1−2 mA)과 1 ms 펄스 폭35,36으로설정됩니다.
    참고: 자극이 반응을 유도하지 못하는 경우, 펄스 폭은 큰 동축 전극(양극성 자극)으로 더 많은 전류(~10x)가 필요하므로 최대 2 ms. 더 많은 전류(~10x)까지 증가될 수 있다.
  4. 일관된 자극 반응을 보장하기 위해 정의된 속도 주기 길이(PCL)에서 일련의 자극 자극(1−2 mA, 1 ms 펄스 폭)을 적용하여 진도 임계값을 식별합니다.
    참고: 본질적인 비율이 설정되면, 초기 임펄스 열차는 약간 더 짧은 PCL에서 시작할 수 있습니다.
  5. S1-S1 또는 S1-S2 진도 열차를 사용하여 엑스트라 자극 간격을 수행하고, 후자의 경우 6-8 임펄스(S1)의 열차가 단일 임펄스(S2)를 뒤따랐다. 캡처에 실패할 때까지 S2 PCL을 단계별로 10ms(즉, 200ms, 190ms, 180ms 등)로 줄입니다. 끝에서 두 번째 PCL (즉, 190 ms)까지 단계 및 캡처의 손실 전에 가장 정확한 PCL을 찾기 위해 1 ms 간격의 감소 (즉, 184 ms).
    참고:     동일한 자극 파라미터는 S1 및 S2(1-2 mA, 1 ms 펄스 폭)에 모두 사용됩니다. 대표적인 예는 도 3을 참조하거나, 또는 이전에 발표된 돼지 심장 전기생리학측정값 37을참조한다.
    1. 심실 유효 내화 기간 (VERP)을 확립하기 위하여는, S2 (조기 박동)가 심실 탈분극을 개시하는 최단 S1-S2 간격을 확인하기 위하여 측방 좌심실의 자극 전극을 이용하십시오.
      참고: 내화 기간은 가장 짧은 달성 가능한 S1−S2 커플링 간격입니다.
    2. Wenckebach 사이클 길이 (WBCL)를 정의하려면 오른쪽 심방의 자극 전극을 사용하여 1:1 방실 전도가 정상적인 전도 경로를 통해 전파되는 가장 짧은 S1-S1 간격을 찾습니다.
      참고: 그렇게하지 않으면2 도 심장 블록을 나타냅니다.
    3. 부비동 노드 회수 시간(SNRT)을 정의하려면 오른쪽 심방의 자극 전극을 사용하여 진도 열차(S1−S1)를 적용하고 진도 열차의 마지막 임펄스 사이의 시간 지연과 자발적인 부동축 노드 매개 활성의 회복을 측정합니다.
    4. 방실 노드 유효 내화 기간 (AVNERP)을 설정하려면, 조기 심방 자극이 QRS를 유도하는 그의 번들 잠재력 다음에있는 가장 짧은 S1-S2 커플링 간격을 찾기 위해 오른쪽 심방의 자극 전극을 사용 심실 탈분극을 의미하는 복합체.

4. 막 간 전압 및 세포 내 칼슘의 광학 매핑

참고: 광학 매핑 중에 모션 아티팩트를 최소화하고 저산소증3,38,39,40을피하기 위해 기계적커플러를사용해야 합니다. (-/-) 블레비스타틴(5 μM 순환 농도)은 5 mL의 향수(최종 농도의 100x)에서 0.5 mM의 볼러스 용량으로서 천천히 첨가될 수있다(최종농도의 100x). 대안적으로, BDM은 20 mM의 순환 농도에서 처음에 향수 매질 매체에 포함될 수 있다.

