RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.
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방법 논문
인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출
이 논문에서
요약
초록
레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3' 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.
서론
안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.
ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 ....
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프로토콜
이 연구는 센터 병원 대학 Vaudois의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (CHUV).
1. HIV-1HXB2 균주를 가진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감염
-
1일차: PBMC 자극
- 건강한 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리합니다.
- 전체 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니크를 포함하는 1640 배지에서 1x106/ mL의 농도로 PBMC를 카운트하고 다시 일시 중단하십시오. illin/연쇄상 구균 (R-10), 인터류핀-2 (IL-2) 및 3 μg/mL 피토헤마글루티닌 (PHA)의 50 U/mL를 첨가합니다.
- 양세포를 6웰 플레이트 2개(셀 서스펜션/웰 3mL)로 위아래로 피펫을 분리합니다.
- 37°C 및 5%CO2에서3일 동안 배양한다.
-
3일차: PBMC 감염
참고: 1.1.3 단계에서와 같이 두 플레이트 중 하나를 음성 대조군으로 사용하십시오(이 세포를 감염시키지 마십시오).
주의: 생체 안전 수준 III 실험실....
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결과
생체 연화 cDNA의 친화도 정제에 결합 된 고온 RNA 변성은 체외 및 환자로부터 분리 된 CD4 + T 세포에서 감염된 PBMC에서 PCR 동안 비 특이적 ASP 제품의 증폭을 방지합니다. RT 셀프 프라이밍은 안티센스 RNAs10,14,15,16,17의역전사 중에 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을 방지하기 위해, 우리는 원래 Heist et al.10에의해 설명된 기술을 사용하여 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 절차는 RT 이전에 RNA의 고온 변성을 포함하고 RT를 수행하기 위해 생체 용 프라이머를 사용하고, 스트렙타비딘 코팅 자기 비드
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토론
이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 '끝에서 역 프라이머를 태그하는 것은 가닥 특이적 증폭6,8,9를달성하는 데 효과적임이 입증되었습니다. 그러나, 이 접근은 단지 비특이적인 DNA 제품의 증폭을 일으키는 원인이 되는 PCR 반응으로 새는 그것의 리스크와 함께 그것을 피하기 보다는 오히려 그것을 피하기 위하여 거짓 프라이밍 된 cDNA를 검출할 수 있게 합니다 (즉, ASP 대신 env).<.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 사이클 염기서열분석 키트 | , Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP 세트(100 mM) | 인비트로젠, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell 분리 키트 | Stemcell Technologies | 19052 | |
| 소태아, 혈청 | Biowest | S1010-500 | |
| 고정/투과화 솔루션 키트 | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV, Gag p24, 유세포 분석 항체 - Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi, Biotec | , 130-097-743 | |
| Phaseolus vulgaris(PHA)의 렉틴 | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| 고정성 황색 사세포 염색 키트, 405nm 여기용 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| 마우스 Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| 마우스 Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| 프라이머 및 프로브 | 통합 DNA 기술 (IDT) | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymererase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| 폴리브렌 감염 / 형질주입 시약 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III 역전사효소 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | ||
| 4369016 Subcloning용 TOPO TA 클로닝 키트, One Shot TOP10 화학적 적성 대장균 세포 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase(2 U/µ L) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
참고문헌
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense ....
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재인쇄 및 허가
