세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
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이 논문에서
요약
초록
세포내 박테리아는 박테리아의 이익을 위해 숙주 단백질 및/또는 관련 생물학적 경로를 전복시키는 역할을 하는 숙주 시토솔로 이펙터 단백질이라고 불리는 독성 인자를 분비합니다. 세균 게놈 시퀀싱의 발전과 분비 후보및/또는 진핵을 코딩하는 유전자의 실리코 식별을 허용하는 알고리즘의 출현으로 인해 가용세균 이펙터 단백질의 식별이 더욱 관리가 용이해졌습니다. 도메인. 그러나, 이러한 중요한 독성 요인의 식별은 초기 단계에 불과합니다. 당연히, 목표는 이펙터 단백질의 분자 기능을 결정하고 호스트와 상호 작용하는 방법을 밝히는 것입니다. 최근 몇 년 동안, 질량 분석과 결합된 효모 2 하이브리드 스크린 및 대규모 면역 침전과 같은 기술은 단백질 단백질 상호 작용의 확인에 원조되었습니다. 숙주 결합 파트너의 식별이 세균 효과 단백질의 분자 기능을 해명하는 중요한 첫 번째 단계이지만, 때로는 숙주 단백질이 여러 생물학적 기능 (예를 들어, 액틴, 클라트린, 튜불린) 또는 세균성 단백질은 호스트 단백질을 물리적으로 묶지 않을 수 있습니다, 조작되는 정확한 호스트 통로에 관하여 중요한 정보의 연구원을 박탈하. 서프레서 스크린과 결합된 변형된 효모 독성 스크린은 세균 효과 단백질에 의해 영향을 받는 숙주 경로를 식별하도록 조정되었습니다. 독성 스크린은 종종 성장 결함으로 명시되는 숙주 생물학적 경로를 방해하는 이펙터 단백질에 의한 효모의 독성 효과에 의존한다. 효모 게놈 라이브러리의 발현은 세균 이펙터 단백질의 독성을 억제하는 숙주 인자를 식별하고 따라서 이펙터 단백질이 표적으로 하는 경로내의 단백질을 식별하는 데 사용된다. 이 프로토콜에는 독성 및 억제기 스크린에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 이러한 기술은 효모 및 대장균의분자 복제 및 재배가 가능한 모든 실험실에서 수행 될 수 있습니다.
서론
여기에 제시된 것과 유사한 절차의 첫번째 보고는 레지오넬라 성 균 타입 IV 이펙터 SidD, Rab11을수정하는 deAMPylase를 특징으로 합니다. 유사한 기술은 여러 L. 폐렴 구이펙터 1,2,3의특성화에 사용되었다. 상기 분석법은 콕시엘라 버네티형 IV 이펙터 단백질4를특성화하도록 적용되었으며, 최근에는 클라미디아 트라코마티스 함유 막 단백질의 특성화를 위해 이 기술의 유용성이 확대되었다5 .
이 프로토콜은 두 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다: 1) 효모 독성 스크린, 관심 있는 세균 효과 단백질은 효모에서 발현 되고 클론은 성장 결함에 의해 입증된 바와 같이 독성 표현형을 위해 스크리핑되고, 2) 효모 억제기 스크린 , 독성 표현형이 독성 균주에서 효모 게놈 라이브러리의 발현에 의해 억제되는 경우. 따라서, 독성 화는 관심 있는 세균 효과제가 과발현될 때 성장 결함으로 나....
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프로토콜
1. 매체 및 시약의 준비
참고 : 플레이트는 분석의 날 전에 준비해야하며 1 개월 동안 좋습니다. 미디어 및 시약은 언제든지 만들 수 있으며 1 개월 동안 좋습니다.
- 1, 000 mL 비커에 증류수 800 mL에서 D-(+)-포도당 100 g을 용해시킴으로써 포도당 용액 1L(10% w/v)을 준비합니다. 증류수로 부피를 1L로 조정합니다. 0.2 μm 멸균 필터를 통해 멸균 된 1 L 미디어 저장 병에 걸하십시오.