  1. 5 mg의 RH237을 무수 DMSO 4 mL로 용해시켜 전압 염료를 준비합니다. 최대 5 mL의 미디어 및 소용돌이로 염료 알리쿼트를 희석합니다. 대동맥 캐뉼라에 RH237 (500 mL당 62.1 μg)을 천천히 넣습니다.
    참고: 심근 조직은 RH237로 다시 염색될 수 있습니다, 필요한 경우, 실험의 기간 내내.
  2. Rhod2-AM 1 mg을 무수 DMSO 1 mL에 용해시켜 칼슘 염료를 준비합니다. 염료를 50 μL의 플루론산과 혼합하고 37°C 초음파 처리 욕조에 최대 10분 동안 넣고 최대 5 mL의 매체로 희석합니다. 칼슘 염료 (500 mL 당 500 mL의 박독)를 대동맥 캐뉼라에 천천히 추가하십시오.
    참고: 균일 한 염료 염색을 보장하기 위해 염료를 천천히 첨가해야합니다 (>30 s). Rhod-2AM은 피크 형광에 도달하는 데 최대 10분이 걸리지만 RH237은 1-2분 이내에 심장을 더럽히며, 설명된 염료 로딩을 사용하여 전압과 칼슘의 경우 각각 ~42−86 및 ~35-69범위의 신호 대 잡음 비(SNR) 범위를 기대할 수 있습니다. SNR 값은 SNR = (피크-피크 카운트)/(확장기 간격 동안 표준편차)(42)로계산할 수 있습니다.
  3. 그림 1과같이 이미징 하드웨어(카메라, 이미지 스플리터, 렌즈)를 배치하여 적절한 시야에 초점을 맞춥니다.
    참고: 스플리터는 RH237을 통과하고 Rhod2 방출 스펙트럼을 반영하는 이색 미러(660+ nm)로 구성됩니다. 고투투율 방출 필터는 RH237(710 nm 롱 패스) 및 Rhod2(585±40 nm) 발광 광(롱 패스 ET710, 재료 표참조)에 사용된다. 와이드 동공 50mm/F0.95l 렌즈가 이미지 스플리터 전면에 부착되어 있습니다. 이 구성으로 인해 이전에 검증된43,44와같이 적절한 방출 광 분리가 발생합니다.
  4. 카메라를 워크스테이션에 연결하고 0.5-2 ms의 노출 시간으로 선택한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하여 원하는 영역을 분할하고 오버레이하고 회색 눈금 빼기 또는 의사 색상을 표시할 수 있는 소프트웨어의 도움으로 이미지 정렬을 수행합니다. 부결을 강조 표시할 수 있습니다(소프트웨어에 대한 재질 표 옵션 참조).
  5. 실내 조명을 끄면 주변 조명의 형광 간섭을 최소화할 수 있습니다. 이미징시작 전에 LED 조명(525nm, 1.4mW/mm2)을테스트하여 센서의 깊이에 따라 균일하고 최대적인 주근회 조명을 보장합니다.
    참고: 각 빛은 여기 필터(535±25 nm)를 통해 전달됩니다. 신호 선형성을 최대화하기 위해 촬영 전에 LED 조명을 수동으로 트리거할 수 있습니다. 상피낭으로부터 방출된 형광은 이미지 스플리터 및 방출 필터를 통과한다. 분할 이미지는 고속 센서에 투사됩니다. 시야는 각 분할 이미지에 대해 약 12cm x 10cm 또는 5.9cm x 4.7cm이며, 렌즈 선택 및 심장으로부터의 거리에 따라 달라집니다.
  6. 광학 매핑 연구의 경우, 부비동 리듬 동안 심근, 심실 세동(그림4)또는 동적 진도(S1−S1, 1−2 mA, 1 ms 펄스 폭)를 좌심실 상에 위치하는 자극 전극을 통해 이미지화한다(그림5). 350 ms의 진도 사이클 길이로 시작하고 10-50 ms로 감소하여 복원 곡선을 생성합니다(그림 5E)35,36.

5. 정리

  1. 시스템에서 심장을 제거하고 모든 향수를 배출합니다. 시스템 튜브와 챔버를 정제수로 헹구고 있습니다.
  2. 일상적인 유지 보수를 위해 필요에 따라 세제 용액 또는 희석 된 과산화수소 용액으로 시스템을 주기적으로 헹구하십시오.

