이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.
단백질의 번역 후 변형으로 유비퀴틴화는 진핵 세포의 항상성에 중요한 규제 역할을합니다. 폴리유비퀴틴 사슬의 길이 및 토폴로지에 따라 표적 단백질에 76개의 아미노산 유비퀴틴 개질제의 공유 부착은 단백질 분해에서 변형된 단백질의 국소화 및/또는 활성에 이르는 다양한 결과를 초래할 수 있다. 세 가지 효소는 유비퀴틴 화 과정을 순차적으로 촉매: E1 유비퀴틴 활성화 효소, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소, E3 유비퀴틴 리가제. E3 유비퀴틴 리가제는 기질 특이성을 결정하고, 따라서, 매우 흥미로운 연구 대상을 나타낸다. 여기에서 우리는 링형 E3 유비퀴틴 리가제의 효소 활성 및 기능 사이의 관계를 연구하는 포괄적인 접근법을 제시한다. 이 4단계 프로토콜은 보존된 RING 도메인을 표적으로 하는 부위 지향 돌연변이 발생을 통해 E3 리가제 결핍 돌연변이를 생성하는 방법을 1) 기술한다; 2-3) 시험관 내 및 질라에서 모두 유비퀴틴화 활성을 검사하는 방법; 4) 이러한 생화학 적 분석을 시험 된 단백질의 생물학적 유의에 연결하는 방법. E3 리가제 결핍 돌연변이체의 생성은 여전히 그것의 기질과 상호작용하지만 더 이상 분해를 위해 그것을 유비퀴틴화하지 않는 것은 생체 내에서 효소 기질 상호작용의 시험을 용이하게 한다. 더욱이, 보존된 RING 도메인에 있는 돌연변이는 RNA 간섭 접근에 대한 대안적인 접근으로 기능적인 녹아웃 연구 결과에서 이용될 수 있는 지배적인 음성 표현형을 수시로 부여합니다. 우리의 방법은 기생충을 승진시키기 위하여 식물 세포에 있는 호스트 유비퀴틴화 시스템을 납치하는 식물 기생 선충 이펙터 RHA1B의 생물학 역할을 조사하기 위하여 낙관되었습니다. 생체 내 발현 시스템의 약간의 변형으로, 이 프로토콜은 기원에 관계없이 임의의 RING 형 E3 리가제의 분석에 적용될 수 있다.
E3 유비퀴틴 리가제의 대다수는링(Really Interesting New Gene)형 단백질에 속한다. 링 핑거 도메인은 원래 프리몬트 외. 도 1및 단백질-단백질 상호작용을 중재하는 도메인으로서 기능적으로기술된다. 정식 링 핑거는 다른 아미노산 잔기(X), C-X 2-C-X9-39-C-X1-3-3-H-X2-C-X-C-4-C-4-C-C-4-C-C-48에의해 특별히 이격된 8개의 보존된 Cys(C)와 그의 (H)의 합의 서열로 정의된 특별한 유형의 아연 조정 도메인입니다. 2개의 Zn2+ 이온은 C1/C2 및 C/H5/C6이온을 조정하는 독특한 “크로스 브레이스” 토폴로지와 코어 C 및 H 잔류물로 안정화되는 반면 C3/H4 및 C7/C8은 두 번째(그림1A)3,4를결합합니다. 제5 Zn2+조정 사이트에서 C 또는 H의 존재에 따라, 링 핑거 단백질의 두 개의 표준 하위 클래스가 정의되었다: C3HC4 및 C3H2C3 (RING-HC 및 RING-H2, 각각). E3 유비퀴틴 리가제의 RING 도메인은 E2 컨쥬게이팅 효소와 기질 사이의 상호작용을 중재하기 때문에, 이들 필수 C 및 H 잔기의 돌연변이는 리가제 활성을 방해하는 것으로 나타났다5. 링 E3 리가제의 5개의 덜 일반적인 하위 클래스(RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T 및 RING-G)가추가로설명되었습니다. 링형 E3 유비퀴틴 리가스는 간단하고 복잡한 E3 효소로 더 세분화될 수 있다. 간단한 단일 소유닛 링 E3 리가제는 기판 인식 사이트 및 E2-결합 RING 도메인을 모두 포함한다. 대조적으로, 멀티 서브유닛 링형 E3 컴플렉스는 E3 단지에 E2-유비퀴틴 중간체의 결합을 모집하는 기판 또는 중재자 중 하나이다. 자기 유비퀴틴화를 위한 1차 유비퀴틴 부착 부위역할을 하는 링 도메인 Lys sidue(들)는 또한 E3 리가제 활성에 대해 중요할 수 있다.
