방법 논문

초파리 날개 디스크에서 이미징 Dpp 릴리스

DOI:

10.3791/60528

⸱

2019년 10월 30일

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

리간드에 노출되는 타이밍은 발달 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 우리는 날개 디스크의 세포에서 Dpp에게 불린 Drosophila 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)의 심상 방출을 보여주는 방법을 보여줍니다.

초록

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변형 성장 인자 베타 (TGF-β) 슈퍼 패밀리는 다세포 유기체에서 성인 구조의 초기 배아 패터닝 및 발달에 필수적입니다. TGF-β 수퍼패밀리는 TGF-β, 골형태유전학단백질(BMPs), 액티빈, 성장 및 분화 인자, 및 노달을 포함한다. 세포에 노출된 리간드의 양이 그 효과에 중요하다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 장거리 농도 그라데이션이 배아 패턴을 설정한다고 생각되었다. 그러나, 최근에는 이 리간드에 노출되는 타이밍이 그들의 다운스트림 전사 결과에 대해서도 중요하다는 것이 분명해졌다. TGF-β 수퍼패밀리 리간드가 생산된 세포로부터 방출될 때까지 는 발달 결과를 가질 수 없다. 최근까지, 이 리간드가 세포로부터 방출된 시기를 결정하는 것은 어려웠다. 여기에서 우리는 날개 프리모르듐 또는 날개 디스크의 세포에서 Decapentaplegic (Dpp)에게 불린 Drosophila BMP의 방출을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 다른 시스템 또는 시그널링 리간드에 대해 수정될 수 있습니다.

서론

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뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)는 성인 구조물의 초기 배아 발생 및 패터닝에 필수적입니다. BMP는 반응하는 세포에 있는 성장 그리고 세포 분화에 필요한 표적 유전자의 전사에 영향을 미치기 위하여 생성되고 분비됩니다. 데카펜타페지(Dpp)는 BMP4의 초파리 상동체로 날개1,2,3,4와같은 배아 및 성인 구조의 발달에 중요하다. 몇몇 단은 1) 날개가 쉽게 평가될 수 있는 일관된 venation 패턴을 가진 2개의 투명한 상피 시트로 구성되기 때문에 성인 플라이 날개를 패터닝에 있는 Dpp의 역할에 집중했습니다; 2) 날개 디스크는 또한 합리적으로 평평하고, 애벌레 의 외부에서 배양 될 수 있으며, 이미지화하고 패턴의 차이를 정량화하기 쉽습니다; 및 3) 날개 패턴 개발은 Dpp에 민감하여 통로내의 작은 섭동이 날개 venation 패턴에 영향을 미치게 한다.

Dpp는 날개디스크5,6,7,8의전방 /후방 경계에 위치한 세포에서 생산됩니다. Dpp는 타입-1 및 타입-2 세린/스레오닌 키나아제 수용체9,10의복합체에 결합한다. Dpp 결합시, 타입-2 수용체는 그 때 Dpp (Mad), Smad 1/5/8 호몰로그에 대하여 어머니를 인산화하는 타입-1 수용체를 인산화합니다. 인산화된 SMAD는 추가적인 코스마드(Medea)를 모집하여 표적 유전자를 조절하는 핵에 진입할 수 있게 하여 증식 또는분화와같은 하류 효과로 이어진다4,11.

최근, Bates Lab은 날개 디스크 내에서 Dpp의 부적절한 방출이 광인화의 감소, 표적 유전자 발현의 감소 및 날개 패터닝 결함12,13으로이어질 수 있음을 보여주었다. 몇몇 이온 채널은 Drosophila 날개 및 관련 구조물의 발달에 영향을 미치는14,15. 이러한 이온 채널은 Dpp 릴리스에도 관여할 수 있습니다. 모르포겐 방출의 메커니즘을 결정할 때, 방출 이벤트를 시각화하는 방법이 중요하다.