6. 데이터 처리

  1. 적절한 소프트웨어 패키지 또는 사용자 지정 알고리즘을 사용하여 비디오 파일을 열고, 관심 영역을 선택하고, 시간에 따라 평균 형광을 플로팅하여 연구 전반에 걸쳐 광 신호 품질을 확인합니다.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 이미징 데이터를분석하는 23,33,43,45,46,활성화 시간을 포함한 활동 전위 및 칼슘 과도 적 측두파라미터를 정량화하기 위해, 전압 칼슘 커플링 시간(Vm과 Ca 활성화 시간의 차이) 및 재분극 지속 시간 측정.
    1. 임계값을 적용하여 형광 전도 픽셀을 격리하고 시끄러운 배경 데이터를 삭제합니다.
      참고: 임계값을 설정하면 대규모 비디오에서 분석 속도가 단순화되고 속도가 빨라집니다.
    2. 그림 4 및 그림 5에서 볼 수 있듯이 3mm x 3mm ~ 5mm x 5mm범위의 커널 크기로 주반 표면 영역에 걸쳐 광 신호를 공간적으로 필터링합니다.
      참고: 후자는 동작 전위 특징, 칼슘 과도 형태, 또는 파면의 전체 윤곽을 왜곡하지 않고 SNR을 향상시킬 것이다19,47. 픽셀이 큰 센서를 사용하거나 수집 중에 비닝하는 경우 이 문제가 필요하지 않을 수 있습니다.
    3. 100Hz에서 75Hz 사이의 차단 주파수가 있는 디지털 저변통과 필터(예: 5차 버터워스)로 신호를 일시적으로 필터링하여 사소한 신호 콘텐츠45를제거합니다.
      참고: 대표적인 처리된 추적의 예는 그림 5C를 참조하십시오.
    4. N차다 다항식 피팅을 통해 드리프트 제거 및 뺄셈을 적용하여 광표백, 모션 또는 기타 중요한 변형 소스의 영향을 최소화합니다.
    5. 전체 비디오에서 광학 데이터를 처리하고 정규화한 후 관심 있는 작업 전위 및 칼슘 과도 파라미터를 계산합니다. 재분극 동안 최대 미분 시간으로 정의된 활성화 시간 및 피크 형광을 계산하여 재분극 백분율 시간 및 기간(작업 전위 기간 [APD] 및 [Ca 2+ ]i duration[Ca2+]iduration [Ca]]를 결정하기 위해 그림 5).
    6. 시간적 파라미터가 계산된 후, 사용자 지정 알고리즘 23,33을사용하여 전체 이미지 에피문 표면에 걸쳐 단일 동작 전위 또는 칼슘 과도의 측면을 묘사하는 등소크로날 맵을 생성합니다. 43,45,46.
      참고: 예제는 그림 5D를 참조하십시오.

결과

도 1A는 튜브 회로, 펌프, 필터, 산소 공급기, 저수지 및 가열 요소를 포함하는 단리된 심장 관류 시스템의 다이어그램을 나타낸다. ECG(리드 II 구성) 및 진도 전극의 배치는 도 1B에도시되어 있으며, 이미징 설정은 도 1C에도시되어 있다. 광학 부품 및 광 경로의 회로도는 그림 1D에나와 있습니다.

실험 연구는 2.5-10.5 kg의 체중과 18-137 g의 심장 무게(그림 2A)에서크기 범위의 청소년 요크셔 돼지 (14-42 일, n = 18)에서 분리 된 온전한, 전체 심장에 수행되었다. 고립된 심장을 랑엔도르프 시스템(37°C)으로 옮긴 후, 심박수는 제세동 후 ~10분 이내70±4.5 bpm(평균 ±SEM)으로 안정화되고 연구 기간 내내 일정하게 유지되었다(도2B). 184±17 mL/min(평균 ±SEM)의 평균 유량을 측정하였고, 기계적 결합기를 함유하는 온난한 매체를 응비한 후 70±7.5 mL/min으로 둔화되었다(도2C).

리드 II 심실 방출기는 부비동 리듬 동안 연구 기간 내내 기록되었다(도3A)또는 외부 진도에 반응하여(그림 3B-E)전기 생리학적 파라미터를 정량화하였다. EP 평가를 위해, 동적 진도(S1-S1)는 WBCL 및 SNRT(S1-S1 개시 후 회복 시간, 도 3C)를정확히 찾아내기 위해 우측 심토리에 적용되었으며, 이때 WBCL은 심실 전도에 대한 심심을 개시한 가장 짧은 PCL로 표시되었다. S1-S2 진도 프로토콜은 좌심실 탈분극을 개시한 최단 커플링 간격을 식별하기 위해 좌심실상양극 전극을 사용하여 구현되었고, VERP(그림3D)를정확히 찾아냈다. 또는 그림 3E와같이 S1-S2 심방 pacing 프로토콜이 AVNERP(S1−S2)를 정확히 찾아내기 위해 적용됩니다. 돼지 심장 전기 생리학 매개 변수의 대표적인 예는 이전에 출판 된 것과 밀접하게 정렬37.