- 1L 비커에 증류수 800 mL에 100 g의 D-(+)-갈락토스를 용해시켜 갈락토제 용액 1L(10% w/v)을 준비합니다. 증류수를 사용하여 부피를 1mL로 조정하고 0.2 μm 멸균 필터를 통해 멸균 된 1,000 mL 미디어 저장 병에 필터를 적용하십시오.
- 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 한천 1L를 효모 추출물 10g, 펩톤 20 g, 포도당 20g, 한천 20g을 증류수 1,000 mL에 녹여 준비합니다. 오토클레이브를 20분간 식히고 56°C의 수조에서 식힙니다. 접시 당 ~ 20mL의 매체를 사용하여 100mm 플레이트에 붓습니다.
- 효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 포도당 20g을 증류수 1,000 mL에 녹여 YPD 국물
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결과
실제 효모 억제기 스크린을 수행하기 전에 관심 있는 이펙터 단백질이 효모의 독성을 테스트해야 합니다. 이것은 갈락토 유도성 프로모터의 통제 하에 효모에 관심 있는 단백질을 발현함으로써 달성된다. 포도당(noninducing conditions)에 대한 성장은 먼저 독성이 특히 관심 단백질의 발현에 기인하고 일반적인 결함이 아님을 보장하기 위해 비교되어야 한다. 그림 3에나타난 바와 같이, 독성은 더 작은 콜로니 및/또는 감소된 성장으로 나타난다. 효모 성장의 2-3 로그 감소는 효모 억제제 스크린에 이상적입니다.
도 4에도시된 바와 같이, 독성 및 억제기 스크린은 프로토콜 섹션에 기재된 방법을 사용하여 8단계로 달성될 수 있다. 관심있는 유전자는 적합한 벡터1로복제되고, 생성 된 구성은 독성을 평가하기 위해 효모로 변환됩니다. 본 .......
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토론
이 프로토콜은 변형된 효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 기 단백질에 의해 표적으로 하는 호스트 생물학 통로를 확인하기 위한 단계별 절차를 설명합니다. 사용되는 효모 균주, S. 세레비시아 W303은 우라실과 류신 모두에 대한 보조 영양입니다. 유라실 보조축은 류신 보조증이 효모 게놈 라이브러리 벡터 pYep13을 선택하기 위해 사용되는 동안 류신 보조증이 사용되는 동안 pYesNTA-Kan 벡터상에서 관심 있는 단백질을 운반하는 효모를 선택하는 데 사용된다. 효모 게놈 라이브러리 플라스미드는 3-13 ORFs를 운반하므로 각 ORF는 p415-ADH 벡터6 또는 이와 유사한 벡터로 개별적으로 복제하고 독성 효모로 재형질하여 진정한 억제자인 것을 식별해야 합니다. 숙주 생물학적 경로를 나타내는 몇몇 억제기를 식별하는 것이 일반적이다. 서프레서들은 때때로 관심 있는 세균성 단백질의 직접적인 결합 파트너가 될 수 있지만, 항상 그런 것은 아니다.
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공개 사항
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이러한 기술에 도움을 준 셸비 앤더슨, 애비 맥컬로프, 로렐 우즈에게 감사드립니다. 이 연구는 메리 M. 웨버에 미생물학 및 면역학의 아이오와 대학에서 시작 자금에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet 겔 추출 키트 | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR 정제 키트 | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet 플라스미드 miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| 포도 | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| 청어 정자 DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| 리튬 아세테이트 이수화물 | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| 펩톤 | 피셔 사이언티픽 | ||
| Phusion 고충실도 DNA 중합효소 | New England Biolabs | M0530 | |
| 폴리(에틸렌 글리콜) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202S | |
| 트립토판 | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| 효모 추출물 | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| 효모 miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| 효모 질소 염기(아미노산 제외) | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 | MilliporeSigma | Y1501-20G | (우라실 제외 |
| 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 | MilliporeSigma | Y1771-20G | 제외 우라실, 류신, 트립토판 |
참고문헌
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin poly....
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재인쇄 및 허가