아우렐리오 텔레만 박사와 스티븐 코헨 박사는 Dpp의 손실을 구출할 수 있는 Dpp-GFP 융합 단백질을 생성했는데, 이는 Dpp가 생물학적으로 활성상태이며 생물학적으로 관련성이 있는 방식으로 방출된다는 것을의미합니다 16. 여기서는 이 Dpp-GFP를 사용하여 Dpp 릴리스 이벤트를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 융합 단백질은 GFP가 산성 소포에 있을 때 형광이담금질되도록pH에 민감하기 때문에 특히 유용하다. 따라서 GFP로 태그가 지정된 단백질이 소포에서 보다 중립적인 세포외 환경으로 방출되면 GFP 형광 강도가17증가합니다. 우리는 Dpp-GFP가 산성 소포에 상주하는지 결정하기 위해 GFP의 pH 감도를 이용했습니다. 우리는 세포 내 구획 소포 소포 를 중화 암모늄 염화물의 추가 전후 Dpp-GFP를 표현하는 날개 디스크를 이미지18. 우리는 암모늄 염화물의 추가 후에 puncta의 형광에 있는 중요한 증가를 찾아냈습니다, 세포내 Dpp-GFP가 염화암모늄18의추가의 앞에 담금질된다는 것을 건의합니다. 우리는 세포내 Dpp-GFP가 소포와 같은 산성 막 경계 구획에 상주하고, 세포내 구획의 pH를 중화하기 위하여 염화암모늄을 첨가시 풀어 두지 된다는 결론을 내립니다18. 이것은 Dpp-GFP의 살아있는 화상 진찰이 세포외 환경으로 산성 구획에서 풀어 놓이기 때문에 Drosophila 날개 디스크에 있는 Dpp의 역학을 구상하는 유용한 기술합니다.

여기서는 Dpp-GFP를 사용하여 Dpp 릴리스 이벤트를 시각화하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. Dpp-GFP는 UAS-GAL4시스템(19)을사용하여 드로소필라 윙 디스크에서 그 기본 패턴으로 표현될 수 있다. 이것은 Irk 채널이 Dpp 릴리스18에영향을 미치는지 확인하는 데 사용된 방법입니다. 우리는 라이브 이미징 z-스택에 의해 방법을 검증했습니다. 한 개의 포커스 평면에서 획득하면 Dpp-GFP puncta가 타임시리즈에서 초점의 평면 내에서 움직이는 것을 볼 수 없습니다. 우리는 또한 우리가 z 스택에 이미지 경우 Dpp-GFP puncta의 움직임을 볼 수 없습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 본 Dpp-GFP puncta가 세포 내 소포의 움직임보다는 방출 사건이라고 결론을 내립니다. Dpp-GFP의 라이브 이미징 이 방법은 잠재적으로 Dpp 역학에 미치는 영향에 대한 Dpp 릴리스의 다른 putative 수정자를 테스트하는 데 사용되거나 다른 리간드의 역학을 보기 위해 수정될 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 해부를 위해 애벌레를 생성하기 위해 계란을 수집

  1. 크로스 30-40 처녀 여성 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu는 10-15 남성 Sp/CyO-GFP로 비행한다; UAS-Dpp-GFP/ TM6 Tb 후.
    참고: Dpp-GAL4 및 UAS-Dpp-GFP를 포함하는 임의의 2개의 유전자형은 밸런서가 애벌레 단계 동안 적절한 자손의 선택을 허용하는 애벌레 마커가 있는 한 사용될 수 있다.
  2. 계란을 수집하려면, 교차 된 파리를 음식의 신선한 유리병으로 뒤집어 서 유리병에서 제거하기 전에 3-4 시간 동안 누워있게하십시오. 계란 누워를 장려하기 위해, 소량의 물과 혼합 된 과립 효모로 만든 소량의 효모 페이스트를 파리가 바이알에 도입되기 전에 음식의 상단에 첨가 할 수 있습니다. 동일한 세트의 교차 파리를 보관하고 최대 7 일간 계란 수집에 사용할 수 있습니다.
    참고: 모든 표준 초파리 옥수수 가루 음식 조리법은 허용되어야한다. 여기에 헤이즈와 리스20에의해 설명 된 음식 조리법입니다 사용됩니다.
  3. 유충이 세 번째 instar (방황) 단계에 때까지 약 144 시간 동안 25 °C에서 계란 수집 바이알을 유지합니다.
  4. 해부에 적합한 애벌레를 선택하려면(Dpp-GAL4 와 UAS-Dpp-GFP를 모두 발현하는 유충) 먼저 비결핵인 애벌레를 선택한다. 이 애벌레는 짧고 뚱뚱한 보다는 오히려 일반적인 길이일 것입니다.
  5. 비결핵 유충 중에는 CyO-GFP를 발현하는 애벌레와 Dpp-GFP를 발현하는 애벌레가 있을 것이다. 유충을 발현하는 Dpp-GFP를 선택하려면 형광 입체 현미경으로 보도록 하십시오. Dpp-GFP와 CyO-GFP 발현 애벌레는 일부 GFP 형광을 가지지만, 유충을 발현하는 Dpp-GFP는 GFP가 날개 디스크로 제한되고 형광이 CyO-GFP 발현 유충보다 훨씬 덜 밝다는 점에서 구별될 수 있다. 해부를 위해 덜 밝은 애벌레를 선택하십시오.