광학 매핑 실험은 부비동 리듬, 자발적 심실 세동(도4)또는 좌심실(LV)의 동적 진도(S1−S1) 동안 에 도시된 전기 및 칼슘 회복 곡선을 생성하는 동안 수행되었다. 그림 5. 염료가 장착된 돼지 심장의 대표적인 이미지는 에피카이어 표면에서 관심 있는 두 영역으로부터 수집된 해당 광학 작용 전위(Vm) 및 칼슘(Ca) 과도 상태(우심실 [RV] = 파란색, LV = 적색)와 함께 도 4에 도시되어 있습니다. . 처리되지 않은 신호는 부비동 리듬 과 심실 세동 중에 표시됩니다. 앞서 언급한 바와 같이, 동적 에피카디얼 간격(S1−S1)은 또한 광학 매핑 실험 중에 내재적 심박수의 약간의 차이를 정상화하는 데사용되었다(그림 5A-E). 원시 신호가 표시된다(RV=블루, LV = 적색), 이는 작용 전위를 나타내기 위해 사용되었다―칼슘 과도 커플링시간(도 5C),활성화 및 지속 시간(도5D),전기 및 칼슘 회복(도5E). 두꺼운 심근 제제의 경우, 커널 크기의 공간 필터링 ~ 3 mm x 3 mm는 상피 작용 전위 또는 칼슘 과도 분석19,47에적합합니다. 따라서, 고공간 해상도 이미지(설명된 설정 에서 1240 x 1024 총, 또는 채널당 620 x 512, 6.5 μm 픽셀 크기)는 종종 수집 후 또는 사후 수집 중에 공간적으로 비닝된다(도5C). 이미지 처리는 사용자 정의 알고리즘23,33,43,45 (그림 3D)를사용하여 활성화 및 재분극맵을 생성하기 위해 수행 될 수있다, 의 활성화 시간 심혼에 각 픽셀은 활동 전위 또는 칼슘 과도 업스트로크의 최대 유도체로 정의되었다.

figure-results-1
그림 1: 실험 설정. (a)단리된 심혼 관류 시스템의 다이어그램; 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. (B)전극 배치와 함께 수축된 심장이 표시됩니다. RA = 오른쪽 심방, RV = 우심실, LV = 좌심실, 심전도 = 리드 II 심전도. (C)심장 조직에 가까운 이미징 플랫폼. (D)각 보상 프로브(전압, 칼슘)의 방출은 적절한 방출 필터및 이색 거울을 가진 이미지 분할 장치를 사용하여 파장에 의해 분리된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 심장 무게, 속도 및 유량 측정. (a)연구에 사용된 각 새끼 돼지에 대한 체중 대 체중 비율(n=18). (B)제세동 후 ~10분 간 측정한 후, 연구 종료 후 다시 (약 1시간). (C)관상 동맥 유량은 산소 수요 감소로 인해 기계적 결합기 (+BDM)로 관류 후 급격히 떨어집니다. 배율 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다.

figure-results-3
그림 3: 부비동 리듬 동안 또는 외부 진도에 반응하여 수집된 리드 II 심전도 기록의 대표적인 예. (A)정상 부비동 리듬. (B)이미징 실험에 사용된 400 ms(S1−S1)의 사이클 길이에서 에피카디얼 간격의 예. (C)상단: 심방 진행속도는 WBCL을 식별한다; 성공적인 캡처는 S1 = 250 ms에서 관찰되며 심실 전도에 대한 심방이 관찰됩니다. 심방 진도는 SNRT(외부 진도를 입력한 후 부비동 노드 방전 시간)를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 바닥: S1 사이클 길이가 205ms로 감소함에 따라 심실전도가 실패합니다. (D)상단: 에피카디얼 간격(S1−S2)을 식별하여 VERP를 식별합니다. 성공적인 캡처는 S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Bottom에서 관찰됩니다 : S2 주기 길이가 250 ms로 감소함에 따라 심실 조직이 캡처되지 않습니다. (E)심방 진도 (S1−S2) AVNERP를 식별합니다. 위: 성공적인 캡처는 S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. Bottom: S2 사이클 길이가 199 ms로 감소함에 따라 심실전도가 실패합니다. 파란색 화살표는 속도 스파이크를 나타내거나 빨간색 화살표는 캡처('C') 또는 캡처 없음('NC')을 나타냅니다. S1-S1 = 동적 간격, S1-S2 = 외신 간격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 부비동 리듬 및 심실 세동 중 광학 데이터. 왼쪽: 염료로드 돼지 심장의 대표적인 이미지 (Vm = 전압, RH237; Ca = 칼슘, Rhod2), 전방 보기. 부비동 리듬 동안 돼지 심장에서 공간적으로 걸러진 막 간 전압 및 세포내 칼슘 형광 신호(중앙). 심실 세동 중 전압 및 칼슘 신호(오른쪽). 신호 영역 크기(15 x 15픽셀 = 2.4 x 2.4mm2,30 x 30 = 4.8 x 4.8mm2 커널 크기)는 빨간색과 파란색 사각형으로 표시됩니다. 단위 = ΔF/F. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 랑엔도르프가 주입한 돼지 하트의 광학 데이터. 처리되지 않은 공간적으로 여과된(A)막 횡단 전압 및(B)세포내 칼슘 형광 신호는 정점에 전기적 진도 동안 우측 및 좌심실에서 신호한다. 필터링되지 않은 공간 평균 신호는 관심 영역의 광학 동작 전위 및 칼슘 과도 현상을 나타냅니다(신호 단위는 ΔF/F). (C)정규화된 과도의 오버레이는 동작 전위-칼슘 과도 커플링 시간(75Hz에서 필터링된 로우 패스)을 나타낸다. (D)주현부 표면을 가로질러 신호 처리는 활성화 시간(tact)및 80% 재분극 시간을 포함하는 시간파라미터의 등소크로날 맵을 생성한다. (e)통계 분석(오른쪽)을 사용하여 다중 주파수에서 생성된 전기 및 칼슘 과도 복원 곡선(오른쪽)을 통해 느린 속도 주기 길이에서 더 긴 재분극 시간을 보여줍니다. 배율 늘이기 막대 = 평균 ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

화학수식분자량g /L
염화나트륨Nacl58.445.26
글루코네이트 나트륨C6H11NaO7 218.145.02
아세테이트 트리하이드레이트 나트륨C2H3NaO2•3H2O136.083.68
염화칼륨KCl74.550.63
염화마그네슘 (무수)MgCl2 95.210.1405
8.4% 중탄산나트륨나코3 84.0113
만놀톨C6H14O6 182.1716.3
황산 마그네슘MgSO4 120.374
Ph7.4
삼투압 (모스몰/L)294

표 1: 수정된 델 니도의 심전도 레시피.

토론

심혈관 연구 모델은 세포에서 생체 내 제제에 이르기까지 다양하지만 임상 관련성과 실험 적 유용성 사이에는 내재된 절충안이 있습니다. 이 스펙트럼에, 고립 된 Langendorff-perfused 심장 심장 생리학 공부에 대 한 유용한 타협 남아48. 전체 심장 모델은 단일 세포 또는 조직 단층보다 더 높은 수준의 기능적 및 구조적 통합을 나타내지만 생체 내 모델과 관련된 혼란스러운 복잡성을 방지합니다. 이중 광학 매핑 실험 중 주요 장점은 분리된 심장의 후피나표면이 관찰될 수 있고, 막 전위와 칼슘 처리의 형광 이미징이 심장 생리학을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것이다34.

