방법 논문

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

DOI:

10.3791/60503

⸱

2019년 12월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

초록

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레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이질적인 조직에서 특정 세포 모형 또는 관심 있는 지구를 격리하는 강력한 공구입니다. 골격 원소의 세포 및 분자 복잡성은 발달과 함께 증가합니다. 조직 이질성, 같은 서로 또는 주변 조직과 연골 및 골변 요소의 계면에서, 연골과 뼈를 개발하는 연구에 하나의 장애물이다. 당사의 프로토콜은 유전자 발현 분석을 위해 고품질 RNA를 산출하는 연골과 뼈의 조직 처리 및 격리의 신속한 방법을 제공합니다. 마우스 배아의 신선한 냉동 조직은 단면화되고 짧은 크레실 바이올렛 염색은 주변 조직과 구별되는 색상으로 연골과 뼈를 시각화하는 데 사용됩니다. 슬라이드는 다음 빠르게 탈수, 연골과 뼈는 LCM에 의해 이후에 격리. 이 프로세스 동안 수성 솔루션에 대한 노출을 최소화하면 RNA 무결성이 유지됩니다. 마우스 메켈의 연골과 E16.5에서 하악골이 성공적으로 수집되었고 유전자 발현 분석은 조골세포, 골세포, 골세포 및 연골세포에 대한 마커 유전자의 차등 발현을 보여주었다. 고품질 RNA는 또한 다양한 조직 및 배아 시대로부터 분리되었다. 이 프로토콜은 냉동, 절제, 염색 및 탈수를 포함한 LCM에 대한 샘플 준비를 자세히 설명하며, LCM에 의한 연골과 뼈의 정밀한 분리는 전사분석을 위한 고품질 RNA를 생성합니다.

서론

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근골격계는 근육, 결합 조직, 힘줄, 인대, 연골 및 뼈로 구성된 다성분 시스템으로, 신경에 의해 심이도가 있고혈관에의해 혈관이 혈관에 의해 1. 골격 조직은 증가 세포 이질성 및 구조적 복잡성으로 개발. 연골과 뼈는 동일한 골연방울 감소기 계보에서 개발하고 매우 관련이 있습니다. 배아 연골과 뼈는 근육, 신경, 혈관 및 미분화 중간엽과 관련하여 발생합니다. 연골은 또한 뼈에 의해 포위 될 수있다, 이러한 Meckel의 연골과 하악골 내의 condylar 연골 등. 이 조직은 해부학적으로 연관되고 발달 도중 세포외 신호를 통해 서로 상호 작용합니다. 연골과 뼈의 발달에 있는 유전자 발현의 연구 결과에서, 1개의 장애물은 다중 조직 모형으로 구성된 골격 구조물의 이질성입니다. 관심 있는 특정 조직의 정밀한 분리는 성공적인 전사 분석을 위한 열쇠입니다.

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이기종 조직 내의 세포 유형 또는 관심 영역을 분리하는 강력한 도구이며 재현 가능하며 단일 세포 수준2에민감합니다. 전사학, 유전체학 및 프로테오믹스3,4에서광범위한 하류 검소에 대한 관심 있는 세포를 정밀하게 표적화하고 포획할 수 있다. 단리된 RNA, DNA, 또는 단백질의 질은 바이오분석기 또는 동등한 플랫폼으로 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 품질은 RNA 무결성 번호(RIN)5로표시됩니다.

여기에서, 우리는 신선한 냉동 조직에서 LCM에 의한 연골과 뼈의 신속한 염색 및 격리를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 배아를 사용하여 이 프로토콜이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 같은 후속 전사분석을 위해 고품질 RNA를 산출한다는 것을 입증합니다.