모든 링 함유 단백질이 E3 리가제로서 기능하는 것은 아닙니다. 따라서, RING 핑거 도메인의 생물정보학적 예측 및 E2 의존단백질 유비퀴틴화에 대한 용량은 생화학적으로 검증되고 시험된 단백질의 생물학적 역할에 연결되어야 한다. 여기서, 우리는 사이트 지시돌연변이 유발 접근법을 통해 시험관 내 및 질라에서 RING형 E3 유비퀴틴 리가제의 효소 활성을 검출하고 기능적으로 특성화하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 파이프라인의 대표적인 결과는 링형 E3 리가제 RHA1B에 대해 도시된다. RHA1B는 식물 면역을 억제하고 식물 뿌리 세포의 형태를 조작하기 위해 식물 기생 낭종 선충 글로보데라 팔리다에 의해 생성 된 이펙터 단백질이다. 병원체/기생충 침입으로부터 자신을 보호하기 위해, 식물은 병원체 또는 기생충의 존재를 감지하는 뉴클레오티드 결합 도메인 및 류신이 풍부한 반복 (NB-LRR) 유형 면역 수용체를 진화시켰으며, 결과적으로 감염 부위에서 발생하는 신속하고 국소화된 세포 사멸의 한 형태인 과민반응(HR)을 개발하여 병원균의 식민지화를 체포한다. 이러한 면역 수용체 중 하나는 G. pallida (필드 인구 D383 및 D372)의 일부 분리에 저항을 부여하는 감자 Gpa2 단백질7.
제시된 프로토콜을 사용하여, RHA1B는 유비퀴틴화 및 분해를 위한 식물 Gpa2 면역 수용체를 표적으로 하여 E3 의존적 방식으로 식물 면역 신호를 방해한다는 것을 최근 발견되었다8.
RING 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 생화학적 및 기계적 기초를 설명하는 것은 개발, 스트레스 신호 및 항상성의 유지 보수에서 생물학적 중요성에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수 있습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 시험관 내 및 질라 기능 연구에서 돌연변이 유발 접근법을 결합한다. 사이트 직접 돌연변이 발생을 통해 RING 도메인의 보존 된 잔류물에서 단일 아미노산 치환을 도입함으로써, 생성된 E3 결핍 돌연변이는 야생 형 단백질과 병행하여 효소 활성을 기능성과 연결하여 테스트 할 수 있습니다.
RING 도메인, 특히 보존된 Cys 및 그분의 잔류물을 적절히 식별하는 것이 중요합니다. PROSITE와 같은 온라인 도구를 사용하여10. E2 효소를 모집하는 RING 도메인을 불안정하게 하기 위해 Cys는 일반적으로 아연 협응에 사용되는 이황화물 결합을 생성할 수 없는 가장 가까운 구조적 대체품인 Ser로 대체됩니다. Lorick et al. 그 중요한 Cys 잔기 중 어느 하나에 있는 돌연변이가 단일 소단위 RING 형 E3 ligases5의유비퀴틴화 활성을 폐지할 것이라는 것을 보여주었다. 일부 Cys 잔기는 링형 단백질을 함유하는 다중 유닛 E3 리가아제 복합체에도 중요하지만, 그 유분질 복합체의 다각적이고 역동적인 3차원 구조로 인해 RING 형 단백질의 다른 역할, 다중 Unit E3 ligase에서 RING 도메인에서 보존된 잔류물의 단일 치환은 1리그아제 생성에 성공하지못했다.