설치류 모델은 관련된 모든 요소(예: 용액 부피, 관류 회로, 염료 및 기계적 비커플러 수량)를 업사이징하는 관련 비용으로 인해 더 큰 동물과 는 반대로 고립된 심장 제제에 가장 일반적으로 사용됩니다. 큰 동물10,36,49에서부정맥에 대한 더 큰 불안정성과 성향과 함께. 돼지 하트를 사용하는 한 가지 장점은 구조, 크기 및 수축 속도에 있어 인간의 심장과 밀접하게 유사하므로 관상 동맥 혈류 및 심장 출력과 같은 혈역학적 매개 변수를 보다 정확하게 모델링한다는 것입니다. 마찬가지로, 인간과 돼지는 유사한 칼슘 처리, 심전도 간격37,및12,50,51을나타내는 기본 채널을 포함하는 행동 잠재적 인 형태를 가지고있습니다. 52. 이 프로토콜은 심근 기능을 포괄적으로 특성화하기 위해 재현 가능한 대형 동물 모델을 만드는 단계를 자세히 설명합니다. 확립된 전기 생리학적 프로토콜과 함께 사용되는 막외 전압(RH237)과 세포내 칼슘(Rhod2)의 동시 이미징은 심장 의 변화된 메커니즘을 정확히 파악할 수 있는 기회를 제공합니다. 함수. 기재된 방법론은 전임상 안전성 시험, 독성 학적 스크리닝 및 유전 적 또는 기타 질병 병리의 조사에 사용될 수 있다. 더욱이, 기재된 방법론은 특정 연구포커스53,54,55에따라 다른 심장 모델(예를 들어, 개, 인간)과 함께 사용하기 위해 수정 및 적응될 수 있다.

작은 설치류 모델에서 고립된 전체 심장 준비를 위한 더 큰 돼지 모델로 전환할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 수정 사항이 있습니다. 준비 및 설정 하는 동안, 우리는 온 코 압력을 유지 하 고 부 종 (플러스 안티 폼, 필요한 경우)56,57,58,59를줄이기 위해 향수에 알부민을 추가 하는 것이 좋습니다. 더욱이, 알부민을 함유하는 향수는 또한 매체60,61에지방산 보충을 요구하는 대사 연구에 도움을 주어 도포할 수 있다. 설치류 심장과 는 달리, 더 큰 돼지 심장은 더 나은 온도를 유지하는 관상 동맥 혈관을 통해 흐르는 온난화 매체의 증가 된 부피와 부피의 작은 표면으로 인해 따뜻한 매체에 잠길 필요가 없습니다. 앞서 언급했듯이, 우리는 우심실 내부와 우심실과 좌심실의 후두면 에피나얼 표면에 온도 프로브를 배치하여 연구 기간 동안 세 위치에서 1-2 °C의 약간의 온도 변동만 관찰했습니다. 중요한 것은, 이러한 빠른 유량은 또한 거품과 잠재적 인 색전증의 가능성을 증가시킬 수있다. 이 문제를 우회하려면 대동맥 캐뉼라로 곧장 이어지는 대형 보어 튜브가있는 버블 트랩을 사용하는 것이 좋습니다. 유사 하 게, 우리는 더 큰에 대류를 캐뉼을 위해 함께 작업 하는 두 개인을 가장 유용 발견 (그리고 무거운) 심장; 한 사람은 튼튼한 지혈대와 대류를 열고 다른 하나는 탯줄 테이프를 사용하여 카눌라에 대류를 고정합니다. 설명된 방법론에서, 우리는 심전도 및 제세동을 가진 관류가 설치류 심혼 준비에 반대되는 심장 회복에 생명이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리의 경험에서, 단지 몇 절제된 마음은 심장 전환없이 정상적인 부비동 구동 활동을 재개.

광학 화상 진찰 끝점을 향상시키기 위하여는, 매달려 심혼 준비는 침수한 심혼으로 생길 수 있는 눈부심의 효력을 제한했습니다. 더욱이, 매달려 있는 심혼은 또한 수직 화상 진찰을 위해 수평으로 심혼을 놓을 때 생길 수 있는 심혼의 후방 양상에 관상 동맥 혈관의 어떤 압축 또는 타협든지 피합니다. 우리는 또한 버블 트랩 (대동맥 캐뉼라에 가까운) 후에 형광 염료를 적재하는 것이 조직 염색 및 광학 신호를 크게 향상시켰습니다. 마지막으로, 심장 전기 생리학 종점을 개선하기 위해, 더 큰 동축 자극 전극의 사용은 성공적인 심방 진행을 촉진. 우리는 다양한 EP 매개 변수에 대한 캡처 및 캡처 손실을 식별하기 위해 심전도의 사용을 설명하지만, 심장 내 카테터 또는 양극성 기록 전극도 사용할 수 있습니다.