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프로토콜

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마우스에서 조직은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회에 따라 장악되고, 연구 프로토콜은 마운트 시나이에 있는 Icahn 의과 대학에 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 신선한 냉동 표본의 준비

  1. 관심 있는 배아 또는 조직을 해부합니다. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 일회용 임베딩 금형에 시료를 내장합니다. 팁이나 바늘로 시편의 방향을 조정합니다.
  2. 드라이 아이스/메틸-2-부탄 욕조에서 시료를 빠르게 동결시되십시오. 다음 단계로 계속 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 레이저 캡처 미세 해부를위한 냉동 절제

  1. 저온 유지를 해동하고 70 % 에탄올로 내부 표면을 청소하십시오. 롤 방지 플레이트와 한 쌍의 집게를 RNase 오염 제거제로 처리하십시오. 저온 온도를 원하는 절삭 온도(-18 ~ -22°C)로 설정합니다. 냉동 절제 중에 단면 된 샘플 슬라이드를 임시 보관하기 위해 드라이 아이스에 알루미늄 호일 시트를 놓고 건조 얼음으로 뚜껑이 달린 용기를 준비하십시오.
    주의 사항: 드라이 아이스는 매우 춥습니다. 항상 드라이 아이스를 조심스럽게 다루고 취급할 때마다 절연 장갑을 착용하십시오.
  2. 신선한 냉동 시편을 드라이 아이스 양동이로 옮김으로 옮김. OCT 화합물층을 저온저온시편 홀더에 놓고 즉시 부드러운 압력으로 OCT 위에 시편을 놓습니다. OCT가 완전히 동결되면 시편이 있는 홀더를 저온 극저온 절단 암에 고정합니다.
  3. 시료를 저온온도에 평형화하기 위해 15분 동안 저온상승에 둡니다.
  4. 조직을 단면화하고 12 μm의 두께로 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 멤브레인 슬라이드에 슬라이스를 수집한다. 멤브레인에 연속된 섹션을 정렬합니다. 한 번의 슬라이드가 완료되면, 섹션이 몇 분 동안 건조하고 필요한 모든 슬라이드가 수집 될 때까지 드라이 아이스 용기의 호일에 슬라이드를 전송할 수 있습니다.
  5. 슬라이드를 슬라이드 상자에 -80°C로 보관합니다.
    참고: 단면 두께는 조직의 효율적인 절단을 허용하면서 수집 된 조직의 양을 최대화하기 위해 선택되며, 관심있는 조직에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드를 RNase 오염으로부터 제거하십시오. 온도 변화를 피하십시오. 최대 6개월 동안 저장된 슬라이드의 RNA RIN은 여전히 RNA의 높은 품질을 나타낼 수 있지만 가능한 한 빨리 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다.

3. 레이저 포획 미세 해부를 위한 샘플 준비

  1. 염색 및 탈수에 대한 해결책을 준비하십시오.
    1. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브 3개각각에 80% 에탄올 45 mL를 놓습니다. #1, #2 및 #3 레이블을 지정합니다. RNase/DNase 자유물로 에탄올을 희석합니다.
    2. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브에 95% 에탄올 45 mL를 놓습니다.
    3. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브에 100% 에탄올 45 mL를 놓습니다.
    4. 실온에서 50 mL 원심 분리튜브에 자일렌 45 mL을 놓습니다.
      주의 사항: 자일렌은 연기 후드에 사용해야합니다.
  2. PEN 멤브레인 슬라이드를 장갑을 낀 손에 대고 잠시 해동한 다음, 50 mL 원심분리기 튜브에서 교반하여 80% 에탄올(#1 및 #2)의 45 mL에서 각각 30s씩 2회 세척하여 OCT를 제거합니다.
    참고: 염색 하기 전에 OCT를 제거 하는 것이 중요 하다, 섹션을 가리는 에서 염색 하는 동안 OCT 느슨한 방지. 집게는 교반에 의해 세척되지 않는 OCT의 제거를 용이하게하기 위해 사용될 수있다.
  3. 알루미늄 호일 한 장에 슬라이드를 놓습니다. 피펫 0.8 mL 0.8% 크레실 바이올50% 크레실 바이올을 슬라이드 상에 30초 동안 45 mL의 80% 에탄올(#3)으로 세척한 다음, 각각 30s에서 45mL의 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자실백에 대해 45mL로 탈수시한다.
  4. 자일렌과 건조한 부분을 배출하기 위해 5 분 동안 섬세한 작업 와이퍼에 슬라이드를 서십시오.
    참고: 슬라이드는 LCM 전에 완전히 건조되어야 합니다.

4. 레이저 캡처 미세 해부

참고: LCM을 수행하는 동안 분말 프리 니트릴 장갑을 착용하십시오.

