높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수에서 발견되는 유체로서 기초 과학과 임상 과학 모두에 매우 중요합니다. CSF 단백질 조성물의 분석은 신경 질환뿐만 아니라 기초 신경 과학 연구에서 중요한 정보를 제공합니다. 한 가지 주의해야 할 점은 CSF에서 측정된 단백질은 혈청에서 의한 경막 합성 및 과장 둘 다에서 파생될 수 있으며, CSF의 단백질 분석은 이 두 성분의 합만을 결정할 수 있다는 것입니다. 인간뿐만 아니라 동물 모델에서 단백질 과 단백질 을 생산한 단백질을 구별하기 위해, CSF 단백질 프로파일링 측정은 기존의 단백질 분석 도구를 사용하여 알부민 CSF/혈청 지수(Q알부민),혈액-뇌 인터페이스(BBI) 및 단백질 지수(Q 단백질/Q알부민)의 무결성의 마커인 단백질 의 계산을 포함해야 한다. 이 프로토콜은 CSF 및 혈액 수집에서 지수 및 지수 계산에 이르기까지 신경 장애의 마우스 모델에서 의 단백질 합성 및 BBI 손상의 정량적 측정에 대한 전체 절차를 보여줍니다.
서론
뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수를 둘러싼 맑고 무색의 액체로 임상적이고 기본적인 과학적 중요성을 지니고 있습니다. CSF는 중추 신경계 (CNS)의 전해 환경을 보존하고, 전신 산 염기 상태의 균형을 맞추고, 신경 세포 및 신경 교세포 세포에 영양분을 공급하고, CNS를 위한 림프계로서의 기능을 공급하고, 호르몬, 신경 전달 물질, 사이토카인 및 기타 신경 펩타이드를 CNS1전반에 걸쳐 수송합니다. 따라서, CSF 조성물은 CNS의 활성을 반영함에 따라, 이 유체는 CNS의 생리적 및 병리학적 상태를 특성화하기 위해 간접적이지만 귀중한 접근을 제공한다.
CSF는 백 년 이상 동안 CNS에 영향을 미치는 조건을 진단하기 위하여 이용되었습니다, 그리고 이 시간의 대부분을 위해, 진단 공구로 임상의에 의해 1 차적으로 공부되었습니다. 그러나, 최근 몇 년 동안 신경 생물학자는 CNS의 병리생리학을 공부하기위한 CSF의 잠재력을 인식했습니다. 특히, 신경과학 분야에서 는 여러 고처리량 단백질 분석 도구가 도입되어 CSF의 단백질 조성에 대한 상세한 연구를 가능하게 되었으며, 이러한 분석이 동적 변화에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있다는 기대를 가지고 있습니다. CNS 내에서 발생합니다.
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프로토콜
모든 동물 작업은 다트머스의 가이젤 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인 된 프로토콜을 활용합니다.
1. 유체의 컬렉션
참고: 세럼과 CSF가 모두 필요합니다. 생존과 부검을 위해 각 유체 수집에 대한 두 개의 프로토콜이 필요합니다.
- 생존 절차를 이용한 세럼 및 CSF 수집
참고: 생존 유체 수집의 경우, 혈청 수집은 덜 침습적 인 절차이기 때문에 CSF 수집보다 선행되어야합니다. CSF는 혈청 추첨 후 1 주일 이내에 얻어야합니다.- 혈청 수집을위한 복고풍 궤도 출혈 절차.
참고 :이 절차는 마우스14의생존 출혈을위한 것입니다. 설명된 절차는 마우스의 모든 연령, 성별 및 균주에 적용됩니다. IACUC 규칙은 체중의 1 %의 최대 혈액 부피가 단일 혈액 무승부로 제거 될 수 있음을 규정하기 때문에, 절차는 15g 이상의 무게 마우스에서만 수행되는 것이 좋습니다.- 마우스가 포함된 케이지를 랙에서 적절한 작업 영역으로 이동합니다. 산소 유량계를 1L/min으로 켜서 마취 가스 기계를 준비합니다.
- 동물을 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 ....
- 혈청 수집을위한 복고풍 궤도 출혈 절차.
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결과
이 대표적인 실험은 다발성 경화증(MS)의 두 가지 임상적으로 관련된 설치류 모델에서 IgG의 경내 합성을 비교하기 위한 것이었다: PLP139-151-유도된재발 실험적 자가면역 뇌척수염(R-EAE) 및 만성 진행성, 테일러의 뮤린 뇌척수염 바이러스 유도 데미엘린 질환.. R-EAE는 재발-송금 MS를 이해하는 데 유용한 모델이지만 TMEV-IDD 모델은 만성 프로그레시브 MS19를특징으로 합니다.
본 연구에서는 R-EAE(n=12) 및 TMEV-IDD(n=28)에서의 경막 내 IgG 합성의 정량적 분석이 수행되었다. 두 그룹 모두 질병의 절정에 분석되었다. 10개의 마우스의 추가 그룹은 샴 처리되었고 연령일치 대조군(cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD sham n=6)으로 제공되었다.