우리의 연구 결과는 고립된, 온전한 돼지 심혼 모형에 있는 이중 광학 매핑 및 심장 전기 생리학 평가를 위한 방법론을 개발에 집중되었습니다. 청소년 인간의 심장과 유사성으로 인해 돼지 심장은 소아 심장학 또는 선천성 심장 결함에 초점을 맞춘 연구를위한 인기있는 모델로 남아 있습니다. 중요한 것은, 설명된 접근법은 더 큰 크기의 성인 하트 및/또는 관심의 다른 종과 함께 사용하도록 적응될 수 있다. 실제로, 다른 실험실은 개 또는 인간의 마음 (기증자 또는 병든)의 사용이 그들의 특정 연구 초점53,54,55에더 적용 가능하다는 것을 발견 할 수있다. 이 연구의 또 다른 잠재적 인 제한은 이미징 중에 운동 아티팩트를 줄이기 위해 기계적 비커플러를 사용하는 것입니다. Blebbistatin은 심전도 매개 변수, 활성화 및 내화 기간41,62,63에대한 최소한의 효과로 인해 심장 이미징 응용 분야에서 선택의 비커플러가되었습니다. BDM은 더 많은 양의 이과 및 기계적 비커플러를 필요로 하는 대규모 동물 연구에서 특히 중요할 수 있는 덜 비싼 선택이지만, 작용 잠재력을 바꿀 수 있는 칼륨과 칼슘 전류에 더 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 형태64,65,66,67. BDM을 사용하는 경우 APD 단축은 충격 유발 아린스미아스68에대한 심장 취약성을 증가시킨다는 점에 유의하십시오. 반대로, blebbistatin을 사용하는 주요 제한은 광과민성 및 광독성이지만 이러한 효과를 감소시킨 대체 제형은69,70,71입니다. 마지막으로, 설명된 방법론은 이중 광학 매핑 실험을 위해 단일 카메라 시스템을 활용하지만 심실 세동 및/또는 상피 표면에서 전기파 추적에 초점을 맞춘 연구 결과에 유의해야 합니다. 다른 사람에 의해 설명 된 대로 3 차원 파노라마 이미징을 포함 하기 위해이 접근 방식을 수정 해야15,19,72,73,74, 75 .