  1. LCM 현미경, 레이저 및 컴퓨터를 켭니다. 컴퓨터에 로그온하고 소프트웨어를 시작합니다. 키를 "켜기" 위치로 돌려 레이저를 시동합니다. 녹색 표시등(레이저)이 켜져 있으면 빨간색 버튼을 눌러 레이저를 활성화한 다음 레이저를 사용할 준비가 되었음을 나타내는 표시등(레이저)이 빨간색으로 바뀝니다.
    참고: 레이저는 워밍업에 약 10분이 필요합니다.
  2. 수집 튜브를 설정합니다.
    1. 0.5 mL 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브의 캡을 컬렉터에 삽입합니다.
      참고: 원하는 PCR 튜브(0.2 또는 0.5mL)에 대한 일치 컬렉터를 선택합니다.
    2. 피펫 50 μL 추출 버퍼 (재료 표에나열된 RNA 절연 키트제공)를 0.5 mL 수집 튜브의 캡에 넣습니다.
    3. 수집 장치를 현미경에 삽입합니다.
    4. 장치 변경 창에서 참조점으로 이동 단추를 클릭하여 수집기를 RP(참조 점)로 이동합니다. 초점을 조정하여 RP를 명확하게 봅니다. 화살표를 클릭하여 RP를 뷰의 가운데로 이동합니다.
  3. 시편 슬라이드를 로드합니다.
    1. 도구 모음의 왼쪽 언로드 버튼을 클릭하여 슬라이드 홀더를 낮춥습니다.
    2. 슬라이드를 홀더에 넣고 티슈 섹션을 아래쪽을 향합니다.
      참고: 이 방향은 캡처 된 조직 섹션이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 빠지도록합니다.
    3. 홀더를 다시 스테이지에 삽입합니다.
  4. 레이저 파라미터를 설정합니다.
    1. 레이저 메뉴의 제어 옵션을 선택하거나 레이저 아이콘을 클릭합니다.
    2. 원하는대로 이러한 매개 변수를 조정 : 전원,레이저의 전력; 조리개,레이저의 폭; 및 속도, 그리기 및 절단 모드에서 절단의 속도.
      참고: 관심 있는 영역에서 레이저를 테스트합니다. 힘이 높거나 조리개가 커서 절단하기가 더 쉬워지지만 세포에 더 많은 손상을 입힙니다. 전력, 조리개 및 속도의 조합을 조정하여 조직의 효율적인 절단 및 손상을 최소화하십시오. 예를 들어, 12 μm 섹션의 연골 조직에 대한 전력 = 40, 조리개 = 5 및 속도 = 7.
  5. 관심 영역을 선택하고 잘라냅니다.
    1. 5x 목표로 시작하여 관심 영역을 찾은 다음 관심 영역을 가장 잘 보여주는 목표(5x, 10x 또는 40x)로 전환합니다.
      참고: 크레실 바이올렛 염색 후, 연골은 마젠타 염색되고 미네랄화 된 조직은 다른 조직과 구별 되는 갈색 또는 검은 색으로 나타납니다. 파일 메뉴에서 이미지 저장 메뉴를 사용하여 이미지를 저장할 수 있습니다.
    2. 컬렉터에서 마크를 클릭하여 컬렉션용 튜브(A, B, C, D)를 선택합니다.
    3. 이동 및 잘라내기 또는 그리기 및 잘라내기를 선택합니다. 이동 및 절단 모드에서는 마우스 또는 터치 스크린 펜을 사용하여 수동으로 표본을 잘라 모양을 자유롭게 그립니다. 그리기 및 잘라내기 모드에서는 후속 절단을 위해 마우스 또는 터치 스크린 펜으로 셰이프를 자유롭게 그릴 수 있습니다. 절단 시작 버튼을 클릭하여 레이저 절단을 시작합니다.
    4. 절단이 완료되면 PEN 멤브레인이있는 표적 조직이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 떨어집니다. 필요한 경우 4.5를 반복하여 여러 관심 영역을 풀합니다.
      참고: 조직이 불완전한 절단으로 인해 수집 튜브의 캡에 떨어지지 않는 경우 반복 컷 또는 증가 전원 또는 조리개가 필요할 수 있습니다. 미네랄화된 뼈(갈색 또는 검은색)는 레이저로 직접 절단할 수 없습니다.
  6. 수집기의 언로드를 조심스럽게 PCR 튜브를 닫습니다. 미세 해부 된 조직을 드라이 아이스에 놓습니다. 다음 단계로 계속 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 다음 샘플에 대해 4.2에서 4.6을 반복합니다.