2. 애벌레 화상 진찰 과 해부를 위한 해결책 준비

  1. 날개 디스크의 라이브 이미징을 위해 수정된 HL3 미디어21(70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2 dyhydrate, 4 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,5 mM 트레할로오스 다이하이드레이트, 115 mM 수크로오스, 5 mM HEPES)을 준비한다. 이 미디어를 사용하면 이미징21을위해 날개 디스크를 살아 있게 할 수 있습니다.
  2. HEPES를 사용하여 pH를 7.1로 조정하고 0.22 μm 필터로 필터를 적용합니다. 이 미디어를 날개 디스크 해부와 라이브 이미징용 마운팅 미디어로 사용합니다.

3. 날개 디스크 장착을위한 슬라이드 준비

  1. 현미경 슬라이드를 가로질러 무색 양면 테이프 두 개를 가로질러 놓고 그 사이에 약 5mm의 공간을 남겨 둡니다. 테이프의 조각은 테이프의 끝이 현미경 슬라이드의 가장자리와 플러시 거짓말 충분히 길어야한다.
  2. 평평한 가장자리(예: 해부 집게 쌍의 핸들 끝)를 사용하여 테이프를 슬라이드에 단단히 눌러 미디어가 그 아래에 스며들지 않도록 합니다.
  3. 25 μL의 수정된 HL3 용지를 두 개의 테이프 사이에 놓습니다. 날개 디스크는 테이프가 커버슬립이 디스크를 파쇄하는 것을 방지할 수 있도록 테이프 조각 사이에 이 매체 방울에 장착됩니다(그림1A).

4. 이미징용 날개 디스크 의 해부 및 장착

  1. 제조된 수정된 HL3매체(26)에서유충을 해부한다.
  2. 부드럽게 두 쌍의 집게를 사용하여 반으로 애벌레를 찢어 유충의 후방 절반을 버립니다.
  3. 한 쌍의 집게로 애벌레의 앞쪽 절반의 중간을 잡고 애벌레가 완전히 반전 될 때까지 입 후크를 다시 애벌레로 밀어 닫힌 집게의 또 다른 쌍을 사용합니다.
  4. 날개 디스크는 애벌레의 양쪽을 아래로 실행 기관의 두 어두운 색깔의 기본 지점에서 날카로운 굴곡을 찾아서 가장 쉽게 찾을 수 있습니다. 날개 디스크는 거꾸로 된 애벌레의 기관에 있는 이 굴곡 의 밑에 직접 놓입니다.
  5. 날개 디스크를 부드럽게 제거하고 준비된 현미경 슬라이드에서 HL3 용지의 25 μL로 옮김. 해부된 날개 디스크에 기관조각이 부착되어 있지 않은지 확인하는 것이 중요합니다.
  6. 날개 파우치의 각측이 현미경 슬라이드에서 위쪽으로 향하도록 날개 디스크를 정렬하고 디스크가 평평하게 놓여 있습니다(그림 1A,B참조).
  7. 날개 디스크와 테이프를 커버슬립으로 덮고 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 밀봉합니다. 폴란드어가 마르면 즉시 아래 이미징 단계로 진행하십시오.

5. 이미징 Dpp 릴리스

  1. 40x 오일 대물렌즈와 488nm 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 장착된 날개 디스크를 이미지화합니다. Dpp-GFP는 Dpp-GFP의 작은 puncta세포의 이 중심 줄무늬에서 풀어 놓인 날개 디스크의 중앙 아래로 GFP 형광의 줄무늬로 나타나야 합니다.
  2. Dpp 릴리스를 시각화하기 위해 2Hz의 속도로 이미지를 수집합니다. 최상의 결과를 얻으려면 이미지 수집 중에 과도하게 표백되지 않도록 Dpp 해제 셀의 선명한 이미지를 얻을 수 있을 만큼 충분히 강한 설정으로 레이저를 설정합니다. 이미지는 다음 Avi 파일로 내보낼 수 있습니다 타임 계열로 수집 할 수 있습니다 (아니 압축, 3 프레임 / s) Dpp 릴리스의 비디오 파일을 얻기 위해.

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결과

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그림 2는 이 프로토콜의 대표적인 실시간 이미징 결과를 보여줍니다. 프로토콜이 성공하면, Dpp-GFP는 Dpp-GFP 영역 내의 비형광 원으로 보이는 핵을 가진 날개 디스크의 중심 아래로 스트라이프로 볼 수있다(그림 2). Dpp-GFP 방출은 나타나고 사라지는 형광 puncta로 보입니다. 우리는 Dpp-GFP 형광이 세포 체에서 그리고 세포 체에서 멀리 나타나는 것을 관찰했습니다. Dpp 시그널링은세포체(22,23)로부터멀리 연장되는 사이톤메라고 불리는 액틴계 필로포디아 유사 구조에 의존한다. 따라서, 이러한 제시된 비디오에서 Dpp-GFP puncta가 Dpp 생산 세포체로부터 멀리 시각화되는 것은 사이톤또는 사이톤메"시냅스"15에서가능성이 높다. 이러한 puncta는 ...

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토론

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Dpp와 같은 BMP는 막 결합 수용체의 복합체를 결합하여 이웃 또는 분명히 먼 세포에서 세포 내 신호의 폭포를 일으킬 때 중요한 영향을 미칩니다. 토마스 콘버그 박사의 연구실은세포가 사이톤15,24,25라고불리는 액틴 기반의 얇은 필라포디아 형 구조를 사용하여 신호를 수신하는 Dpp 신호 접촉 세포를 생성하는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 이러한 맥락에서 발달세포-세포 통신이 뉴런시냅스(26)와유사할 수 있음을 시사한다. 시 냅 스 통신에서, 신경 전달 물질 방출의 역학은 후 세포에 미치는 영향에 중요 한. 마찬가지로, Dpp 릴리스의 역학은 다운스트림 결과12에도중요합니다. 따라서, Dpp 방출에 영향을 미치는 요인이 무엇인지 이해하기 위해 상이한 유전적 배경 및 조건에서 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 프로토콜의 이전 버전에서 작업해 주신 사라 프라드한 박사에게 감사드립니다. 우리는 우리가이 프로토콜을 개발하는 동안 자금 NSF-IOS 1354282 감사드립니다. 우리는 현재 우리의 실험실자금을 지원해 준 NIH-NIDCR RO1DE025311에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
빵 효모레드 스타   
CaCl2 dyhydrateFisher ScientificC79-500
CoverslipsVWR484-457
양면 테이프Scotch
Drosophila Agari Type IIApex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu이 재고는 곧 Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP에서 사용할 수 있습니다. UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu이 재고는 곧 블루밍턴 초파리 재고 센터에서 사용할 수
Dumont 핀셋 #5해부용 세계정밀 기기500233
Sigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
Light Corn SyrupKaro
맥아 추출물Breiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
현미경 슬라이드Sigma AldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
매니큐어전자 현미경 과학72180
프로피온산VWRU330-09
콩ADM 특수 성분062-100
자피셔 사이언티픽S5-3
자당피셔S512
TegoseptGenesee Scientific20-259
트레할로스 이수화물Chem-Impex 인터내셔널, Inc.00766
노란 옥수수 가루퀘이커
Zeiss LSM 780 컨포칼 현미경라이브 이미징용Zeiss
현미경 Zeiss SteREO Discovery.V8 현미경부용Zeiss
있습니다. HEPES 겸자가루 당 해 현미경

참고문헌

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  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

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BMPGFP

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