시판되는키트(표)를이용한 마그네틱 비드 계 접.......
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토론
증가된 CSF 단백질 농도의 평가를 위한 정량적 방법은 CNS의 생리적 및 병리학적 상태의 특성화에 유용한 도구이다. 그러나, CSF 단백질 수준의 신뢰할 수 있는 정량화를 넘어, CSF 단백질의 검출은 CSF에서 혈액과 CNS 유래 분획을 구별하는 결과의 발현을 필요로 한다. 그러나, 현재까지, 일반적으로 사용되는 단백질 정량 화 분석제는 높은 처리량 공구의 도움으로조차, 2개의 단백질 분대 사이 차별을 허용하지 않습니다. 따라서, CNS 구획 내에서 합성된 단백질과 혈액으로부터 유래된 단백질을 구별하기 위해 단백질 측정에 대한 특이적 교정이 제안되었다. 이러한 교정은 혈청 농도와 장벽 무결성 모두에서 개별적인 가변성을 보상합니다. 전반적으로, 이러한 교정은 CSF/혈청 지수(Q단백질)의계산을 기반으로 하며, 이는 혈청 단백질의 개별 농도의 차이로 인한 변동성을 감소시킵니다. 배리어 기능에서의 개별적인 차이와 관련된 Q단백질의 변이는 CsF/혈청 알부민 지수(Q알부민)에
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 비교 의학 및 연구 센터의 직원에게 감사 (CCMR) 이러한 연구에 사용되는 마우스의 그들의 전문가 치료에 대한 다트머스에서. 보른스타인 연구 기금은 이 연구에 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1mL 인슐린 주사기 | BD | 329650 | |
| 1mL 주사기 | BD | 329622 | |
| 25 게이지 바늘 | BD | 305122 | |
| 3 mL 주사기 | BD | 309582 | |
| 30 게이지 인슐린 바늘 | BD | 305106 | |
| 흡수 패드 | 적합한 브랜드 | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex 휴대용 자기 세척기 | BioRad | 171020100 | 자석 |
| BioPlex MAGPIX 멀티플렉스 리더 | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated 검출 항체 | 적절한 출처 | 항체는 다음 종에 대해 지시되어야 합니다. 관심 단백질. | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 부프레노르핀 염산염 | PAR 제약 | NDC 42023-179-05 | |
| 모세관 | 셔터 기기 | B100-75-10 | OD: 1.0mm, ID: 0.75mm 붕규산 유리 10cm; ID를 더 작게 만들기 위해 분젠 위로 그려졌습니다. |
| 원심분리기 튜브, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| 원심분리기 튜브, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| 원심분리기 튜브, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| 클로르헥시딘 디아세테이 | Nolvasan | E004272 | |
| 일회용 피펫 팁 | 적합한 브랜드 | ||
| 이어바 | KOPF Instruments | 1921 또는 1922 | |
| 에탄올 | Kopter | V1001 | |
| 냉동고 | VWR | VWR32086A | |
| 거즈 | Medline | NON25212 | |
| 가열 패드 | Sunbeam | XL 킹 사이즈 SoftTouch, 자동 꺼짐으로 4 가지 열 설정, 청록색, 12 인치 x 24 인치 | |
| 유도 챔버 | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| 케타민(KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex 마이크로스피어(항체 결합) | BioRad | 항체 결합 마그네틱 비드 | |
| 마이크로플레이트 쉐이커 | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| 마이크로리트랙터 | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP 마우스 면역글로불린 이소타이징 마그네틱 비드 패널 | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | 마우스 체액의 면역글로불린 이소형체 패널 및 하위 분류의 Luminex를 통한 정량화를 위한 상용 키트. |
| 마우스 알부민 캡처 ELISA 키트 | Novus Biological | NBP2-60484 | 마우스 유체에서 알부민의 ELISA를 통한 정량화를 위한 상용 키트. |
| 멀티채널 피펫 | Eppendorf | 3125000060 | |
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| 산소 | AIRGAS | OX USPEA | |
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| PDS 봉합사, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 리버스 커팅, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| 피펫 | Eppendorf | Research 시리즈 | |
| 폴리에틸렌 튜빙 | |||
| 냉장 원심분리기 | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| 스케일 | Uline | H2716 | |
| 메스 | 깃털 | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| 표준 단백질 | 적합한 공급원 | 참조 표준물질에 대한 최선의 선택은 관심 단백질의 정제되고 알려진 농도입니다. | |
| 입체 요법 기기 | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| 멸균 식염수 | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % 염화나트륨 관개 USP |
| 수술 겸자 곡선, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | 스테인레스 25x |
| 기화기 + 유량계 | Moduflex 무헤스테시아 기기 | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| 온난화 패드 | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| 수음파기 | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
참고문헌
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M.
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