5. 미세 해부 조직 및 RNA 분리의 Lysis

  1. 실온에서 미세 해부 된 조직을 해동하십시오. 원심분리기를 42°C에서 30분 동안 간략하게 배양한다.
  2. 배양 후, 0.5 mL PCR 튜브로 lysis 버퍼를 회전. 제조업체의 지침에 따라 RNA 절연 키트(재료 표참조)를 사용하여 DNase 처리 및 RNA 추출을 수행합니다.

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결과

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E16.5에서 신선한 냉동 마우스 조직의 코로나 섹션은 Meckel의 연골 (MC), condylar 연골 및 LCM에 의한 하악골의 격리 및 수집을 입증하는 데 사용되었습니다. E16.5에서 마우스 배아는 OCT 화합물을 가진 극저온 형에 해부되고 매립되었다. 금형의 시료를 드라이 아이스 및 메틸-2-부탄 배스에서 급속히 동결시키고 -80°C에서 보관하였다.

연골과 뼈의 크레실 바이올렛 염색을 입증하기 위해, 관상 평면에서 냉동 절편을 수행하고 현미경 슬라이드에 샘플을 수집하였다. 섹션은 위의 프로토콜에 따라 세척, 염색 및 탈수되었습니다(단계 3.2-3.4). 슬라이드는 공기 건조및 영구 장착 매체로 장착되었다. 조사된 모든 연골은 염색된 마젠타(MC, condylar 연골, 비강 중격 연골, 코스튬 연골, 프리페노이드 뼈의 연골 프리모르듐, 반경과 척골의 연골 프리모르디아)와 모든 미네랄화된 조직이 갈색 또는 검은색으로 염색되었다(도1<...

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토론

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LCM은 이질적인 조직에서 농축되거나 균질한 세포 집단의 분리를 가능하게 한다. 그 장점은 생체 내 컨텍스트에서 세포의 신속하고 정확한 캡처를 포함, 잠재적 인 단점은 시간이 소요되는 것을 포함, 비싼, 지정된 샘플 내에서 뚜렷한 하위 집단을 인식하는 사용자에 대한 필요성에 의해 제한30. 이 프로토콜은 마우스 배아 연골과 뼈의 LCM의 세부 사항을 제공, RNA-seq에 의해 후속 분석을 위한 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위한 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 여기에 사용되는 LCM 시스템이 광물화된 조직(예를 들어, 도 2C에서검은색하악조직)을 직접 절단할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 전체 뼈 영역을 해부 할 필요가있다. 특히, LCM에 의해 분리된 미세 제해골화 영역은 균질하지 않으며...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 치과 및 두개안면 연구의 국립 연구소 (R01DE022988)와 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (P01HD078233)에 의해 지원되었다. 저자는 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 라이카 LMD 6500 플랫폼에 액세스 할 생물 rerepository 및 병리학 코어 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메틸부탄ThermoFisher ScientificO3551-4
바이오분석기애질런트G2939BA
원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific339653원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 50mL
크레실 바이올렛 아세테이트Sigma-AldrichC5042
저온 유지 장치Leica BiosystemsCM3050 S
섬세한 작업 와이퍼ThermoFisher Scientific06-666
일회용 임베딩 몰ThermoFisher Scientific1220
Distilled waterInvitrogen10977-015DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818분자생물학 등급
유리 PEN 멤브레인 슬라이드Leica Microsystems11505158
LCM 시스템Leica MicrosystemsLeica LMD6500
현미경 커버 유리ThermoFisher Scientific12-545FP
현미경 슬라이드ThermoFisher Scientific12-550-15
OCT compoundElectron Microscopy Sciences102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mLAxygenPCR-05-CLCM 수집 튜브
영구 장착 매체Vector LaboratoriesH-5000
RNA 분리 키트ThermoFisher ScientificKIT0204
RNase 오염 제거제Sigma-AldrichR2020RNase 표면 청소용 오염 제거제
XyleneSigma-Aldrich214736
드

참고문헌

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