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자들은 매튜 케이 박사에게 유용한 실험지도를, 마넬 라마단과 무하이민 차우두리가 기술 지원을 해주신 것을 감사하게 도모합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (NGP에 R01HL139472, R01 HL139712 NI에), 어린이 연구소, 어린이 국립 심장 연구소와 소아 외과 혁신을위한 셰이크 자이드 연구소.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(-)-블레비스타틴시그마-알드리치B0560-5MG기계식 언커플러
2,3-부탄디온 모노심(BDM)시그마-알드리치B0753-100G기계식 언커플러
알부민시그마-알드리치, 세인트루이스, MOA9418
아날로그 신호 인터페이스emka Technologiesitf16USB
소포제시그마-알드리치A5758-250ML
소포제 Y-30 에멀젼Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA5758
대동맥 캐뉼라, 5/16"Cole-Parmer45509-60
버블 트랩Sigma-AldrichCLS430641U-100EA
CaCl2Fisher Scientific, Fair Lawn, NJC77-500
카메라, sCMOSAndor TechnologyZyla 4.2 PLUS
동축 자극 전극(심방)Harvard Apparatus73-0219
제세동기ZollM 시리즈
이색성 미러크로마 기술T660lpxrxt-UF2
차동 증폭기워너 인스트루먼트DP-304A
방출 필터, 칼슘크로마 기술ET585/40m
방출 필터, 전압크로마 기술ET710lp
EP 자극기(블룸)Fisher MedicalDTU-215B
여기 필터Chroma TechnologyCT510/60bp
여기 조명ThorlabsSOLIS-525C
필터McMaster-Carr8147K52
필터 카트리지, 폴리프로필렌PentairPD-5-934
필터 하우징McMaster-Carr9979T21
유량 변환기TransonicME6PXN
포도Sigma-Aldrich, St. Louis, MO158968
가열 코일Radnoti158821
HemofilterHemocorHPH 400
Hemostatic ForcepsWorld Precision Instruments501326
Image SplitterCairn ResearchOptoSplit II
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MOP3911
KH2PO4Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ423-316
대형 보어 튜빙, ID 3/8"Fisher Scientific14-169-7H
렌즈 50mm, 0.95 f-stopNavitarDO-5095
MetamorphMolecular DevicesImage Alignment
MgSO4Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM-7506
Mucasol 세제Sigma-AldrichZ637181-2L
Na PyruvateSigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리P2256
NaClSigma-Aldrich, 세인트루이스, MOS-3014
NaHCO3Fisher Scientific, Fair Lawn, NJS-233
바늘 전극 29G, 2mmAD Instruments Inc.
소음 제거기Quest ScientificHumbug
관류 펌프PolyStanA/S 1481
압력 변환기World Precision InstrumentsBLPR2
Reservoir, 2 LCole-ParmerUX-34541-07
RH237AAT Bioquest Inc.21480
Rhod2-AMAAT 바이오퀘스트 Inc.21062
자극 전극 (심실)Harvard Apparatus73-0160
외과 봉합McKesson 의료 외과890186
변환기 증폭기세계 정밀 기기TBM4M
튜빙 플로우 콘솔천음속TS410
배꼽 테이프JorvetJ0025UA
수조/순환기VWR89400-970
Surgical Tools
Bandage shearsHarvard Apparatus72-8448Lister 붕대 가위, 각진, 무딘/둔기, 42.0 mm 블레이드 길이, 17.0 cm
전기소작Dalwha Corp. Ltd.BA2ALD001모델: 200 기본
지혈RobozRS-7476St Vincent 튜브 오클루딩 펜치
하버드 장치72-8960Hartmann 지혈 집게, 곡선형, 톱니 모양 2.2 mm 팁 너비, 9.5 cm
지혈장치 Harvard 장치72-8985Halstead-Mosquito 지혈 집게 곡선형, 톱니형, 2 mm 팁 14 cm
메이요 가위WPI50174914.5 cm, 직선
Metzenbaum 가위WPI50174711.5 cm, 직선
모기 집게Harvard Apparatus72-8980Halstead-Mosquito 지혈 집게 직선, 매끄러운, 2mm 팁 너비 12cm
바늘 홀더Harvard Apparatus72-8828Webster 바늘 홀더, 직선, 매끄러운, 13.0cm 전체 길이 소
아용 십자가 클램프RobozRS-7660Cooley-Derra 클램프 6.25" 5mm 교정
직각 집게WPI501240베이비 믹스터 지혈 집게, 14cm, 직각
메스Ted Pella549-4메스 손잡이 No. 4, 13.7cm 스테인리스 스틸 및 10 No. 22 블레이드
가위Harvard Apparatus72-8380작동 가위, 스트레이트, 무딘/둔기, 42mm 블레이드, 12cm
스트레이트 톱니 모양의 집게WPI500363드레싱 집게 15.5cm
수건 클램프WPI501700백하우스 수건 클램프, 13cm, 곡선, 잠금 핸들, SS
Weitlaner 견인WPI501314Weitlaner 견인기, 자체 유지, 10.2cm, 2x 3 날카로운 갈래
<강한>일회용
3-0 프롤렌 봉합사다양한공급 업체 다양한 공급
업체 선박 루프아스펜 수술011001PBXSterion® 혈관 루프, 0.8 mm x 406 mm
심정지 (플레지솔)화이자00409-7969-05플레지솔; 세인트 토마스 결정질 심정지 용액 20mL/kg
헤파린다양한공급업체300 U/kg
주사기 및 바늘다양한공급업체 다양한 공급업체각각 60mL 및 18G
배꼽 테이프EthiconU12T
당 MLA1204사 기

참고문헌

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166(2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115(2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5 (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671(2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60 (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30(2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92 (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89 (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291 (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217(2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11 (1), 39(2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95 (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68 (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205(2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (2), 28(2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88 (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122 (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595 (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127001(2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596 (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730(2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8 (6), 66658(2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25 (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. , 651380(2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (4), 30(2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), 006692(2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79 (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104 (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87 (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254 (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241 (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13 (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27 (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74 (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320 (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44 (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6 (1), 26141(2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47 (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12 (4), 44019(2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8 (1), 2921(2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51 (7), 1219-1229 (2004).

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