사이트 지시 돌연변이 발생을 위해, 우리는 더 작은 플라스미드 벡터및 더 낮은 증폭 주기를 사용하여 일반적으로 돌연변이 발생을 위한 더 높은 효율성을 산출한다는 것을 것을을 발견했습니다. Pfu 효소는 다른 고충실도 및 높은 처리율 DNA 폴리머라제로 대체될 수 있다. 더욱이, 관심 있는 유전자가 희소한 코돈, 또 다른 대장균 얼룩, 로제타를 포함하는 경우, 재조합 단백질의 높은 수율을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 또한 IPTG 유도에 대한 인큐베이션 시간과 온도를 더욱 최적화할 수 있습니다. 낮은 온도는 특정 단백질의 표현에 유리할 지도 모르다 대장균 분열 비율을 감소시다. IPTG의 높은 농도 단백질 발현을 향상 시킬 수 있지만, 그것은 또한 억제 대장균 분열 프로세스 및 권장 하지 않습니다.
단일 소단위 RING 타입 E3 ligases는 기질에 근접하여 E2-Ub 중간체를 위치시키는 분자 스캐폴드로서 기능할 뿐만 아니라 동종 E2s의 유비퀴틴 전달 활성을 자극합니다. 더욱이, E2/E3 조합이 변형된 기판의 운명을 결정하는 폴리유비퀴틴 사슬의 길이 및 연계에 중요하다는 점을 감안할 때, RING 형 E3s의 모든 고려사항은 그들의 효소 파트너인 E2s12를포함해야 한다. 도 3B에도시된 바와 같이, 시험된 모든 E2가 RHA1B 리가제와 호환되는 것은 아니다. 따라서, 시험관 내 유비퀴틴화 분석법은 거짓 부정적인 결과를 피하기 위하여 다른 E2 클래스를 나타내는 다중 E2 효소와 병렬로 수행되어야 한다.
여기서 제시된 시험된 RING 형 단백질의 자가 유비퀴틴화 능력을 검출하는 체외 효소 분석입니다. 그러나, 작은 수정으로, 이 프로토콜은 기판의 시험관 내 유비퀴틴화를 검출하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 이를 위해, 단계 2.15로부터의 시험관내 유비퀴틴화 혼합물은 잠재적인 E3 리가아제 기질(500 ng)의 재조합 단백질로 보충되어야 한다. 30°C에서 2시간 배양한 후, 유비퀴틴화 단백질은 4°C에서 2시간 동안 교반하여 항HA 친화성 매트릭스(HA-Ub가 사용되는 경우 또는 FLAG-Ub가 사용되는 경우 항-FLAG 친화 매트릭스)의 15 μL을 사용하여 포획되어야 한다. 차가운 Ub 워시 버퍼(20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% 트웬20, 1x PMSF)로 구슬을 4회 세척한 후, 완충액의 40 μL을 제외한 모든 것을 버리고 2.16단계로 이동한다. 에피토프 태그 Ub 및 기질에 특이적인 항체에 의해 검출된 유비퀴틴화 신호는 각각 기질 단백질의 분자량으로부터 방출되어 기질/효소 특이성을 확인한다.
더욱이, 생체 내에서 E3 리가제 기질의 식별은 일반적으로 과도 효소 기질 상호 작용 및 유비퀴틴화 표적 단백질의 급속한 분해로 인한 다중 도전과 연관된다. E3 리가제 결핍 돌연변이를 사용하여, 이는 여전히 그것의 표적과 상호 작용하지만 더 이상 유비퀴틴화13,항상 충분히 26S proteasome 기능을 방해하지 않는 proteasomal 억제제 MG132의 추가에 매우 유용한 대안이다.
RING 형 E3 리가제의 일반적인 특징은 호모 및 / 또는 이종으로 형성되고 기능하는 경향이있습니다. 흥미롭게도, RING 도메인의 보존된 잔류물에서의 치환은 일반적으로 돌연변이된 링형 E3 리가제블록의 토착 야생형단백질(13)의효소 활성을 차단하는 지배적인 음성 표현형과 연관된다. 따라서, 질라에서 RING 돌연변이체의 과발현은 E3 리가제 유전자를 노크하는 대안적인 접근법일 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리의 일은 USDA 국립 식량 농업 연구소, USDA-NIFA 농장 법안, 노스 웨스트 포테이토의 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 보조금 (2017-67014-26197; 2017-67014-26591)의 재정 지원에 의해 가능하게되었다 컨소시엄, ISDA 특수 작물.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |